Червоний салат

Реферат: Пучковий салат виду Lactuca sativa має червоне листя впродовж пучка, включаючи серцевину. UA 68619 U (12) UA 68619 U UA 68619 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Дана корисна модель має відношення до рослини червоного салату, пучка салату, який може бути отриманий від цієї рослини і генного комплексу, який відповідальний за червоний колір салату. Стилі життя змінюються і попит від ресторанів і обслуговуючих фірм щодо барвистого і цікавого гарніру і навіть від домогосподарки щодо готового до вживання салату продовжує підвищуватися. В результаті, компанії по вирощуванню шукають види з помітним кольором, кращим смаком і широкою різноманітністю текстури. Ринок салату може бути розбитий на три групи, а саме: повні цілі пучки, попередньо зрізані цілі пучки і маленьке листя. На даний час привабливий червоний колір в сумішах попередньо зрізаного салату часто забезпечується тепер доступним "червоним" салатом (Lactuca sativa) або червоним цикорієм (Cichorium intybus), червоним качанним салатом або червоним черешком. "Червоний" салат, який був відомий до сьогодні, дійсно не має всюди червоного листя. Зокрема, типи утворюваних пучків є червоними тільки уздовж листових країв або зацятковані червоним кольором. Вони ніколи не є повністю червоними в серцевині. Це викликається тим фактом, що червоний колір експресується тільки в тих частинах пучка, що піддаються дії денного світла, особливо ультрафіолетових променів. Тому основна частина листя, так званих, "червоних" салатів є зеленою і їх червоний колір ледве сприяє ефекту червоного забарвлення попередньо порізаної суміші салату. Часто перехідна стадія між червоною частиною і зеленою частиною листа є забарвленою у коричневий колір. Цей коричневий колір вважається візуально непривабливим. Червоно-цяткові салати асоціюються з захворюваннями рослин або плямами крові. На даний час селекціонери проводять селекційні дослідження, спрямовані проти коричневого кольору, а також проти цяткованого червоного забарвлення. Крім того, навіть виявлено, що цятковані або коричневі листя салату часто відкидаються як в пакувальній промисловості, так і споживачем. Недоліком використання листя з інших овочів, відмінних від салату, є те, що різний смак цих інших овочів часто кваліфікується як небажаний. Червоний цикорій, наприклад, Cichorium intybus має гіркий смак. Текстура червоного качанного салату повністю відмінна від дуже м'якої текстури салату. Синтез антоціаніну в салаті викликається ультрафіолетовим випромінюванням (див., наприклад Voipio & Autio, 1995, Responses of red-leaved lettuce to light intensity, UV-A radiation and root zone temperature (реакція червоного салату щодо інтенсивності світла, УФ-А випромінювання і температуру кореневої зони) в Acta Horticulturae 399. Greenhouse environmental control and automation (контроль середовища теплиці і автоматизація). Вид. BJ Bailey, T Takakura. Kyoto, Japan, p 183-187; Benoit, і інші, 1998, Effect of a photoselective greenhouse film on a few vegetable crops in the Belgian North Sea climate (ефект фотоселективного покриття теплиці на декількох овочевих культурах в Бельгійському північному морському кліматі): 14 th International congress on plastics in agriculture, Тель-Авів, Ізраїль, Березнь 1997. Laser Pages Publishing, Jerusalem, Israel, p. 81-92; Krizek і інші, 1998, Inhibitory effects of ambient levels of solar UV-A and UV-B radiation on growth of cv. New Red Fire lettuce (інгібіторні ефекти рівнів навколишнього сонячного і УФ-А та УФ-В випромінювання на ріст культурного сорту салату Red Fire. Physiologia Plantarum 103(1), p. 1-7; Kleinhenz і інші, 2003, Variety, shading, and growth stage effects on pigment concentrations in lettuce grown under contrasting temperature regimens (вплив виду, затінення і стадії росту на концентрації пігменту в салаті, вирощеному при контрастних температурних режимах). Hortechnology 13 (4), р. 677683.). Прояв червоного кольору в багатьох видах рослин залежить від продукування антоціаніну. Багато різних різновидів салату часто групують на три типи. Найзагальніший - пучковий салат, серед якого кучерявий пучок (або качанний салат) і маслянистий салат. Салат-ромен (або пухкий салат) утворює вільно-прямостоячий пучок. Типи "листяних" салатів - непучкові і вільно-листяні. У пучкових типах салатів серцевина пучка є більш або менш закритою по довжині і туди не може потрапити світло. Тому в закритих пучках, таких як, наприклад, салат качанний і маслянистий салат або салат-ромен, який має вільно закритий пучок, утворення антоціаніну є неможливим. Суміжною проблемою є відсутність червоного забарвлення червоного салату, вирощеного в теплицях, пластикових галереях або в закритих контейнерах. Завдяки відсутності ультрафіолетового випромінювання, яке відбивається склом або пластиковим покриттям, або якого бракує в асиміляції штучного спектра світла, експресія антоціаніну набагато менша ніж при зовнішніх умовах. Це зменшує можливості одержувати червоний салат в умовах приміщень 1 UA 68619 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 і можливість одержувати червоний салат, захищений від несприятливих погодних умов, як, наприклад, холод, тепло і всі види опадів. Дана корисна модель передбачає одержання червоного салату, що має червоне листя по всій довжині пучка, включаючи серцевину. Серцевинне листя червоного салату корисної моделі є в основному цілком червоним, що означає, що воно містить унікально високе співвідношення антоціанін/хлорофіл. Це є несподіваним, оскільки світло, особливо ультрафіолетове світло, яке вважається необхідним для синтезу антоціаніну, не може проникнути в серцевину пучка. Це демонструє, що в салаті згідно з корисною моделлю є світло-незалежний механізм, відповідальний за продукування антоціаніну. Ця незалежність від світла також забезпечує культивування червоного салату, пучкового або непучкового під склом або пластиком, або в закритих контейнерах. Пізніше використовували штучне освітлення, асиміляція якого зазвичай надає проблеми з розвитком червоного кольору. Це викликається тим, що УФ хвилі, довжиною 280-400 нм, які є зазвичай суттєвими для індукції синтезу антоціану, є більш або менш відсутніми в спектрі світла. Під склом або пластиком подібний дефіцит ультрафіолетового випромінювання зазвичай викликається сильним затриманням ультрафіолету покриттям. Проте, внаслідок УФ-незалежної експресії антоціаніну, червоний салат згідно з корисною моделлю є прийнятним для теплиці, пластикової забудови і закритого контейнерного культивування. Це відбувається завдяки світлонезалежному механізму даної корисної моделі, який також буде вказаний як "УФнезалежна експресія антоціаніну", або "УФ-незалежне червоне забарвлення". У конкретному втіленні корисної моделі співвідношення спектральної поглинальної здатності А523/А665 між антоціаніном і хлорофілом знаходиться між 4 і 50, переважно між 9 і 27. Чи є експресія антоціаніну в даній корисній моделі цілком незалежною від УФвипромінювання або вона викликається рівнями УФ-випромінювання, нижчими ніж ті, що необхідні для нормальної експресії антоціаніну в звичайних пучках червоного салату, повністю ще не відомо. Проте, для практичної повноцінності корисної моделі ця різниця не має значення. Хоча корисна модель особливо корисна для пучкових типів салату, світлонезалежне червоне забарвлення згідно з корисною моделлю може також використовуватися в інших типах салату, як наприклад, листовий салат, і в утворенні молодих листочків, а саме, в одержанні молодих рослин салату для збору невеликого врожаю незрілого листя. Походження червоного салату згідно з корисною моделлю надається в Прикладі 1. Корисна модель має відношення до всього потомства оригінальних батьківських рослин, які мають червоні листя серцевини пучка і які відповідають одній або більше іншим вимогам корисної моделі, як, наприклад, співвідношення між хлорофілом і антоціаніном серцевинного листя. Крім того, непучкові рослини, рослини з вільним листям або молодий салат, які мають УФнезалежне червоне забарвлення згідно з корисною моделлю, також розглядаються як потомство повністю червоних пучків салату і тому є частиною цієї корисної моделі. Відбір саджанців салату, які вже є або можуть приводити до урожаю салату згідно з корисною моделлю може бути заснований на візуальному відбору молодих пагонів з червоним забарвленням (стадія 1). Вирощування їх під склом або пластиком може суттєво відрізнятись між УФ-залежною експресією антоціаніну, тобто слабким червоним забарвленням, і УФнезалежною експресією антоціаніну, тобто відносно сильним червоним забарвленням. Ці останні саджанці висаджують і вирощують до пучкового стану. Потім здійснюють візуальний відбір рослини з червоним серцевинним листям шляхом зрізування верхівки кожної рослини. Червоні пучки потім відбирають, щоб одержати насіння. Гібриди вибирають, щоб збільшити рівень червоного забарвлення і/або, щоб отримати необхідний рівень пучка зрілої рослини. В даному контексті салат визначений як пучковий, коли мається "відкритий пучок" або "закритий пучок", згідно з нормативами UPOV (Union for the Protection of New Varieties of Plants Міжнародне Товариство для захисту нових сортів рослин) для характеристик "утворення пучків" ("TG/13/9. Lettuce (Lactuca sativa L.) Guidelines for the conduct of tests for distinctness, uniformity and stability. " International Union for the Protection of New Varieties of Plants. Geneva. 2004 Нормативи з проведення тестів на відмінність, однорідність і стабільність. Міжнародне Товариство для захисту нових сортів рослин. Женева. 2004). Серцевини салату даної корисної моделі мають співвідношення спектральної поглинальної здатності А523/А665 між хлорофілом і антоціаніном, яке переважно вище ніж 9, переважніше 13, або вище. У звичайному червоному салаті ніколи не знаходили, щоб це співвідношення було вище ніж 3. Концентрації хлорофілу і антоціаніну, використовувані у визначенні співвідношення 2 UA 68619 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 корисної моделі, визначаються за допомогою спектрофотометрії. Одержання зразка і аналіз представлений в Прикладі 2. Має бути відзначеним, що рівні антоціаніну такі високі, як в серцевинному листі даної корисної моделі, можуть бути знайдені в інших видах салату, які є непучковими. Деякими прикладами таких непучкових видів є 40-0203103-В (Knerr LD, 2005. Lettuce cultivar 40-0203103В (Культурний сорт салату 40-0203103-В). Заявка на патент США 2005/0144672 А1), Galactic, New Red Fire, Rolina (Kleinhenz і інші, 2003. Variety, shading and growth stage effects on pigment concentrations in lettuce grown under contrasting temperature regimens (Сорт, затінення і вплив стадії росту на концентрації пігменту у салаті, вирощеному при контрастних температурних режимах). Horttechnology 13(4) p. 677-683), Red Salad Bowl, and Sesam - Червоний салат і сезам (Voipio I. i Autio J., 1995. Responses of red-leaved lettuce to light intensity, UV-A radiation and root zone temperature (Реакція червоного салату на інтенсивність світла, УФ-А випромінювання і температуру кореневої зони). Acta horticulturae 399. p. 183-187). Проте, ці види мають серцевинне листя з дуже високими рівнями хлорофілу в порівнянні з серцевинним листям згідно з даною корисною моделлю як результат високої експозиції світлом, оскільки є непучковими. З іншого боку, пучкові види можуть бути з так само низькими рівнями хлорофілу у серцевинному листі, як в серцевинному листі салату даної корисної моделі. Проте, серцевинне листя цих пучкових видів не показує високі рівні антоціаніну в порівнянні з серцевинним листям салату даної корисної моделі. Завдяки низькій світловій експозиції серцевинного листя синтез антоціаніну зазвичай індукований недостатньо. У даній корисній моделі продукування антоціаніну є УФ-незалежним. Це пояснює, чому співвідношення антоціанін/хлорофіл в даній корисній моделі є на безпрецедентно високому рівні. Ця нова форма червоного забарвлення, що є УФ-незалежною, знайдена і розвивинена в пучкових типах салату і відрізняється від червоного забарвлення, що представлено в попередньому рівні техніки. Проте, корисна модель також має відношення до непучкових типів салату, як, наприклад, вільно-листові або молоді листя салату або салату, що вирощується в теплицях або під пластиком, де кількість ультрафіолету нижча, що є особливістю "УФнезалежного червоного забарвлення" корисної моделі. Червоне забарвлення серцевинного листя було також оцінене за RHS діаграмою кольору (The Royal Horticultural Society, London, UK). Колір серцевинної листової пластини, особливо на верхівці листа, згідно з корисною моделлю був оцінений як 183А, 184А або 187В, все в сіропурпуровій групі. Колір решти листової пластини був оцінений як 180В, 180С, 180D, або 181С, все в сіро-червоній групі. Також можливо оцінити червоне забарвлення і експресію антоціаніну у рослин, вирощених під склом або пластиком, тобто при умовах із зменшеними рівнями ультрафіолетового випромінювання, порівняно зі світлом в зовнішніх умовах. Також рослини даної корисної моделі можуть виявити вищі рівні антоціаніну і темніший червоний колір, ніж звичайний червоний салат. Особливо, новоявлене листя рослин даної корисної моделі значно більш червоне, ніж новоявлене листя звичайного червоного салату. Генетичний аналіз червоного салату виконували, як описано в Прикладі 2. Було знайдено, що принаймні три гени залучені до червоного забарвлення серцевини пучка. Дана корисна модель, такими чином, має відношення до пучків салату, які здатні до експресії антоціаніну і мають, крім того, принаймні три гени, які залучені до червоного забарвлення серцевини пучка. Переважно, рослина корисної моделі охоплює повний генний комплекс, описаний в Прикладі 2. Можливо оцінити наявні локуси, залучені в червоне забарвлення згідно з даною корисною моделлю безпосередньо зв'язаними ДНК-маркерами, подібно до AFLP, RFLP, RAPD, SCAR, CAPS, SSR, або SNP. Наприклад, маркерно-штриховий аналіз зв'язування в популяції, згаданій вище, і його результат можуть забезпечити такі безпосередньо зв'язані ДНК-маркери. Наявність в салаті подібної генетичної конституції червоного забарвлення внутрішнього листя, як в даній корисній моделі, тобто, встановлення, чи є салат рослиною відповідно до корисної моделі, може бути легко оцінене порівнянням фенотипу такої потенційної рослини корисної моделі з фенотипом відомої рослини даної корисної моделі. Фенотип може бути встановлений, наприклад, за червоним забарвленням внутрішнього листя, співвідношенням антоціанін/хлорофіл серцевинного листя і/або за червоним забарвленням рослин, вирощених під склом або пластиком. Інший спосіб оцінки схожості генетичної конституції між потенційною рослиною корисної моделі і відомою рослиною є порівняння генотипу маркера потенційної рослини з генотипом маркера відомої рослини даної корисної моделі. Генотип маркера визначається набором маркерів на основі ДНК, подібно до AFLP, RFLP, RAPD, SCAR, CAPS, SSR або SNP, які 3 UA 68619 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 безпосередньо зв'язуються з локусами, що залучені в експресію червоного кольору даної корисної моделі. Іншим способом встановлення схожості генетичної конституції є порівняння генотипу потенційної рослини корисної моделі з генотипом відомої рослини даної корисної моделі. Це порівняння генотипу робиться на F2-популяції, отриманій самозаплідненням F1-рослини від гібриду між потенційною рослиною і відомою рослиною даної корисної моделі. F2-популяція може бути досліджена на відсутність сегрегації по фенотипу, тобто за червоним забарвленням внутрішнього листя. У всіх порівняннях, фенотипи можуть також бути оцінені, наприклад, за співвідношенням антоціанін/хлорофіл серцевинного листя або за червоним забарвленням рослин, вирощених під склом або пластиком. Насіння червоного салату згідно з корисною моделлю було внесене в депозитарій з NCIMB 18 липня 2005 року під вхідними номерами NCIMB 41337, NCIMB 41338 і NCIMB 41339. Корисна модель також має відношення до потомства цього насіння, а також до рослин, які отримали генетичну конституцію або генний комплекс рослин корисної моделі, який приводить до червоного забарвлення згідно з корисною моделлю, шляхом гібридизації або за допомогою методик молекулярної біології. Корисна модель також має відношення до потомства цих рослин, які зберегли або придбали характерне червоне забарвлення корисної моделі. Щоб перенести гени, які відповідальні за червоний колір, до іншої рослини, можна використовувати запліднення шляхом зворотного схрещування. Для цього бажаний гомозиготний культурний сорт рослини або інбред- є рекурентною батьківською рослиною. Джерело характеристики, яку переносять, назване батьківською донорською рослиною. Очікується, що одержана рослина має властивості рекурентної батьківської рослини (наприклад, культурний сорт рослини) і бажана характеристика переноситься від батьківської донорської рослини. Після початкового схрещування індивідууми, що мають фенотип батьківської донорської рослини (червоне забарвлення серцевинного листя), відбираються і повторно схрещуються (зворотне схрещування) з рекурентною батьківською рослиною. Очікується, що одержана рослина має властивості рекурентної батьківської рослини (наприклад, культурний сорт рослини) і бажана характеристика переноситься від батьківської донорської рослини. У випадку, якщо спадкування червоного забарвлення складніше, ніж спадкування іншої бажаної характеристики або комбінації характеристик, батьківська рослина з червоним кольором серцевинного листя може використовуватися як рекурентна батьківська рослина, а батьківська рослина з іншою бажаною характеристикою або комбінацією характеристик може використовуватися як батьківська донорська рослина. Описи інших способів розмноження, які зазвичай використовуються для різних характеристик і урожаїв, можуть бути знайдені в одному з декількох довідників (наприклад, "Principles of Plant Breeding" (Принципи вирощування рослин), John Wiley and Son, стор. 115-161, 1960; Allard, 1960; Simmonds, 1979; Sneep і інші, 1979; Fehr, 1987). Дана корисна модель додатково ілюструється наступними прикладами, які надані тільки для цілей ілюстрації і не мають наміру обмежувати корисну модель будь-яким чином. Фігура 1 демонструє розповсюдження внутрішньолінійної сегрегації червоного забарвлення зовнішнього і внутрішнього листя для популяції 212 F3-лінії, отриманої від схрещування '99Р.30637' х cv. "Sharp Shooter". Три класифікації червоного забарвлення були застосовані на популяції: "червоний за межами", тобто внутрішньолінійна частота рослин з червоним зовнішнім листям, незалежно від кольору внутрішнього листа; "червоне зовнішнє та червоне внутрішнє", тобто внутрішньолінійна частота рослин з червоним зовнішнім і червоним внутрішнім листям, ''червоне внутрішнє/червоне зовнішнє", тобто частота рослин з червоним внутрішнім листям в межах загальної лінії рослин з червоним зовнішнім листям. 0=Спостережувані; Е=очікувані, згідно з генетичною моделлю. Фігура 2 показує генетичну модель експресії антоціаніну на основі сегрегації в схрещуванні '99Р.30637' х cv. "Sharp Shooter". Фігура 3а показує рослину корисної моделі. Ця молода рослина є рослиною з насіння від лінії 03Р82421, яка була отримана після трьох поколінь самозапліднення 25 рослин 99Р38154. Фігури 3b, 3с і 3d показують молоді батьківські рослини Pierrot, Pippo і Gringo, відповідно. Фігури 3е і 3f показують порівняння видів молодих рослин Apache і Bijou відповідно. Всі ці молоді рослини росли на торф'яних блоках в камері для вирощування з 14 год. світлового режиму при 16 °C і 10 год. темнового при 12 C. Світло генерувалося Philips TLD 36 W 840 Reflex трубками, з 1 трубкою на 0,24 квадратних метри, на відстані 0,6 м вище рослин. Фігура 4 показує молодий лист рослини корисної моделі, позначений як ''новий" у порівнянні з молодим листям від комерційних видів Pippo, Pierrot і Gringo. Ці молоді рослини вирощували на торф'яних блоках в камері для вирощування з 14 год. світлового режиму при 16 °C і 10 год. 4 UA 68619 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 темнового при 12 °C. Світло генерувалося Philips TLD 36 W 840 Reflex трубками, з 1 трубкою на 0,24 квадратних метри, на відстані 0,6 м вище рослин. Фігури 5-8 показують порівняння між рослиною корисної моделі (01Р80146) і комерційним видом Darkland (позначений як '99R10044'; фігури 5a-5d), Pierrot (позначений як '95G2237'; фігури 6а-6d), Roxy (позначений як '99R10283'; фігури 7a-7d) і Sierra (позначений як '95G1986'; фігури 8a-8d), відповідно. Фігур а (5а, 6а, 7а, 8а) - повністю зібраний врожай пучків. Фігур b (5b, 6b, 7b, 8b) показують серцевину без зовнішнього листя. Фігур с (5с, 6с, 7с, 8с) показують подовжню секцію серцевини. Фігури d (5d, 6d, 7d, 8d) показують зрізане серцевинне листя. Салат згідно з корисною моделлю є повністю червоним у серцевині пучка, тоді як інші пучки салату - ні. Всі рослини вирощувалися в Aramon, Франція в 2002: сіялися 10 січня 2002, пересаджувалися в конфіденційне відкрите поле 15 лютого 2002, урожай зібраний 25 квітня 2002. Приклад 1 Генеалогія червоного салату згідно з корисною моделлю Салат корисної моделі був отриманий згідно з наступною генеалогією: у 1986 р. було зроблене схрещування між рослиною cv. Pippo (Rijk Zwaan; червоне забарвлення) і рослиною cv. Blonde Maraichere (Caillard; зелене забарвлення). У 1988 р. потомство червоних рослин від цього схрещування використовувалося як батьківське в схрещуванні із рослиною cv. Gringo (Rijk Zwaan; червоне забарвлення). У тому ж році схрещування було зроблене між рослиною cv. Pierrot (Rij k Zwaan; червоне забарвлення) і рослиною cv. Roxette (Rijk Zwaan; зелене забарвлення). У 1989 р. потомство червоних рослин від цього схрещування використовувалося як батьківське в схрещуванні із рослиною cv. Krizet (Rijk Zwaan; зелене забарвлення). У 1992 р. червоне потомство рослини F3 було відібране від вищезгаданого схрещування Krizet x (Pierrot x Roxette), і використовувалося як материнське в схрещуванні із батьківською рослиною, яка була відібрана від червоного потомства рослини від вищезгаданого схрещування Gringo x (Pippo x Blond Maraichere). Червона рослина F4 від цього новоотриманого в 1992 р. схрещування була відібрана в 1995 р. і використовувалася як материнська в схрещуванні із рослиною cv. Roxette (Rijk Zwaan; зелене забарвлення). Відбір за типом, пучком, і кольором, який виконувався в F2-, F3-, і F4-поколіннях від цього схрещування, приводив до червоної F4-рослини (98Р.31582) в 1998 р. Виявляється, що F5-лінія сегрегує за кольором (червоний проти зеленого), але селекція в наступному поколінні приводила до трьох пучків F5-рослин з повністю червоним серцевинним листям (99Р.38152; 99Р.38154; 99Р.30637), які були розмножені за роки згодом. Потомство не показало ніяких сегрегуючих зелених пучків і насіння було внесено в депозитарій під номерами 02R.2413, 01R.1439, 02R.2418. Ці Р5-рослини і їх потомство служили батьківським джерелом для подальшого розмноження салату із світлонезалежним червоним забарвленням. На закінчення можна сказати, що жодна з використовуваних батьківських видів рослин, тобто Pippo, Blonde Maraichere, Gringo, Pierrot, Roxette і Krizet, не мають характерного червоного листя серцевини пучка. Корисна модель охоплює унікальну і нову комбінацію генів від цих червоних і зелених батьківських видів, який забезпечує повністю червоне листя серцевини пучка. Приклад 2 Генетичний аналіз червоного салату корисної моделі В даному контексті локус (множина: локуси) визначається як специфічне місце на хромосомі, де розміщений ген (Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki, DT, Lewontin RC, Gelbart, WM. "An introduction to genetic analysis" (введення в генетичний аналіз), 6 вид. 1996. WH Freeman and Company, New York). Число локусів, відповідальних за червоне забарвлення в наданій рослині, може встановити генетичний аналіз потомства схрещування цієї рослини з зеленим забарвленням cv "Sharp Shooter". Генетичний аналіз червоного салату корисної моделі виконувався, як вказано нижче: схрещування було зроблено між потомством рослини від Р5-рослини № 99Р.30637, тобто рослиною даної корисної моделі, і неблискучим зеленого забарвлення качанним салатом cv "Sharp Shooter" (SVS, Waycott та ін., 1999: Патент США 5,973,232). Від потомства цього схрещування 212 рандомізованих F2-рослин були розмножені в F3-лінії. Ці 212 F3-лінії були оцінені в конфіденційному зовнішньому випробуванні в Fijnaart, Нідерланди. Насіння сіялося на торф'яних блоках 17 червня, 2002, молоді рослини були перенесені в теплицю і висаджені на поле 5 липня, 2002. Строк збору врожаю (період спостереження) - від 19 серпня до 23 серпня, 2002. Розмір ділянки склав 24 рослини на F3 5 UA 68619 U 5 10 15 20 25 30 35 40 лінію, тобто 4 ряди 6 рослин. Лінії не були репліковані, оскільки експресія колірних характеристик була дуже стабільною в межах одного дослідження. Спостереження були виконані на F3-рослині. Спостережуваними характеристиками були: а) колір і, якщо червоний, його інтенсивність і зразок експресії на зовнішньому листі, b) колір і, якщо червоний, його інтенсивність і зразок експресії на внутрішньому листі, с) ступінь верхівки, d) у випадку зеленого зовнішнього листя: оцінка за 2 класами: блискучі або неблискучі. Інтенсивність і зразок експресії червоного забарвлення були оцінені в порядку збільшення, як: 1) легке забарвлення або почервоніння, тобто світло-червоне забарвлення на зовнішніх і внутрішніх листових краях або на внутрішній основі листа, 2) червоно-цяткове, 3) зеленоцяткове, тобто зелені плями на червоній листовій поверхні, 4) повністю червоне, тобто інтенсивно червоне забарвлення без плям, на світло-експонованій частині зовнішніх листових частин, і, у випадку внутрішнього листя, - по всій довжині внутрішнього листя. Пучок був оцінений між 1) злегка відкритим пучком, подібно ромену (Romaine) або пухкому пучку і 2) сильним пучком з чітким частково перекриваючим листям, подібно качанному салату. Деякі рослини у дослідженні загинули перед врожаєм. Із цільових 5088 рослин, тобто 212×24, в підсумку 5007 F3-рослини досягли стадії дозрівання і були оцінені (див. Таблицю 1). Всі рослини показали рівні пучків, які були принаймні співмірними з роменом (Romaine) або пухким пучком. Дані показали сегрегацію 55 повністю зелених ліній поза підсумком 212. Поза 157 лініями, які мали принаймні одну рослину з червоним забарвленням, 28 ліній складалися із рослин, які усі показали експресію антоціаніну на зовнішньому листі. Поза цими 28 лініями, 8 ліній складаються із рослин, які усі показали експресію антоціаніну на серцевинному листі. Рослини з червоним забарвленням поза 33 із 157 ліній принаймні з однією рослиною червоного кольору показували експресію антоціаніну тільки в зовнішньому листі, а не серцевинному листі. Рослини з червоним забарвленням поза іншими 33 з 157 ліній завжди показували експресію антоціаніну на обох - зовнішньому листі, також як і серцевинному листі. Рослини з червоним забарвленням поза залишком 91 лінії, усі показали експресію антоціаніну в зовнішньому листі. Проте, ці рослини показали внутрішньолінійну сегрегацію експресії антоціаніну у серцевинному листі. Жодна рослина поза 5007 рослинами не показала експресії антоціаніну у серцевинному листі в комбінації із зеленим забарвленням зовнішнього листя, які не мали ніякої експресії антоціаніну. Тому було зроблено висновок, що один або кілька генів, які приводять до експресії антоціаніну в зовнішньому листі, потрібні для експресії антоціаніну у серцевинному листі. У разі сегрегації між червоним кольором і зеленим, співвідношення сегрегації між червоним кольором і зеленим - в діапазоні від 23:1 до 1:22 для забарвлення зовнішнього листя. Для внутрішнього листя співвідношення сегрегації між червоним кольором і зеленим - в діапазоні від 18:1 до 1:23, виключаючи всі рослини із зеленим зовнішнім листям. Таблиця 1 показує внутрішньолінійне розповсюдження рослин з червоним і зеленим забарвленням зовнішнього і внутрішнього листя для популяції 212 рандомізовано виділених F3-ліній від схрещування '99Р.30637' х cv. "Sharp Shooter". Таблиця 1 Частина Усі рослини з зеленим червоним зовнішнім листям листям Усі рослини з зеленим внутрішнім листям Частина рослин з червоним зовнішнім листям та червоним внутрішнім листям Усі рослини з червоним зовнішнім листям та червоним внутрішнім листям 45 рослин з Усі рослини з зовнішнім червоним зовнішнім листям 55 29 4 0 75 16 0 25 8 Ці дані з сегрегації використовувалися, щоб сконструювати генетичну модель під припущенням незалежних співвідношень сегрегації Менделя. Знайдено, що принаймні три локуси залучені до УФ-незалежної експресії антоціаніну у внутрішньому листі. Перший локус, 6 UA 68619 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 позначений надалі як А-а, також знаходиться у відомому червоному салаті і домінантна алель А потрібна у всіх випадках, щоб отримати експресію антоціаніну. Ймовірно, цей локус - С або локус G (Robinson і інші., 1983, (Robinson і інші, 1983, The genes of lettuce and closely related species. B: Plant Breeding Reviews 1. Ed. J Janick. p. 267-293). Другий локус знайдений шляхом апроксимаційної моделі, позначеній надалі як В-b, де наявна гомозиготна рецесивна алель b приводить до експресії антоціаніну у зовнішньому листі в комбінації з А. Було знайдено ще два додаткових локуси, позначених надалі як С-с і D-d, що також залучені у експресію антоціаніну у зовнішньому листі. Наявність принаймні однієї копії домінантної алелі С або гомозиготної рецесивної алелі d приводить до експресії антоціаніну у зовнішньому листі, але тільки у випадку, якщо також присутня принаймні одна копія алелі А. Були знайдені ще три локуси, позначені надалі як Е-е, F-f і G-g. Щоб отримати УФнезалежну експресію антоціаніну у внутрішньому листі, потрібна присутність принаймні однієї Аалелі і двох b-алелей, в комбінації з кожною наявною однією копією домінантної Е-алелі або наявною гомозиготною f-алеллю, або наявною гомозиготною g-алеллю. Так, потрібна наявність алелей для червоного забарвлення принаймні на трьох локусах, а саме, В-b і кожний з Е-е, F-f або G-g для УФ-незалежної експресії антоціаніну у внутрішньому листі. До того ж, передбачається, що принаймні три, але ймовірно всі сім локусів, згаданих вище, залучені до інтенсивності червоного забарвлення даної корисної моделі. Приклад 3 Визначення кольору, антоціанінів і хлорофілів в салаті 1. Одержання зразка і аналіз Використовували спектрофотометр Ultrospec III (Pharmacia) з наступними характеристиками: - монохроматор: Czerny Turner з голографічними дифракційними гратами (1200 ліній/мм) - точність довжини хвилі: ±1 нм - відтворюваність довжини хвилі: ±0,5 нм - тип детектора: єдиний твердого стану кремнієвий фотодіод - пропускна спроможність: 5 нм. 2. Принцип Червоний колір (антоціаніни) і зелений колір (хлорофіли) визначаються біохімічним способом. Одержують два екстракти, один для вимірювання спектральної поглинальної здатності при 523 нм, що є показником загальної кількості антоціанінів, і один для вимірювання спектральної поглинальної здатності при 665 нм, що є показником загальної кількості хлорофілів (хлорофіл а і b). 3. Одержання зразка Збирали врожай пучкового і дозрілого салату, знімали зовнішнє листя, поки не звільниться серцевина. Серцевину салату використовували для аналізу. Серцевинне листя не потрібно було піддавати експозиції прямим сонячним світлом перед збиранням врожаю, за винятком незначної верхівки листа (максимум 10 %) на верхівці рослини. Серцевина містить принаймні 10 листів довжиною 1 см або довше. Найстаріші листя серцевини повинні бути загнуті в середину. Серцевини поміщають в пластикові сумки і заморожують при < -70 C. Принаймні через декілька днів заморожені до < -70 C серцевини подрібнюють молотком. Подрібнений зразок перемелюють на Grindomix (GM 200, Retsch, 5" 3000 обертів на хвилину, завершували при 5" 5000 обертах на хвилину), використовуючи вільноплаваючу кришку у присутності рідкого азоту (зразок потрібно тримати замороженим), щоб отримати порошок. Порошок потім поміщають в пробірку і пробірку з порошком охолоджують в рідкому азоті, і довільно зберігають при < -70 С до аналізу. 4. Аналіз Три грами порошку відважують у чотири 50 мл пробірки. Дві пробірки використовують для аналізу антоціанінів і дві пробірки для аналізу хлорофілів. Для вимірювань антоціанінів до двох пробірок негайно додають 1 М НСl в 50 % метанолі. Зразок 5-10 мл/г використовують в залежності від кольору зразка і екстракту. Використовуваний об'єм (мл) фіксують. Зразок розчину перемішують вручну і поміщають на крижану баню. Частину розчину поміщають в 1,5 мл пробірку Еппендорфа і центрифугують при 4 °C, 13000 обертів на хвилину протягом 4 хвилин. Спектри вимірюють спектрофотометром із пропускною здатністю 5 нм. Використовували кювету 1 см. Вимірюють спектр 360-900 нм і визначають спектральну поглинальну здатність при 523 нм (якщо необхідно, після розбавлення з рідким екстрактом) і максимальну довжину хвилі λ max  λmax повинна бути близько 523 нм. 7 UA 68619 U 5 10 Хлорофіли вимірюють безпосереднім додаванням 100 % метанолу до двох пробірок. Використовують зразок метанолу 5-10 мл/г в залежності від кольору зразка і екстракту. Використовуваний об'єм (мл) фіксують. Зразок розчину перемішують вручну і обробляють ультразвуком в ультразвуковій ванні 5 хвилин з дегазацією. Частину розчину поміщають в 1,5 мл пробірку Еппендорфа і центрифугують при 4 °C, 13000 обертів на хвилину протягом 4-х хвилин. Вимірюють спектр 360-900 нм і визнають спектральну поглинальну здатність при 665 нм (якщо необхідно після розбавлення рідким екстрактом) і максимальну довжину хвилі λ max. λmax повинна бути близько 665 нм. А523 і А665 коригують, щоб представити поглинання розчину, вагою 1 г в 10 мл екстракційного об'єму. Відкориговані А523 і А665 обчислюють з корекцією на зважений зразок (в г), об'єм екстракту (в мл) і, якщо необхідно розбавлення, використовуючи наступну формулу: Корекція: A відкоригов ане  15 20 25 30 A віміряне  об' ємекстракт у вага  10  розбавлення . Обчислювали співвідношення А523/А665. Таблиця 2а показує спектральну поглинальну здатність хлорофілу і антоціаніну і співвідношення антоціанін/хлорофіл, що спостерігали в салаті в Aramon, Франція (засів 10 січня 2002, пересаджування 15 лютого 2002, збір урожаю 25 квітня 2002). Лінія 01Р.80146 - лінія потомства, отримана від рослини 99Р.38154 двома поколіннями самозапилення. Pierrot (Rijk Zwaan), Darkland (Central Valley), Sierra (Vilmorin), і Roxy (Enza) - звичайні види салату. Таблиця 2b показує спектральну поглинальну здатність хлорофілу і антоціаніну і співвідношення антоціанін/хлорофіл, що спостерігали в салаті, вирощеному в Fijnaart, Нідерланди (засів 21 травня 2002, пересаджування 10 червня 2002, збір урожаю 20 серпня 2002). Лінія 01Р.80146 - лінія потомства, отримана від рослини 99Р.38154 2 поколіннями самозапилення. Pierrot (Rijk Zwaan), Pippo (Rijk Zwaan), Red Rosalita (Johnny's Selected & Orsetti) Darkland (Central Valley), Sierra (Vilmorin), і Roxy (Enza) -звичайні види салату. Інформація про депонування FS-рослини 01R. 1439, 02R.2413 і 02R.2418 були зареєстровані в депозитарії 18 липня 2005 NCIMB (National Collections of Industrial Food and Marine Bacteria), Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, United Kingdom під вхідними номерами депонування NCIMB 41337, NCIMB 41338 і NCIMB 41339, відповідно. Таблиця 2а Таблиця 2 b id. nr. (розмноження) Загальний хлорофіл А665 Сер. знач. Станд. відх. Міn Мах Nr id. nr. (розмноження) Загальний Red 01P.80 хлорофіл Sierra Roxy Darkland Rosali Pippo Pierrot 146 А665 ta 0,476 0,228 Сер. знач. 0,570 0,267 0,343 0,063 0,278 0,456 0,325 01Р.80 146 Pierrot Darklan Sierra d 0,105 0,396 0,198 0,028 0,073 0,062 0,038 0,080 Станд.відх. 0,189 0,105 0,101 0,013 0,075 0,244 0,113 0,083 0,150 5 0,321 0,486 5 0,132 0,451 0,155 Міn 0,279 0,520 0,353 Мах Nr 4 3 5 0,205 0,049 0,205 0,244 0,196 0,447 0,082 0,388 0,823 0,505 5 5 5 5 5 Roxy id. nr. (розмноження) Загальний антоціанін А523 Сер. знач. Станд. відх. Міn Мах Nr 0,345 0,180 0,836 0,405 5 id. nr. (розмноження) Загальний Red 01P.80 антоціанін Sierra Roxy Darkland Rosali Pippo Pierrot 146 А523 ta 0,033 0,087 Сер. знач. 0,038 0,046 0,010 1,228 0,030 0,693 0,870 01P.80 146 Pierrot Darklan Sierra d 1,589 0,883 0,006 0,195 0,123 0,001 0,006 0,030 Станд. відх. 0,019 0,020 0,004 0,145 0,014 0,437 0,277 1,370 1,890 5 0,725 1,070 5 0,005 0,029 0,063 Міn 0,006 0,041 0,137 Мах Nr 4 3 5 0,005 1,042 0,017 0,371 0,474 0,013 1,422 0,052 1,422 1,231 5 5 5 5 5 Roxy 0,028 0,027 0,072 0,080 5 5 8 UA 68619 U Продовження таблиці 2а Продовження таблиці 2 b id. nr. (розмноження) Загальний антоціанін/ загальний хлорофіл: А523/А665 Сер. знач. Станд. відх. Міп Мах Nr id. nr. (розмноження) 01P.80 146 Pierrot 16,16 2,27 0,03 0,07 0,38 Загальний антоціанін/ загальний Sierra хлорофіл: А523/А665 Сер. знач. 0,07 0,18 0,03 20,08 0,12 1,53 2,69 4,88 0,38 0,01 0,01 0,01 Станд. відх. 0,02 0,05 0,01 4,09 0,08 0,46 0,31 9,13 20,17 5 1,82 2,68 5 0,02 0,04 4 0,06 0,08 3 0,36 0,40 5 Міn Мах Nr 0,11 0,22 5 0,02 0,05 5 15,41 0,06 26,18 6,25 5 5 1,04 2,23 5 2,42 3,10 5 Darklan Sierra d & 0,05 0,09 5 Roxy Darkland Red 01P.80 Rosali Pippo Pierrot 146 ta ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 5 10 15 20 25 1. Пучковий салат виду Lactuca sativa, що має червоне листя впродовж пучка, включаючи серцевину. 2. Салат за пунктом 1, де співвідношення спектральної поглинальної здатності А523/А665 між антоціаніном і хлорофілом серцевинного листя знаходиться між 4 і 50. 3. Салат за пунктом 2, де співвідношення спектральної поглинальної здатності А523/А665 між антоціаніном і хлорофілом серцевинного листя знаходиться між 9 і 27. 4. Салат за будь-яким з пунктів 1-3, де співвідношення спектральної поглинальної здатності А523/А665 між антоціаніном і хлорофілом десяти наймолодших серцевинних листів, більших, ніж 1 см, знаходиться між 4 і 50. 5. Салат за пунктом 4, де співвідношення спектральної поглинальної здатності А523/А665 між антоціаніном і хлорофілом десяти наймолодших серцевинних листів, більших, ніж 1 см, знаходиться між 9 і 27. 6. Салат за будь-яким з пунктів 1-5, що має генетичну конституцію, яка приводить до червоного забарвлення серцевинного листя і яка містить локус гена для експресії антоціаніну, принаймні два локуси гена, які залучені у червоне забарвлення серцевини пучка і, необов'язково, принаймні два локуси гена, які залучені в інтенсивність червоного забарвлення. 7. Салат за будь-яким з пунктів 1-6, одержаний із насіння, зареєстрованого в депозитарії 18 липня 2005 NCIMB, під вхідними номерами: NCIMB 41337, NCIMB 41338 і NCIMB 41339. 8. Салат за будь-яким з пунктів 1-7, що має генетичну конституцію насіння, внесеного в депозитарій 18 липня 2005 NCIMB під вхідними номерами: NCIMB 41337, NCIMB 41338 і NCIMB 41339, яке приводить до червоного забарвлення листя серцевини пучка. 9 UA 68619 U 10 UA 68619 U 11 UA 68619 U 12 UA 68619 U 13 UA 68619 U Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 14