Штам гриба nectria pityrodes montagne, який використовується як біофунгіцид (варіанти), біофунгіцид, спосіб його одержання (варіанти), спосіб пригнічення грибкової інфекції у рослин, спосіб скринінгу фунгіцидних мікроорганізмів

1 Штамм гриба Nectna pityrodes Montagne DSM 7522, используемый в качестве биофунгицида 2 Штамм гриба Nectna pityrodes Montagne DSM 8805, используемый в качестве биофунгицида 3 Штамм гриба Nectna pityrodes Montagne DSM 8806, используемый в качестве биофунгицида 4 Штамм гриба Nectna pityrodes Montagne DSM 8807, используемый в качестве биофунгицида 5 Штамм гриба Nectna pityrodes Montagne DSM 8808, используемый в качестве биофунгицида 6 Биофунгицид, содержащий микроорганизм, отличающийся тем, что он содержит грибковый штамм, выбираемый из группы, включающей грибковые штаммы Nectna pityrodes Montagne DSM 7522 или DSM 8805 или DSM 8806 или DSM 8807 или DSM 8808 7 Биофунгицид по п 6, отличающийся тем, что он дополнительно содержит наполнители и/или добавки/ обычные в этой области 8 Биофунгицид по п 7, отличающийся тем, что наполнители и добавки выбирают из группы, включающей двуокись кремния, сухое молоко, карбоксиметил целлюлозу, сахарозу, аскорбиновую кислоту и крахмал 9 Способ получения биофунгицида по п 7 или 8, отличающийся тем, что включает выращивание грибкового штамма по любому из пп 1-5 в приемлемой ростовой среде, отделение клеточной массы, добавление к ней наполнителей и/или добавок, высушивание и измельчение этой массы в порошок 10 Способ получения биофунгицида по п 7 или 8, отличающийся тем, что включает выращивание грибкового штамма по любому из пп 1-5 в приемлемой среде вместе с двуокисью кремния и добавление, при желании наполнителей и/или добавок, высушивание и измельчение этой массы в порошок 11 Способ подавления грибковой' инфекции у растений, включающий нанесение на растение или его семена или внесение в субстрат для роста растения биофунгицида, отличающийся тем, что используют биофунгицид по пп 6-8 12 Способ скрининга фунгицидных микроорганизмов в образцах микробов, включающий следующие этапы (а) испытание в песке, в соответствии с которым семена зерновых культур высевают в слой песка, на семена и субстрат пипеткой наносят мицелий и споры патогена, а затем споры испытуемого грибка в водной суспензии, после чего семена покрывают песком, через определенный период времени проверяют интенсивность симптомов поражения ростков и отбраковывают грибки, которые не повлияли на развитие болезни или сами оказались патогенными, и (Ь) испытание отобранных грибков в торфе, в соответствии с которым семена зерновых культур замачивают в суспензии спор патогена и сушат, а затем смачивают суспензией спор испытуемого грибка, сушат и высевают а Обработанный паром торф, выращивают в течение определенного периода времени, наблюдают за состоянием ростков и отбирают для последующих испытаний изоляты, однозначно подавляющие развитие болезни Предметом настоящего изобретения являются биологические методы борьбы с болезнями рас О 00 00 44889 тении и, в частности, новые микроорганизмы, относящиеся к роду Nectna, а также их применение для борьбы с грибковыми инфекциями у растений Кроме того, данное изобретение относится к составам, включающим новые штаммы рода Nectna и используемым для указанной цели Настоящим изобретением предусматривается метод скринингтеста эффективных организмов в микробных штаммах, выделенных из почвы Известный уровень техники Сельскохозяйственные культуры подвержены различным болезням, вызываемым грибками, бактериями и вирусами, и могут быть поражены рядом насекомых-вредителей Для борьбы с такими болезнями разработаны методы культивации, химические и биологические методы Эти методы направлены на предотвращение качественных и количественных потерь сельскохозяйственных культур вследствие болезней и поражения насекомыми-вредителями Как правило, термин "биологическая борьба с болезнями растений" означает уничтожение патогенов растений другими организмами, которые можно назвать биоконтролирующими агентами (БКА) Продукты, вырабатываемые биоконтролирующими агентами, часто называют биопестицидами Механизмы биологической борьбы с болезнями растений могут быть весьма различны, и желаемый эффект часто достигается в результате совместного действия нескольких разных механизмов Эффект подавления может быть вызван ингибирующими метаболитами, образуемыми биоконтролирующими агентами, которые иногда паразитируют на патогене или борются с ним за жизненное пространство и/или питательные вещества Потребность разработки биоконтролирующих агентов еще больше возросла в связи с тем, что многие традиционные химические контролирующие агенты оказались вредными для окружающей среды и людей Недостатком химикатов является также то, что многие вредители быстро приобретают иммунитет к одному и даже нескольким контролирующим средствам Выработка иммунитета к биопестицидам маловероятна, так как на основе их действия лежат механизмы разных типов Химикаты обычно оказывают более быстрое и эффективное действие, чем биопестициды С другой стороны, действие биопестицидов часто бывает более продолжительным, чем у химикатов, так как производимый ими эффект создается жизнеспособными и воспроизводимыми микроорганизмами Наиболее важную группу биопестицидов составляют бактериальные продукты, оказывающие целенаправленное действие на насекомыхвредителей Наиболее распространенными являются биоинсектициды на основе бактерий Bacillus thunngiensis В Финляндии производится биофунгицид на основе актиномицета Streptomyces, который эффективен против ряда грибковых болезней растений, источников которых являются почва и семена Продукт, который предотвращает распространение корневой гнили (вызываемой грибком Heterobasidion annosum) в хвойных лесах, был получен из безвредного лесного гнилостного грибка Phlebic gigantean Были всесторонне изучены бактерии рода Pseudomonas, в частности вида Pseudomonas fluorescens, и в настоящее время известно большое число штаммов Р fluorescens, обладающих фунгицидным действием См , например, опубликованные заявки на патент WO 92/18613, FI 92 1722 и WO 90/01327, а также европейский патент № 228457 В процессе поиска микроорганизмов, пригодных для биологической борьбы, обычно производится тестирование большого числа микробных штаммов с целью выявления их биоконтролирующей активности или других нужных свойств В опубликованных патентах рассматриваются некоторые методы скрининг-теста В патенте США № 4647533 рассматривается трехэтапный метод скрининг-теста, в соответствии с которым бактерии сначала выделяют из почвы, содержащей множество спор болезнетворного грибка Pythium На втором этапе выделенные бактерии подвергают скрининг-тесту в теплице путем проращивания семян зерновых культур в почве, содержащей большое количество спор Pythium, при этом тестируют каждый вид бактерий и проводят контрольный тест без этих бактерий На основании теста отбирают бактерии, в присутствии которых растения достигают наибольшей высоты и имеют наиболее развитые листья На третьем этапе отобранные бактерии еще раз проходят отбор в полевых условиях при проведении такого же испытания, что и в теплице Кроме того, на третьем этапе отбирают те бактерии, в присутствии которых растения растут лучше всего В заявке на патент Финляндии № 92 1722 описывается следующий способ Сначала в соответствующей среде выращивают мицелий штамма Pythium Этот мицелий покрывают слоем стерильной почвы, в которую добавляют исследуемые микроорганизмы, после чего оценивают их воздействие на рост грибка Pythium На втором этапе почвенный образец инокулируют штаммом Pythium, вызывающим ризоктиниоз В почву высевают семена растения, восприимчивого к этой грибковой инфекции, и определяют влияние испытуемого организма на рост растений Для последующих испытаний отбирают такие вещества, которые оказывают ингибирующее действие на грибок Pythium в обоих вышеуказанных испытаниях Краткое изложение существа изобретения Предметом настоящего изобретения являются микроорганизмы рода Nectna, в частности Nectna pityrodes Montagne, которые оказались весьма эффективными для борьбы с грибками Fusanum Кроме того, данное изобретение относится к биофунгицидному составу на основе микробного штамма, который содержит в качестве активного ингредиента вышеуказанные грибковые штаммы, принадлежащие к роду Nectna, а также известные добавки или наполнители Примерами таких препаратов являются составы, пригодные для протравливания семян, порошкообразные или гранулированные составы, вносимые в субстраты, необходимые для роста, или жидкие составы, предназначенные для обработки почвы Настоящим изобретением предусматривается 44889 обнаружено пять штаммов, которые позволили получить очень хорошие результаты Штаммы, названные, J 76, J 1431, J 1432, MOS1 и ROS 2, были отправлены на исследование в Центральное управление сельскохозяйственных культур, г Баарн, Нидерланды В соответствии с Будапештским договором эти штаммы были внесены в банк данных DSM (Deutseh Sammlung ven Microorgamsmes and Zellkulturen GmlH) под номерами DSM 7522 (15 марта 1993 г), DSM 8805 (10 декабря 1993 г), DSM 8806 (10 декабря 1993 г), DSM 8807 (10 декабря 1993 г) и DSM 8808 (10 декабря 1993 г) Эти микроорганизмы имеют следующие морфологические характеристики Морфология спороходий без краевых стерильных гифов Периодические ответвления конидиофор при наличии нескольких ответвлений в каждом узле Конечные ответвления содержат мутовки фиал ид, образующиеся в столбчатом слое Фиал иды имеют цилиндрическую форму длиной до 15мкм с апикальными порами Конидии в виде цепей или слизистых шариков эллипсоидной или каплеобразной формы с коротким хилусом, 7 - 8х4мкм, гладко-стенные без отростков Характер развития колонии колония на агаре из овсяных хлопьев увеличилась в диаметре до Рис с За по 3d Гистограммы, представляю40см в течение 7 дней при температуре 22°С, гиащие результаты воздействия грибковых изолятов, лин мицелия, спорообразующие участки покрыты забракованных на разных этапах испытаний, прозелеными, концентрическими кольцами спороховеденных в теплице, на состояние ростков в поледия Запах отсутствует, колония обесцветилась, вых условиях эксудат ограничен, светлый К = обработка не производилась, В = протравливание составом "Байтан 1" Структура конидиофора штамма J 76 аналоПодробное описание изобретения гична структуре Myrothecium verrucana, но отличаНиже дается детальное описание грибковых ется от этого вида образованием неграничного штаммов по настоящему изобретению Приводятспороходия, наличием конидий в виде сухих цепей ся данные об их выделении, подробно рассматрии без типичного веерообразного отростка ваются штаммы и указывается их эффективность Представители рода Ghocladium отличаются в полевых условиях Далее рассматриваются споот новых штаммов тем, что для рода Ghocladium собы получения биофунгицидных составов из этих типично образование отдельных кистеобразных штаммов, характеристики составов и испытания конидиофоров эффективности этих составов Помимо этого опиТаким образом, штаммы J 76, J 1431, J 1432, сывается метод скрининг-теста грибковых штамMOS 1 и ROS 2 были идентифицированы в качемов, выделенных из почвенных образцов стве видов Nectna pityrodes Montagne Выделение микроорганизмов Из этих штаммов можно получить устойчивые Почвенные образцы, из которых выделяли составы, которые легко наносятся на пораженные грибковые штаммы по настоящему изобретению, болезнью посевы Состав можно получить в виде отбирали в 1989, 1990 и 1991 г г Их общее колипорошка Культивирование микробов может быть чество составляло 190 Почвенные образцы разначато с инокулята, который представляет собой ных типов и из севооборотов различной ротации содержащую споры пеллету (лепешку) картобрали в разных частях Финляндии, главным обрафельного агара с глюкозой, выдерживаемую при зом с научно-исследовательских станций Сельтемпературе -80°С Микробы можно культивироскохозяйственного научно-исследовательского вать в жидкой среде или на твердой подложке центра Образцы брали из корневого слоя (с глуПитательная среда включает сахар, например бины 0 - 15см) С каждого слоя брали несколько сахарозу, и азот, а также небольшие количества аналитических образцов, которые делили на части других питательных веществ Для культивироваот 1 до 2 литров ния микробов можно использовать неспецифические питательные среды, например кукурузный Выделение микроорганизмов производили по экстракт, или специфические питательные среды, методу разбавления (выделение из почвы) или по например ГДС (глюкоза 4г/л, дрожжевой экстракт методу культивирования на растениях (выделение 4г/л, солодовый экстракт Юг/л) или картофельноиз корней) Полученные результаты подробно декстрозный бульон Показатель рН равен приописываются ниже в разделе "Методы" мерно 6,0 и регулируется вначале до стерилизаХарактеристика микроорганизмов ции Культивирование производится при встряхиГрибковые штаммы, выделенные из почвенвании в течение одной-двух недель Биомассу ных образцов, испытывали с помощью метода можно отделить от бульона путем фильтрования скрининг-теста по настоящему изобретению, коточерез фильтровальную бумагу или центрифугирорые описывается ниже в разделе "Методы" Было также новый и эффективный способ скринингтеста грибковых штаммов, представляющий собой трехэтапное испытание, включающее тестирование в песке, торфе и полевой почве На каждом этапе испытания грибковые штаммы, оказавшиеся неэффективными, исключают из последующих тестов Грибковые штаммы, показавшие наилучшие результаты в теплице, затем испытывают в полевых условиях Краткое описание чертежей Рис 1 Эксперимент по выявлению реакции на дозу при использовании штамма J 76 летом 1992 г Процент пораженных ростков при инокулировании семян грибком г F culmorum К = обработка не производилась, В = протравливание составом "Байтан", J 76-0 = суспензия спор J 76, 1,2x107 КОЕ/мл J 76-1 = суспензия спор J 76, 1,2x106 КОЕ/мл J 76-2 = суспензия спор J 76, 1,2x105 КОЕ/мл J 76-3 = суспензия спор J 76, 1,4x104 КОЕ/мл Рис 2, Эксперимент по выявлению реакции на дозу при использовании штамма J 76 летом 1992 г Процент пораженных ростков при использовании здоровых семян Используемые аббревиатуры аналогичны рис 1 44889 8 вания Бели культивирование производят в жидными кой среде, к биомассе примешивают наполнитель, Испытание в торфе например двуокись кремния, сухое молоко и/или Семена зерновой культуры замачивали в сускарбоксиметилцеллюлозу (КМЦ) Эту массу сушат пензии спор патогена и сушили После этого сепри комнатной температуре и измельчают в помена смачивали в суспензии спор испытуемого рошок грибка, сушили и высевали В качестве субстрата, необходимого для роста, использовали пропаренМетоды ный торф Через две с половиной недели культиВыделение микробов вирования проверяли состояние ростков Штаммы a) Метод разбавления (выделение из почвы) грибков, которые препятствовали возникновению Юг почвы смешивали со 100мл 0,5% водного болезни, отбирали для испытаний в полевой раствора агара (бактоагар) Из этой смеси отбипочве рали три 10мл пробы и из каждой из них готовили два разведения (10 1 и 10 2 ) в 0,5% водном расИспытания в полевой почве творе агара Разбавленные пробы встряхивали (в Измельченную и увлажненную полевую почву водяной бане) в шейкере в течение 20 - 30 минут помещали в горшки емкостью 1,5л и в каждый 1мл разведения помещали с помощью пипетки на горшок высевали 36 семян зерновых культур Пепустую чашку Петри и добавляли 20мл агара из ред посевом семена обрабатывали так же, как при бычьей желчи Литмана Эти чашки инкубировали испытании в торфе, причем использовали по 3 при комнатной температуре в течение 3 - 7 дней, репликатных горшка для каждой обработки Симпосле чего в чистые культуры на картофельном птомы болезни у ростков проверяли через четыре агаре с глюкозой вводили индивидуальные грибки недели культивирования b) Метод культивирования на растениях (выШтаммы, показавшие хорошие результаты в деление из корней) этих испытаниях, отбирали для полевых испытаний, которые позволили окончательно определить 15 горшков в виде матрицы с последовательбиопестицидную эффективность микробных изоным расположением (матрица с последовательно лятов расположенными 50мл горшками Vefi-VP) заполняли почвой одного образца В один горшок высеПатогенность грибковых штаммов вали четыре семени пшеницы ячменя или приЭкспериментальным путем проверяли возмерно 15 семян репы, причем для каждого вида можные вредные воздействия грибкового штамма растений использовали пять горшков Семена J 76 Полученные результаты показали, что этот покрывали песком, поливали и инкубировали в грибок не оказывает патогенного действия на раскамере для выращивания при температуре +15°С тения Испытания проводились в отношении расс 14-часовым световым периодом После двух тений 33 видов недель культивирования растения вытаскивали и Экспериментальная часть промывали в проточной воде или очищали сухой Следующие эксперименты иллюстрируют щеткой От корней отрезали маленькие кусочки и возможности применения настоящего изобретеклали на плоские чашки Используемые среды ния В разделе (А) рассматривается использоваагар из бычьей желчи Литмана (Юг пептона, Юг ние суспензий пор Nectna pityrodes штаммов J 76, декстрозы, 15г бычьей бактожелчи, 0,01 г ВJ 1431, J 1432, MOS 1 и ROS 2 по этому изобретекристаллического фиолетового красителя, 0,03г нию для борьбы с болезнями растений, вызываестерптомицина, 20г агара и 1000мл воды), PCNB мыми главным образом видом Fusanum spp В (15г пептона, 1г КН2РО4, 0,5г MgSO4 7Н20, 2г авиразделе (В) описывается способ получения и искола, 3 части на миллион стрептомицина, 20г агапользования составов на основе этих штаммов В ра и 1000мл воды), картофельно-декстрозный разделе (С) рассматриваются эксперименты, с агар со стрептомицином (39мг картофельного агапомощью которых исследовали действие, оказыра с декстрозой, 300 частей на миллион стрептоваемое грибковым штаммом J 76, и в разделе (D) мицина и 1000мл воды) Через несколько дней приводится осуществление и оценка метода скриинкубирования выделяли отдельные грибки и инонинг-теста по настоящему изобретению кулировали на плоские чашки картофельного ага(А) Использование грибковых штаммов в виде ра с декстрозой Штаммы хранили на пеллетах суспензий спор картофельного агара с декстрозой в ампулах Эксперименты с суспензией пор штамма J 76 (Nalgene 5000-0012, стерильный пирофосфат Летом 1992 г на трах испытательных площад1,2мл) при температуре -80°С ках проверяли воздействие суспензии спор штамма J 76 В этих испытаниях использовали семена Проведение испытаний в теплице по методу двух разных зерновых культур, семена пшеницы, скрининг-теста искусственно инокулированные Fusanum culmorun, Испытание в песке и семена ячменя, зараженные F Nivale естественСемена зерновой культуры высевали в слой ным путем песка На эти семена и субстрат, необходимый для роста, с помощью пипетки наносили сначала Результаты испытаний в отношении пшеницы мицелий и споры патогена в водной суспензии, а приведены в таблице 1 Показатели урожайности затем споры испытуемого грибка, после чего сеискусственно инокулированной пшеницы даны в мена покрывали песком Через две с половиной таблице 2 недели проверяли интенсивность проявления Результаты проверки ростков ячменя предсимптомов болезни Из последующих испытаний ставлены в таблице 3 Эта болезнь не оказала исключали грибки, которые не влияли на интенстатистически значимого влияния на урожайность сивность болезни, или сами оказались патогенячменя 44889 10 Таблица 1 Эксперименты, проведенные на трех испытательных участках летом 1992 г в отношении искусственно инокулированной пшеницы Появление всходов и развитие болезни у ростков Обработка ХОКИОИНЕН МИЕТОИНЕН ПАЛКАНЕ Здоровые семена Необработанные семена Семена, протравленные составом "Байтан" J76 Здоровые семена Необработанные семена Семена, протравленные составом "Байтан" J76 Здоровые семена Необработанные семена Семена, протравленные составом "Байтан" J76 Ростки, количество/ метр рядка 50 11 Развитие болезни, процент сильно пораженных ростков 5,2 43 45 10 47 45 10 7,2 7,3 42 39 3,8 33 50 15 13 3,0 57 51 24 45 11 Таблица 2 Эксперименты, проведенные на трех испытательных площадках летом 1992 г в отношении искусственно инокулированной пшеницы Показатели урожайности (кг/га) Обработка Здоровые семена Необработанные семена Семена, протравленные составом "Байтан" J76 Хокиойнен 3650 1830 3270 3530 Миетойнен 3190 1690 3190 2950 Пал кане 5290 1950 4940 4900 Таблица 3 Эксперименты, проведенные на трех испытательных площадках летом 1992 г в отношении ячменя, зараженного естественным путем (F mvale) Появление всходов и развитие болезни у ростков Обработка ХОКИОИНЕН МИЕТОИНЕН ПАЛКАНЕ Необработанные семена Семена, протравленные составом "Байтан" J76 Необработанные семена Семена, протравленные составом "Байтан" J76 Необработанные семена Семена, протравленные составом "Байтан" J76 Испытание по выявлению реакции на дозу штамма J 76, проведенное летом 1992 г Поскольку штамм J 76 продемонстрировал действительно хорошие результаты во время опытов, проведенных в начале лета 1992 г, было исследовано воздействие этого штамма в зависимости от дозы на зерновую культуру, посеянную в начале лета Использовали как здоровые семена пшеницы, так и семена, искусственно инокулиро Ростки, количество/ метр рядка 39 Развитие болезни, процент сильно пораженных ростков 7,7 40 1,2 40 42 0,9 7,4 42 1,4 43 42 2,8 26 42 9,4 44 6,3 ванные Fusanum culmorum Этот эксперимент проводили на небольших делянках площадью 2м 2 Вели наблюдение за появлением всходов и проявлением симптомов болезни у ростков Образцы ростков для проверки развития болезни брали через четыре равных периода времени Образцы для каждой обработки брали с четырех делянок, посев на которых был произведен отдельно для каждого времени отбора 11 44889 12 образцов Количество ростков указано в таблице и здоровых семян Данные, представленные в 4, а процентные значения пораженных ростков таблице 5, графически показаны на рисунках 1 и приведены в таблице 5 отдельно для пораженных 2 Таблица 4 Эксперимент по выявлению реакции на дозу штамма J 76, проведенный летом 1992 г Появление всходов Обработка Семена, зараженные грибком Необработанные семена Семена, протравленные составом "Байтан" Суспензия спор J 76 (1,2x10' КОЕ/мл) Суспензия спор J 76 (1,2x10° КОЕ/мл) Суспензия спор J 76 (1,2x10° КОЕ/мл) Суспензия спор J 76 (1,2x10 КОЕ/мл) Здоровые семена Необработанные семена Семена, протравленные составом "Байтан" Суспензия спор J 76 (1,2x10' КОЕ/мл) Ростки, количество/метр, рядка 18 57 74 58 51 20 71 66 80 Таблица 5 Эксперимент по выявлению реакции на дозу штамма J 76, проведенный летом 1992 г Процент пораженных ростков для семян, инокулированных грибком F culmorum, и здоровых семян Сокращения аналогичны рис 2 Обработка Семена, зараженные грибком Fusarium К В J76-0 J76-1 J76-2 J76-3 Здоровые семена К В J76-0 10 Количество дней после появления всходов 17 30 44 75,4 15,9 10,1 23,1 36,4 68,6 82,8 60,9 50,0 51,8 64,7 72,8 79,5 65,3 66,6 55,5 76,0 77,1 85,1 78,2 70,3 62,9 78,0 76,2 54,7 8,4 14,3 71,8 50,4 48,0 67,7 58,3 69,9 85,1 73,6 73,8 Полевые опыты с использованием суспензии спор J 76, проведенные летом 1993 г Эти опыты были проведены на научноисследовательских станциях Хокиойнен, Метиойнен и Палкане В опытах использовали образцы семян шести типов - пшеница "Luja", зараженная грибком F culmorum естественным путем, - пшеница "Luja", искусственно инокулированная грибком F culmorum - пшеница "Luja", незараженная, - пшеница "Laan" незараженная, - ячмень "Kustaa", зараженный разными грибками Fusarium и грибком Bipolaris sorokmiana естественным путем, овес "Yty", зараженный грибком F avenaceum естественным путем Здоровые семена были посеяны только в Хокиойнене, в отношении других четырех образцов семян опыты проводились в каждом из трех испытательных районов Для проведения опытов делянки площадью 10м2 засевали шестью дублированными образцами, предназначенными для каждой обработки Все образцы семян подвергали аналогичной обработке К = необработанные контрольные семена, В = химически обработанные семена, протравленные составом "Байтан 1", ,J 76S = суспензия спор J 76 из культуры на плоских чашках (8,4x109КОЕ/кг семян) В таблице 6 приведены значения интенсивности поражения болезнью отдельно для каждой обработки и образцов семян Показатели урожайности суммированы в таблице 7 44889 13 14 Таблица 6 Полевые опыты с использованием суспензии спор J 76, выполненные в 1993 г Процент сильно пораженных ростков Ячмень Овес ХОКИОИНЕН К В J76S МИЕТОИНЕН К В J76S ПАЛКАНЕ К В J76S Пшеница зараженная естественным путем Пшеница инокулированная искусственно Здоровая пшеница "Luja" Здоровая пшеница "Laan" 20,6 1,4 3,3 5,7 0,7 5,7 6,0 0,9 0,9 10,1 2,0 1,4 7,4 2,1 0,7 34,2 1,0 1,0 12,8 1,3 5,4 3,5 0,6 0 20,4 5,7 7,1 72,0 6,6 7,3 9,6 2,5 2,4 7,4 3,3 3,6 10,9 2,1 2,3 26,9 0,6 0 Таблица 7 Урожайность, достигнутая во время полевых опытов, проведенных в 1993 г с использованием суспензии спор J 76 (кг/га) Ячмень Овес ХОКИОИНЕН К В J76S МИЕТОИНЕН К В J76S ПАЛКАНЕ К В J76S Пшеница, зараженная естественным путем Пшеница, инокулированная искусственно Здоровая пшеница "Luja" Здоровая пшеница "Laan" 6100 5940 6150 6360 6060 6570 7460 7500 7840 6650 6790 6650 6090 5870 6050 2950 5690 6040 5900 6070 6120 5780 5200 5440 4920 4910 4670 3890 4990 4810 4670 4550 4710 5560 5200 5430 3630 4190 3710 2950 4000 3650 Испытание штамма J 76 в отношении воздействия на твердую головню пшеницы и гниль корневой шейки ячменя Летом 1993 г штамм J 76 был включен в полевые опыты, в ходе которых десять химических фунгицидов, используемых для протравливания семян зерновых культур, испытывали в отношении воздействия на твердую головню пшеницы (вызываемую грибком Tilletia caries) Штамм J 76 применяли в виде суспензии конидий, а химикаты - в соответствии с инструкциями по использованию Опыты проводили на делянках площадью 0,1м2 при пятикратном дублировании (таблица 8) Таблица 8 Влияние протравливания на возникновение твердой головни пшеницы Обработка Тайссато S, жидкий состав Байтан WS Берет 050 Фунгазил С Паноктин 35 Раксил 1, порошкообразный состав Раксил 1, жидкий состав Эффективность уничтожения (%) (= сокращение количества пораженных Колосов) 78 100 100 100 100 100 100 44889 15 16 Продолжение таблицы 8 100 100 85 Прелюд LS Вита вакс 200 J76 В составе "Байтан" активным ингредиентом был триадименол Состав "Байтан 1" представлял собой смесь, которая включала триадименол и имазалил Состав "Тайссато S " содержал карбоксин и имазалил Активным ингредиентом в составе "Паноктин" являлся квазатин Во время полевых опытов по испытанию химикатов в отношении уничтожения гнили корневой шейки ячменя (вызываемой Bipolans sorokmiana) также производили обработку семян спорами J 76 Опыты проводили на делянках площадью 10м2 с четырехкратным дублированием Не было обнаружено никаких различий в появлении всходов при различных обработках Штамм J 76 позволил в значительной степени устранить симптомы болезни (таблица 9), хотя этот патоген сильно отличается от грибков, Fusanum, для борьбы с которыми он был выбран Таблица 9 Влияние протравливания на возникновение гнили корневой шейки ячменя Обработка Прелюд LS Дивиденд 37,5 (400мл) Дивиденд 37,5 (200мл) Байтан 1 Берет специальный (400мл) Раксил 1, порошкообразный состав Тайссато S, жидкий состав Паноктин плюс Фунгазил С Берет специальный (200мл) Раксил 1, жидкий состав Берет FS 050 RNL210 J76 Эффективность уничтожения (%) (сокращение количества пораженных ростков) 85 84 81 81 74 (В) Препараты, полученные из грибковых штаммов, эффективность их применения в полевых опытах Порошкообразные составы из грибкового штамма J 76 были получены следующим образом Состав 1 Культивирование производили в колбе Эрленмейера емкостью 1л, в которую помещали 0,5л питательной среды, содержащей 4г/л сахарозы, 4г/л дрожжевого экстракта и Юг/л солодового экстракта Показатель рН доводили до 6,0 перед стерилизацией в автоклаве В качестве инокулята использовали пеллету агара со спорами, которую хранили при температуре -80°С (картофельнодекстрозный агар) Скорость вращения шейкера равнялась 150 оборотам в минуту, культуру выращивали при комнатнойтемпературе (22°С) и период культивирования составлял от 7 до 12 дней Клетки отделяли фильтрованием через фильтровальную бумагу С биомассой (клеточной) смешивали S1O2, сухое молоко и карбоксиметилцеллюлозу в следующих количествах биомасса 20% двуокись кремния 55% сухое молоко 15% карбоксиметил целлюлоза (7% водный раствор) 10% Эту смесь в течение 2 дней сушили на откры 70 66 66 66 65 64 49 39 69 тых чашках Петри при комнатной температуре в стерильной атмосфере Толщина слоя составляла 1 - 2см Высушенную смесь измельчали в порошок Жизнеспособность препарата равнялась ЮКОЕ/г (КОЕ = колониеобразующая единица) КОЕ (колониеобразующая единица) - это единица, которая используется для определения жизнеспособности микробов Разбавленную суспензию микробов помещали на плоские чашки агара и через несколько дней подсчитывали колонии Если известна степень разведения, можно высчитать количество колоний или количество микробных клеток в первоначальном образце Состав 2 Клетки культивировали так же, как при получении состава 1, после чего с биомассой смешивали S1O2, сухое молоко, карбоксиметилцеллюлозу и аскорбиновую кислоту в следующих количествах биомасса 60% Si02 20% сухое молоко 14% карбоксиметилцеллюлоза (7%) 3% аскорбиновая кислота 3% Эту смесь сушили так же, как при получении состава 1, и измельчали в порошок Жизнеспособность этого препарата составила 107КОЕ/г 17 44889 18 Состав 3 исследовательском центре в Хокиойнене, Миетойнене и Палкане При проведении этих опытов Клетки культивировали так же, как при полуиспользовали образцы семян шести видов чении состава 1, после чего с клеточной биомассой смешивали сахарозу и крахмал в следующих - пшеница "Luja", зараженная грибком F количествах culmorum естественным путем, биомасса 20% - пшеница "Luja", искусственно инокулированная грибком F culmorum сахароза 25% крахмал 55% - пшеница "Luja", незараженная, Эту смесь сушили так же, как при получении - пшеница "Laan" незараженная, состава 1, и измельчали в порошок Жизнеспо- ячмень "Kustaa", зараженный разными грибсобность этого препарата составила 107КОЕ/г ками Fusarium и грибком Bipolaris sorokimana естественным путем, Состав 4 Штамм J 76 культивировали в твердой питаовес "Yty", зараженный грибком F тельной среде с наполнителем из S1O2 В качестве avenaceum естественным путем питательного бульона использовали 8% солодоОбразцы здоровой пшеницы сеяли только в вый экстракт (Мальтакс МР10, Lahden Polttimo) Хокиойнене, а опыты с четырьмя другими образ120г питательного бульона смешивали в химичецами семян проводили на всех трех испытательском стакане с 50г порошкообразного силикагеля ных участках В ходе опытов засевали делянки и на 20 минут помещали в автоклав при темпераплощадью 10м2 с шестикратным дублированием туре 120°С Охлажденную среду инокулировали для каждой обработки Юг суспензии спор J 76, которую получали путем Все образцы семян подвергали одинаковой соскабливания спор с чашки картофельного агара обработке К = необработанные контрольные сес глюкозой в стерильную воду Эту среду инкубимена, ровали в течение 20 дней при температуре 16°С, В = химически обработанные контрольные после чего ее 2 дня сушили при комнатной темпесемена, протравленные составом "Байтан 1", ратуре Жизнеспособность сухого препарата соJ 76PK = порошкообразный состав J 76, исставила 107КОЕ/г пользуемый в виде сухой протравки (8,4x108КОЕ/кг = наибольшее количество, поглоОстальные штаммы по настоящему изобретещаемое семенами), нию можно получить аналогичным образом Эффективность применения порошкообразJ 76PN = порошкообразный состав J 76, исных составов в полевых опытах пользуемый в виде жидкой протравки (8,4x108КОЕ/кг) Рассматриваемые ниже опыты проводились Институтом зашиты растений в СельскохозяйстВ таблице 10 приведены величины интенсиввенном научно-исследовательском центре Финности поражения болезнью отдельно для каждой ляндии летом 1993 г при использовании порошобработки и образцов семян Показатели урожайкообразного состава штамма J 76 Эти опыты ности суммированы в таблице 11 проводились в Сельскохозяйственном научноТаблица 10 Полевые опыты с использованием порошкообразного состава J 76, выполненные в 1993 г Процентные значения сильно пораженных ростков Ячмень Овес ХОКИОИНЕН К В J76PK J76PN МИЕТОИНЕН К В J76PK J76PN ПАЛКАНЕ К В J76PK J76PN Пшеница зараженная естественным путем Пшеница инокулированная искусственно Здоровая пшеница "Luja" Здоровая пшеница "Laan" 20,6 1,4 6,2 5,7 5,7 0,7 2,8 4,6 6,0 0,9 2,2 1,2 10,1 2,0 1,5 1,9 7,4 2,1 2,7 3,9 34,2 1,0 7,0 1,3 12,8 1,3 10,1 9,1 3,5 0,6 0 0,3 20,4 5,7 17,2 13,7 72,0 6,6 42,5 14,3 9,6 2,5 5,3 3,9 7,4 3,3 2,6 3,8 10,9 2,1 4,8 3,9 26,9 0,6 6,1 2,7 44889 19 20 Таблица 11 Показатели урожайности, достигнутые во время полевых опытов, проведенных в 1993 г с использованием порошкообразного состава J 76 (кг/га) Ячмень Овес ХОКИОИНЕН К В J76PK J76PN МИЕТОИНЕН К В J76PK J76PN ПАЛКАНЕ К В J76PK J76PN Пшеница, зараженная естественным путем Пшеница, инокулированная искусственно Здоровая пшеница "Luja" Здоровая пшеница "Laan" 6100 5940 6400 6000 6360 6060 6320 6400 7460 7500 7610 7610 6650 6790 6940 6970 6060 5870 6060 6040 2950 5690 5140 6020 5900 6070 6000 6110 5780 5200 5670 5760 4920 4910 4770 4790 3890 4990 4620 4950 4670 4550 4730 4870 5560 5200 5560 5470 3630 4190 3600 3660 2950 4000 3390 3760 Кроме того, в 1993 г проводили испытания по эффективности воздействия составов, полученных из штамма J 76, на разные грибки Результа ты этих экспериментов приведены в таблицах с 12 по 18 Таблица 12 Эффективность подавления штаммом J 76 грибков Gacumannomyces на инокулированнои пшенице Polkka, произрастающей в песчаной почве Вегетационное испытание с прикрытием Обработка Появление всходов % Пораженные болезнью семена (не обработанные штаммом J76) Протравливание сухим составом J 76 (состав 4), 8г/кг Протравливание жидким составом J 76, 10бКОЕ/мл Индекс поСырой вес Процентполностью здоражения (0 ровых ростков г/репликацию г/росток -3) 78,7 65,3 0,76 5,8 0,28 81,3 76,0 0,55 10,1 0,46 90,7 81,3 0,31 10,4 0,43 Индекс поражения 0 здоровые семена 1 незначительное поражение 2 сильное поражение 3 отсутствие всходов Таблица 13 Эффективность воздействия препаратов J 76 на грибок Fisanum culmorum, поражающий пшеницу Polkka Вегетационные испытания при использовании торфа в качестве субстрата KF = выращивание в твердой фазе (состав 4), R = культивирование в жидкой фазе в шейкере (состав 1), М = микробы из культуры на агаре Обработка Здоровые семена Пораженные болезнью семена Протравливание жидким составом J 76 KF 40/931, 106КОЕ/мл Процент появления всходов Процент полностью здоровых растений 91 30 84 5 Индекс поражения (0-3) 0,37 2,54 72 44 1,17 Сырой вес, г/репликац 16,2 4,5 14,0 44889 21 22 Продолжение таблицы 13 71 49 1,21 13,0 76 58 0,99 14,8 Протравливание жидким составом -J 76 R 10/2 С, 10°КОЕ/мл J 7 6 M , 10°КОЕ/мл Индекс поражения 0 здоровые растения 1 незначительное поражение 2 сильное поражение 3 отсутствие всходов Таблица 14 Эффективность воздействия препаратов J 76 на грибок Pythium, поражающий огурцы Результаты даны в виде средних значений для трех вегетационных испытаний (рН 6,2, рН 6,9 и рН 7,4) Обработка Здоровые семена Пораженные болезнью семена Протравливание жидким составом J76, 106КОЕ/мл Индекс поражения 0 1 2 Процент жизнеспособных проростков 98 47 Индекс поражения (0-2) 0,04 0,63 Сырой вес г/репликацию 12,1 5,4 58 0,52 6,9 здоровые растения погибшие растения отсутствие всходов Таблица 15 Эффективность защиты грибковым штаммом J 76 цветной капусты, произрастающей в песчаной почве, зараженной грибком Rhizoctona solam Вегетационное испытание в теплице Обработка г Необработанные семена Протравливание жидким составом J 76 в количестве 107КОЕ/мл Процент появления всходов 92,7 Процент полностью здоровых растений 52,0 94,7 Сырой вес г /репликацию г/росток 21,7 0,79 72,0 24,1 0,84 Таблица 16 Эффективность защиты грибковым штаммом J 76 ячменя "Kustaa", произрастающего в песчаной почве, инокулированной грибком Fusanum mvale Вегетационное испытание на открытом воздухе, с прикрытием Обработка Здоровые семена Пораженные болезнью семена Протравливание жидким составом J 76 KF, 106КОЕ/мл Протравливание жидким составом J 76, 10бКОЕ/мл Процент появления всходов 93,3 73,3 Процент полностью здоровых растений 37,3 29,3 Индекс поражения (0 - 3) 0,91 1,43 Сырой вес, г/репликацию 8,9 7,8 80,0 52,0 0,91 9,7 81,3 52,0 0,93 10,3 Индекс поражения 0 здоровые растения 1 незначительное поражение 2 сильное поражение 3 отсутствие всходов 23 44889 24 Таблица 17 Эффективность воздействия грибкового штамма J 76 на грибок Alternana brassicicola, поражающий цветную капусту Результаты даны в виде средних значений для экспериментов, выполненных при трех разных температурах (15°С, 20°С и 25°С) Обработка Здоровые семена Пораженные болезнью семена Протравленные жидким составом J 76, 106КОЕ/мл Процент появления всходов 96 50 Индекс поражения (0 -3) 0,17 2,01 Сырой вес г/репликации 33,2 21,8 96 0,22 35,4 Индекс поражения 0 здоровые растения 1 незначительное поражение 2 сильное поражение 3 погибшие растения или отсутствие всходов Результаты экспериментов по выявлению эффективности воздействия пяти штаммов Nectna pityrodes по настоящему изобретению (J 76, J 1431, MOS 1 и ROS 2) на грибок Fusanum culmorum, поражающий пшеницу, приведены в таблице 18 Результаты даны в виде средних значений, полученных в двух экспериментах, в одном из которых в качестве субстрата использовали торф, а в другом - полевую почву Таблица 18 Эффективность воздействия пяти штаммов Nectna pityrodes (J 76, J 1431, J 1432, MOS 1 и ROS 2) на грибок Fusanum culmorum поражающий пшеницу Результаты даны в виде средних значений для двух вегетационных испытаний (торф и полевая почва) Обработка Пораженные болезнью семена Протравливание жидким составом J 76, 107КОЕ/мл Протравливание жидким составом J 1431, 107КОЕ/мл Протравливание жидким составом J 1432, 107КОЕ/мл Протравливание жидким составом MOS1, 107КОЕ/мл Протравливание жидким составом ROS2, 107КОЕ/мл Процент полностью здо- Индекс поражения ровых растений (0-3) 23 2,06 Сырой вес, г/репликацию 3,0 73 0,66 8,0 80 0,51 8,5 72 0,78 8,0 76 0,66 8,8 76 0,66 8,3 Индекс поражения 0 здоровые растения 1 незначительное поражение 2 сильное поражение 3 отсутствие всходов (С) Характер воздействия штамма J 76 Предварительные исследования характера воздействия штамма, J 76 в качестве антагониста других грибков производили с помощью микроскопа и лабораторных испытаний Наблюдения под микроскопом позволили установить, что гифы J 76 взаимодействуют с грибком F culmorum и первые отчетливо воспринимаемые реакции происходят очень быстро В местах соприкосновения мицелия клетки гифов грибка Fusanum начинают разлагаться примерно через час после взаимодействия Сначала клеточные стенки теряют свою форму, затем исчезает содержимое клеток, и, наконец, полностью разлагаются клеточные стенки Процесс разложения гифов грибка Fusanum медленно распространяется При выращивании смеси J 76 и F culmorum в течение нескольких дней гифы грибка Fusanum полностью пропадают Под действием штамма J 76 разлагаются также споры этого грибка (как конидии, так и хламидоспоры), но медленнее, чем гифы Обычно гифы штамма J 76 свободно обволакивают споры грибка Fusanum до их разложения Проникновение штамма J 76 в гифы грибка Fusanum не наблюдалось На основании наблюдений под микроскопом был сделан вывод о том, что штамм J 76 с орее всего выделяет в окружающую среду биологически активные вещества По своей природе они могут быть подобны ферментам или антибиотикам Действие штамма J 76 может быть связано с выработкой именно таких веществ, так как не было обнаружено признаков его паразитирования на других грибках, и вследствие медленного роста он не может эффективно бороться за питательные 25 44889 26 вещества При выполнении испытаний на целлоFusanum сохраняли путем последовательного фане были также высказаны предположения о заражения им растений (семена пшеницы инокувыделении этим грибком метаболитов, действуюлировали суспензией грибка Fusanum, после чего щих на рост других грибков патоген вновь выделяли из пораженных ростков) При выращивании штамма J 76 и F culmorum Суспензия антагониста Пеллету картофельв непосредственной близости друг от друга на ного агара с декстрозой, содержащую антагонист, очень тонком субстрате формируется зона ингибрали из морозильной камеры, делили натри часбирования, в которой прекращается рост грибка ти и помещали натри чашки картофельного агара Fusanum На субстрате нормальной толщины тас декстрозой Чашки инкубировали при комнатной кой эффект обнаружен не был Это, вероятно, температуре (в темноте) в течение трех недель связано с диффузией в субстрат выделяемых веОсновной раствор суспензии антагониста готовиществ в небольших концентрациях Кроме того, ли путем соскабливания содержимого из двух чабыло установлено, что летучие вещества, выдешек с антагонистом в 50мл дистиллированной ляемые штаммом J 76, также замедляют рост воды Полученную смесь перемешивали с помогрибка F culmorum щью гомогенизатора "Ультра-Турраке" Из основного раствора готовили два раствора - разведения Испытание на целлофане На субстрат, необд о Ю 1 и 10 3 ходимый для роста, помещали целлофановую пленку, на которой культивировали штамм J 76 Обработка семян На посеянные в горшки сеПосле культивирования в течение 10 дней пленку мена с помощью пипетки наносили сначала 1мл вместе со штаммом J 76 удаляли Вещества, высуспензии F culmorum, а затем 1мл суспензии деленные штаммом J 76 и прошедшие через антагониста 15 семян в пяти 50мл горшках обрапленку, оставались в субстрате В качестве конбатывали всеми шестью комбинациями суспензий трольных образцов использовали чашки, в котос разной плотностью спор (два разведения сусрые помещали целлофановую пленку без штамма пензии F culmorum x три разведения суспензии J 76 Результаты испытания на целлофане привеантагониста) дены в таблице 19 Контрольная обработка Для тестирования одного грибка использовали пять горшков, в которые дополнительно высевали 15 семян и обрабаТаблица 19 тывали только основным раствором испытуемого грибка Влияние метаболитов, выделяемых грибком J 76 В испытаниях на песке одновременно тестина рост грибка F culmorum при испытании на ровали от 15 до 30 грибковых штаммов В день целлофане, скорость роста дана в мм/день начала испытаний также производили посев в горшки, которые служили для проверки состояния J76 2,5 семян и патогенности инокулята F culmorum КонКонтрольный образец 6,2 трольные семена, посеянные в отдельную матрицу горшков, подвергали трем обработкам, которые (D) Выполнение метода скрининг-теста и включали, без инокуляции (только вода), инокуляоценка полученных результатов цию основным раствором F culmorum и инокуляИспытания в песке цию разбавленным основным раствором F Субстрат для посева culmorum (10 2 ) Каждую их этих трех обработок В качестве субстрата для посева использовапроизводили в отношении 30 семян, посеянных в ли песок с размером зерен 0,2 - 0,7мм Kaumston 10 горшков Sora Oy, Loimaa) Песок увлажняли путем смешиУсловия роста вания 4 частей песка с 1 частью воды Из матрицы После нанесения с помощью пипетки грибкопоследовательно расположенных горшков (VefiVP вых суспензий семена покрывали увлажненным 96), вырезали пластину размером 5x7 горшков песком Ящики с горшками заворачивали в про(емкостью 50мл), которую помещали в пластикозрачный пластик и переносили в камеру для вывый ящик Горшки наполняли увлажненным песращивания (температура 10° - 15°С, 14-часовой ком так, чтобы он не доходил до верхнего края на световой период) 1 - 1,5см В каждый горшок высевали потри зерна яровой пшеницы "Luja" Наблюдения После выращивания проростков в течение 16 Обработка - 18 дней их тщательно промывали в проточной Заражение грибком Fusanum culmorum Гриводопроводной воде и исследовали симптомы бок F culmorum выращивали на чашках картоболезни Ростки, у которых корневые или колеопфельного агара с декстрозой при комнатной темтильные клетки побурели, и непроросшие семена, пературе в течение 1 месяца (до полного оставшиеся твердыми, считались здоровыми Роспорообразования) Мицелий со спорами отделястки с отчетливыми симптомами болезни и непроли от чашки и смешивали с дистиллированной росшие семена, которые стали мягкими, были водой при помощи гомогенизатора "Ультрапризнаны больными Турракс" Количество спор доводили до Первыми исследовали растения, подвергав10 спор/мл Этот раствор замораживали в виде шиеся контрольной обработке Если из семян, 30мл порций в мешках "Мини-грип" до -20°С Для обработанных водой, развились только здоровые проведения испытаний замороженные растворы растения, и у семян, обработанных патогеном, оттаивали и вновь смешивали Этот раствор иснаблюдались четко выраженные симптомы болезпользовали как есть (основной раствор) и в виде ни, результаты испытания считались действиразбавления до 10 2 Патогенность штаммов 27 44889 28 тельными и производилась проверка растений, сушили на бумаге обработанных грибковыми штаммами F2 = Инокулирование грибком F culmorum производили так же, как в случав обработки F При испытании в песке оценку, присваиваеОбработку антагонистом выполняли так же, как в мую каждому выделенному грибковому штамму, случае обработки F0, с использованием основного определяли, исходя из количества обработанных раствора антагониста, разбавленного до 10 2 им растений, которые оказались больными Если всхожесть растений, обработанных испытуемым В торфе делали 10 рядков, в каждый из котогрибком, была значительно меньше, чем у конрых высевали по 30 семян Посев производили в трольных здоровых растений, или были обнаруследующей последовательности защитный ряд, жены симптомы другой болезни, этот грибок счиF, F0, F2, Т, F, F0, F2, Т, защитный ряд После потался непригодным для дальнейших сева семена покрывали торфом, который увлажисследований Если поражения отсутствовали, няли каждую из шести комбинаций плотности спор паУсловия роста тогена и спор испытуемого грибка оценивали отПосеянные семена выращивали в теплице при дельно по следующей шкале температуре около 15°С В темное время года при помощи лампы с несколькими нитями накалива0 = все 15 растений здоровы ния создавали дополнительное освещение в те1 = не более 2 пораженных растений чение 12 часов/день При необходимости посеян2 = 3 - 5 пораженных растений ные семена смачивали водой Период 3 = 6 - 9 пораженных растений культивирования составлял 18 дней 4 = 1 0 - 1 3 пораженных растений 5 = не более одного здорового растения Сортировка На основании шести вышеуказанных оценок Ростки промывали и определяли у них симвыбирали грибковые штаммы, которые использоптомы болезни аналогично тому, как это делали вали на следующем этапе испытаний, т е в испыпосле испытания в песке На основании результатаниях в торфе Для последующих испытаний бытов наблюдений, полученных после обработок Т и ли отобраны такие штаммы, которые не менее F,принимали решение о достоверности испытатрех раз получали оценки 0 и 1 Если грибок не ния У здоровых контрольных растений (Т) не дополучил ни одной оценки 0, его отбирали для попускалось наличие более 12 пораженных растеследующих исследований, если он получал не ний (из 60 посеянных семян), а в контрольной менее четырех раз оценку 1 группе (F), зараженной патогеном, должно было быть не менее 52 пораженных растений (из 60 Испытания в торфе семян) Испытуемый грибковый штамм считался Субстрат для выращивания приемлемым для следующего этапа испытаний В качестве субстрата для выращивания ис(опыты в полевой почве), если из семян (60 сепользовали пропаренный, удобренный и известмян), обработанных раствором, имеющим одну из кованный торф До осени 1992 г применяли недвух концентраций, развивалось не более 19 попросеянный неочищенный торф из Торронсуо, а раженных растений затем просеянный неочищенный торф из Эруахоки (Внесение удобрений 800г доломитовой изИспытания в полевой почве вести и ЮОг удобрения Y-lannos/ЮОл торфа (YСубстрат для посева lannos = в торговая марка, означающая финское Используемую почву (песчаная глина) брали с универсальное удобрение) Увлажненный торф опытного поля в Хокиойнене Почву измельчали помещали в пластиковые ящики (28,5x49,5x9,4см, руками или (зимой 1992-1993 г г) просеивали чеящик "Mammut" компании Weibulls Robusta, рез грохот с отверстиями размером 1x1 см ПлаMuoviyhtyma Оу) в виде слоя толщиной 5см На стиковые горшки емкостью 1,5л (диаметром 14см) дно ящика клали пластиковую пленку заполняли почвой так, чтобы верхний край оставался пустым на высоту 3 - 4см На дно горшка Обработка клали фильтровальную бумагу Т = Здоровые, неинокулированные семена яровой пшеницы "Luja" Обработка Полив производили дистиллированной водой 1 Здоровые семена Смоченные только дистиллированной водой F = Семена, инокулированные грибком F culmorum Семена вымачивали в основном рас2 Контрольная группа, обработанная грибком творе F culmorum (раствор использовали в избыFusanum Семена смачивали инокулянтом точном количестве), содержащем примерно Fusanum (препарат, используемый в испытаниях в 106спор/мл (культивирование грибка Fusanum песке), содержащим 106спор/мл, этот раствор иссравни с испытанием в песке) После обработки пользовали в избыточном количестве семена рассыпали на бумаге и оставляли для вы3 Инокулирование, произведенное так же, как сушивания на ночь в контрольной группе, обработанной грибком Fusanum После высыхания семян их обрабатыF0 = Инокулирование грибком F culmorum вали суспензией антагониста, которую получали производили так же, как в случае обработки F путем смешивания мицелия и спор из одной чашКогда семена высыхали, их смачивали основным ки с 25мл дистиллированной воды Обработку раствором антагониста Основной раствор полупроизводили в пластиковой склянке, куда помечали путем соскабливания мицелия и спор из одщали 130 семян (120 - 150 семян) и 1мл (или ной чашки антагониста в 25мл дистиллированной 1,5мл) суспензии антагониста воды Обработку производили посредством встряхивания семян и раствора антагониста в малень4 Контрольная группа, обработанная фунгикой пластиковой склянке После обработки семена цидом Инокулирование производили так же, как в 29 44889 30 контрольной группе, обработанной Fusanum ПоВо время испытаний в песке и торфе непрасле высыхания семена обрабатывали 2г протраввильно было забраковано всего несколько грибливающего порошка "Байтан 1" на один кг семян ков С другой стороны, при испытании в почве быКроме того, производили ранее применявшиеся ло отвергнуто достаточно большое количество обработки составами "Серезан" и "Тайссато S " очень хороших изолятов, но из тех изолятов, которые были отобраны для полевых опытов, лишь В горшки высевали по 36 обработанных седва из 15 показали отрицательные результаты в мян, по три дубликата на каждую обработку Поестественных условиях сеянные семена покрывали полевой почвой Условия роста были такими же, как при испытании в На основании полученных результатов можно торфе Период культивирования составлял четысделать вывод о том, что испытания в песке и ре недели торфе позволяют надежно отобрать лучшие антагонисты для дальнейших исследований, а вот во Проверка и сортировка время испытаний в полевой почве могут быть заРостки промывали и оценивали у них симбракованы даже хорошие антагонисты птомы болезни 0 = полностью здоровые растения, Отборочные испытания грибкового штамма J 1 = незначительное поражение грибком 1431 Fusanum, Из грибковых штаммов по настоящему изобретению штамм J 1431 исследовали во всех трех 2 = от среднего до сильного поражения болезотборочных испытаниях, выполненных в теплице нью, 3 = ростки полностью побурели - гибель расПри испытании в песке штамм J 1431 получил тений оценки 0, 0, 1, 1, 1 и 2 и был отобран для последующих испытаний Эффективность испытаний в теплице Летом 1993 г был проведен один широкомасПри испытании в торфе с использованием штабный полевой опыт по проверке метода скриштамма J 1431 были получены следующие ренинг-теста по настоящему изобретению В ходе зультаты этого испытания проверяли, правильно ли были Т 3 пораженных растения выбраны для дальнейшего тестирования грибкоF 36 пораженных растений вые штаммы, выделенные во время серии опытов, F0 3 пораженных растения проведенных между октябрем 1991 г и февралем F2 7 пораженных растений 1993 г Для обработки семян произвольно выбиВо время испытаний в полевой почве с исрали 60 штаммов из тех, которые были отвергнуты пользованием штамма J 1431 при выполнении при испытаниях в песке, но не оказали патогенноразных обработок были получены следующие го воздействия на пшеницу Из штаммов, забракопроцентные значений пораженных ростков ванных во время испытаний в торфе, отобрали 92 здоровые растения 66% штамма Были отобраны все 58 грибков, испольконтрольная группа, обработанная зовавшихся во время испытаний в почве 43 грибгрибком Fusanum 87% ка были забракованы во время этого испытания и протравливание составом "Байтан 1" 31% 15 были отобраны для полевых опытов J1431 19% Помимо вышеуказанных 210 обработок испыНа основании отборочных испытаний, проветание включало 6 контрольных обработок необденных летом 1993 г, штамм J 1431 был отобран работанные семена (К), протрав-ливание состадля полевых опытов вместе с 61 другим грибковом "Байтан 1" (В) и четыре грибковых штамма, вым штаммом В этом испытании использовали исследованных в предыдущих испытаниях, в том яровую пшеницу "Luja", искусственно инокулирочисле J 76 ванную суспензией спор грибка F culmorum Семена высевали на однорядных делянках (1,4м) В этом испытании использовали пшеницу при шестикратном дублировании этого опыта Че"Luja", зараженную грибком F culmorum естестрез 34 дня после посева ростки выкапывали из венным путем Наблюдения велись за рядом длипочвы, промывали и определяли симптомы боной 1,4м, в котором было посеяно 5,5г семян Для лезни При разных обработках было получено укавыполнения всех 216 обработок было посеяно занное ниже количество здоровых ростков на метр шесть дублирующих рядов Рендомизация достиряда галась с помощью кубической решетки экспериментальной конструкции Таким образом, уменьконтрольная группа, обработанная шали ошибочные вариации, связанные с грибком Fusanum 5,9 почвенными факторами Через пять недель после протравливание составом "Байтан 1" 56 посева ростки выкапывали из почвы, подсчитыJ76 61 вали и исследовали симптомы болезни J1431 65 Результаты испытания иллюстрируют четыре 30другие испытанные штаммы гистограммы, приведенные на рис с За по 3d Ме38 жду изолятами, забракованными во время испыОтборочные испытания грибкового штамма J тания в торфе, и непатогенными изолятами, за1432 бракованными во время испытания в песке, не Штамм J 1432 исследовали во всех трех отбобыло обнаружено никаких различий Испытание в рочных испытаниях, выполненных в теплице торфе дало очень хорошие результаты Штаммы, При испытании в песке 1432 получали оценки отобранные после него для последующих испыта0, 0, 0, 1, 1 и 2 и был отобран для последующих ний, были в среднем гораздо лучше, чем отвергиспытаний нутые в ходе испытания грибки При испытании в торфе с использованием 44889 32 31 штамма J 1432 были получены следующие репротравливание составом "Байтан 1" 18% зультаты J1432 38% Т 10 пораженных растений На основании результатов испытания в полеF 60 пораженных растений вой почве штамм J 1432 был изъят из полевых опытов F0 10 пораженных растений F2 37 пораженных растений Микроорганизмы, внесенные в банк данных На основании Будапештского договора слеВо время испытания в полевой почве с исдующие микроорганизмы были внесены в банк пользованием штамма J 1432 при разных обраданных по адресу DSM-Deutsehe Sammlung von ботках были получены следующие процентные Mikroorganesmen und Zellkulteren GmbH, значения пораженных ростков Maseheroder Weg 1b, D-38124 Брауншвейг, Гермаздоровые растения 56% ния контрольная группа, обработанная грибком Fusanum 98% Микроорганизм pityrodes Montagne J 76 pityrodes Montagne J 1431 pityrodes Montagne J 1432 pityrodes Montagne MOS 1 pityrodes Montagne ROS 2 Nectria Nectria Nectria Nectria Nectria Номер в банке данных DSM 7522 DSM 8805 DSM 8806 DSM 8807 DSM 8808 Дата регистрации в банке данных 15 марта 1993 г 10 декабря 1993 г 10 декабря 1993 г 10 декабря 1993 г 10 декабря 1993 г - Q = —