Інгібітори cdc7

Реферат: Цей винахід пропонує ізоіндолінонові сполуки або їх фармацевтично прийнятні солі, які пригнічують CDC7 і отже можуть бути корисними при лікуванні раку. UA 116125 C2 (12) UA 116125 C2 UA 116125 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цей винахід стосується ізоіндолінонових сполук або їх фармацевтично прийнятних солей, які пригнічують CDC7, і які можуть бути корисними у лікуванні раку. CDC7 являє собою серин/треонін кіназу, яка відіграє ключову роль в ініціації реплікації ДНК і регуляції звіряльної точки S-фази клітинного циклу. Активація CDC7 спостерігається в численних лініях пухлинних клітин. Крім того, пригнічування CDC7 в таких клітинних лініях спричинює зупинення клітинного циклу. Тому пригнічування CDC7 може бути корисним у лікуванні раку. Інгібітори CDC7 відомі в цій галузі. Ізоіндолінонові сполуки також відомі в цій галузі. У WO 2005/100351 розкриті деякі ізоіндолінонові сполуки як сполуки, які реагують з нікотиновими ацетилхоліновими рецепторами. Потреба у створенні альтернативних інгібіторів CDC7 для лікування раку залишається. Відповідно цей винахід пропонує інгібітори CDC7, які можуть бути корисними для лікування раку. Цим винаходом запропонована сполука, яка являє собою 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом запропонована сполука, яка являє собою 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 2, або її фармацевтично прийнятна сіль. Цим винаходом запропонована сполука, яка являє собою 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 1, або її фармацевтично прийнятна сіль. За конкретним варіантом здійснення цим винаходом запропонована сполука, яка являє собою 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он. За іншим конкретним варіантом здійснення цим винаходом запропонована сполука, яка являє собою 3-(5фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 2. За ще одним конкретним варіантом здійснення цим винаходом запропонована сполука, яка являє собою 3-(5фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 1. Цим винаходом запропонована фармацевтична композиція, що містить 3-(5фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он або його фармацевтично прийнятну сіль і фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач. Цим винаходом запропонована фармацевтична композиція, що містить 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он і фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач. Цим винаходом запропонована також фармацевтична композиція, що містить 3-(5фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 2, або його фармацевтично прийнятну сіль, і фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач. Крім того, цим винаходом запропонована фармацевтична композиція, що містить 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 2, і фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач. Цим винаходом запропонована також фармацевтична композиція, що містить 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 1, або його фармацевтично прийнятну сіль, і фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач. Крім того, цим винаходом запропонована фармацевтична композиція, що містить 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 1, і фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач. Цим винаходом запропонований спосіб лікування раку, що включає введення пацієнту, який цього потребує, ефективної кількості 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-ону або його фармацевтично прийнятної солі. Цим винаходом запропонований спосіб лікування раку, що включає введення пацієнту, який цього потребує, ефективної кількості 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону. Цим винаходом запропонований також спосіб лікування раку, що включає введення пацієнту, який цього потребує, ефективної кількості 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін1-ону, ізомеру 2, або його фармацевтично прийнятної солі. Крім того, цим винаходом запропонований спосіб лікування раку, що включає введення пацієнту, який цього потребує, ефективної кількості 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону, ізомеру 2. Цим винаходом запропонований також спосіб лікування раку, що включає введення пацієнту, який цього потребує, ефективної кількості 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1Hпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону, ізомеру 1, або його фармацевтично прийнятної солі. Крім того, цим винаходом запропонований спосіб лікування раку, що включає введення пацієнту, який цього потребує, ефективної кількості 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін1-ону, ізомеру 1. Цим винаходом запропонований(-а) 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он або його фармацевтично прийнятна сіль для застосування в терапії. Цим винаходом запропонований(-а) 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін1-он або його фармацевтично прийнятна сіль для застосування в лікуванні раку. Цим 1 UA 116125 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходом запропонована фармацевтична композиція для застосування в лікуванні раку, і ця фармацевтична композиція містить 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он або його фармацевтично прийнятну сіль. Цим винаходом запропонований 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он для застосування в терапії. Цим винаходом запропонований 3-(5фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он для застосування в лікуванні раку. Цим винаходом запропонована фармацевтична композиція для застосування в лікуванні раку, і ця фармацевтична композиція містить 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он. Цим винаходом запропонований(-а) 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 2, або його фармацевтично прийнятна сіль для застосування в терапії. Цим винаходом запропонований(-а) 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 2, або його фармацевтично прийнятна сіль для застосування в лікуванні раку. Цим винаходом запропонована фармацевтична композиція для застосування в лікуванні раку, і ця фармацевтична композиція містить 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1Hпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 2, або його фармацевтично прийнятну сіль. Цим винаходом запропонований 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 2, для застосування в терапії. Цим винаходом запропонований 3-(5фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 2, для застосування в лікуванні раку. Цим винаходом запропонована фармацевтична композиція для застосування в лікуванні раку, і ця фармацевтична композиція містить 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1Hпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 2. Цим винаходом запропонований(-а) 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 1, або його фармацевтично прийнятна сіль для застосування в терапії. Цим винаходом запропонований(-а) 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 1, або його фармацевтично прийнятна сіль для застосування в лікуванні раку. Цим винаходом запропонована фармацевтична композиція для застосування в лікуванні раку, і ця фармацевтична композиція містить 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1Hпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 1, або його фармацевтично прийнятну сіль. Цим винаходом запропонований 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 1, для застосування в терапії. Цим винаходом запропонований 3-(5фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 1, для застосування в лікуванні раку. Цим винаходом запропонована фармацевтична композиція для застосування в лікуванні раку, і ця фармацевтична композиція містить 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1Hпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 1. Цим винаходом запропоноване застосування 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1Hпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону або його фармацевтично прийнятної солі у виготовленні лікарського засобу для лікування раку. Цим винаходом запропоноване також застосування 3-(5фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону у виготовленні лікарського засобу для лікування раку. Цим винаходом запропоноване застосування 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1Hпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону, ізомеру 2, або його фармацевтично прийнятної солі у виготовленні лікарського засобу для лікування раку. Цим винаходом запропоноване також застосування 3-(5фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону, ізомеру 2, у виготовленні лікарського засобу для лікування раку. Цим винаходом запропоноване застосування 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1Hпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону, ізомеру 1, або його фармацевтично прийнятної солі у виготовленні лікарського засобу для лікування раку. Цим винаходом запропоноване також застосування 3-(5фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону, ізомеру 1, у виготовленні лікарського засобу для лікування раку. Цим винаходом запропонований 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-ону, ізомеру 2, гідрат в кристалічній формі. Цим винаходом запропонований також 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону, ізомеру 2, гідрат в кристалічній формі, який характеризується порошковою рентгенограмою, що має характеристичні піки при кутах 20,2, які мають значення 22,27 та одне або більше з-посеред 13,46, 16,54, 16,66, 18,10 і 23,13. Цим винаходом запропонована сполука, яка являє собою 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 2, або фармацевтично прийнятна сіль цієї сполуки, які альтернативно ідентифіковані як (3R)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1Hпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-он або фармацевтично прийнятна сіль цієї сполуки. 2 UA 116125 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Цим винаходом запропонована сполука, яка являє собою 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, ізомер 1, або фармацевтично прийнятна сіль цієї сполуки, які альтернативно ідентифіковані як (3S)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1Hпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-он або фармацевтично прийнятна сіль цієї сполуки. За конкретним варіантом здійснення цим винаходом запропонована сполука, яка являє собою (3R)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он. За ще одним конкретним варіантом здійснення цим винаходом запропонована сполука, яка являє собою (3S)3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он. Цим винаходом запропонована також фармацевтична композиція, що містить (3R)-3-(5фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он або його фармацевтично прийнятну сіль і фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач. Крім того, цим винаходом запропонована фармацевтична композиція, що містить (3R)-3-(5-фторопіримідин-4іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он і фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач. Цим винаходом запропонована також фармацевтична композиція, що містить (3S)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он або його фармацевтично прийнятну сіль і фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач. Крім того, цим винаходом запропонована фармацевтична композиція, що містить (3S)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он і фармацевтично прийнятний носій, розріджувач або наповнювач. Цим винаходом запропонований(-а) (3R)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он або його фармацевтично прийнятна сіль для застосування в терапії. Цим винаходом запропонований(-а) (3R)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он або його фармацевтично прийнятна сіль для застосування в лікуванні раку. Цим винаходом запропонована фармацевтична композиція для застосування в лікуванні раку, і ця фармацевтична композиція містить (3R)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он або його фармацевтично прийнятну сіль. Цим винаходом запропонований (3R)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он для застосування в терапії. Цим винаходом запропонований (3R)-3-(5фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он для застосування в лікуванні раку. Цим винаходом запропонована фармацевтична композиція для застосування в лікуванні раку, і ця фармацевтична композиція містить (3R)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1Hпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-он. Цим винаходом запропонований(-а) (3S)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он або його фармацевтично прийнятна сіль для застосування в терапії. Цим винаходом запропонований(-а) (3S)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он або його фармацевтично прийнятна сіль для застосування в лікуванні раку. Цим винаходом запропонована фармацевтична композиція для застосування в лікуванні раку, і ця фармацевтична композиція містить (3S)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он або його фармацевтично прийнятну сіль. Цим винаходом запропонований (3S)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он для застосування в терапії. Цим винаходом запропонований (3S)-3-(5фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он для застосування в лікуванні раку. Цим винаходом запропонована фармацевтична композиція для застосування в лікуванні раку, і ця фармацевтична композиція містить (3S)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1Hпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-он. Цим винаходом запропоноване застосування (3R)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1Hпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону або його фармацевтично прийнятної солі у виготовленні лікарського засобу для лікування раку. Цим винаходом запропоноване також застосування (3R)3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону у виготовленні лікарського засобу для лікування раку. Цим винаходом запропоноване застосування (3S)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1Hпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону або його фармацевтично прийнятної солі у виготовленні лікарського засобу для лікування раку. Цим винаходом запропоноване також застосування (3S)3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону у виготовленні лікарського засобу для лікування раку. Цим винаходом запропонований (3R)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-ону, гідрат в кристалічній формі. Цим винаходом запропонований також (3R)-3-(5фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону, гідрат в кристалічній формі, який характеризується порошковою рентгенограмою, що має характеристичні піки при кутах 20,2, які мають значення 22,27 та одне або більше з-посеред 13,46, 16,54, 16,66, 18,10 і 23,13. 3 UA 116125 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Крім того, цим винаходом запропоновані переважні варіанти здійснення способів і застосувань, розглянуті у цьому описі, у яких рак вибирають з групи, яку складають рак молочної залози, тричі негативний рак молочної залози, рак яєчника, рак легенів, рак ободової та прямої кишки, рак гемобластоз і лейкоз. Слід розуміти, що у наведеному вище і в усьому описі цього винаходу наведені нижче терміни, якщо не вказано інше, мають такі значення: "Фармацевтично прийнятним носієм, розріджувачем або наповнювачем" є середовище, загальноприйняте у цій галузі для доставки біологічно активних агентів ссавцям, наприклад, людині. "Фармацевтично прийнятні солі"  означає відносно нетоксичні неорганічні і органічні солі сполук за цим винаходом. "Ефективна кількість"  означає кількість сполуки або її фармацевтично прийнятної солі за цим винаходом чи фармацевтичної композиції, що містить сполуку або її фармацевтично прийнятну сіль за цим винаходом, яка буде викликати біологічну або медичну реакцію, чи справляти бажаний терапевтичний ефект на тканину, систему, тварину, ссавця або людину, якого бажає досягти дослідник, ветеринар, лікар або інший клініцист. Терміни "лікування", "лікувати" і т.п. охоплюють уповільнення або обертання напрямку прогресування розладу. Ці терміни також охоплюють полегшення, поліпшення, послаблення, усунення або зменшення одного або декількох симптомів розладу або стану, навіть якщо цей розлад або стан практично не усувається, і навіть якщо прогресування вказаного захворювання або стану само по собі не уповільнюється або не змінює напрямок розвитку. Сполуки за цим винаходом здатні реагувати, наприклад, з численними неорганічними і органічними кислотами, та утворювати фармацевтично прийнятні солі. Такі фармацевтично прийнятні солі і загальні методики їх одержання добре відомі в цій галузі. Дивись, наприклад, P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S.M. Berge, et al., “Pharmaceutical Salts, “ Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No. 1, January 1977. Сполуки за цим винаходом за варіантом, якому надають перевагу, виготовляють як фармацевтичні композиції з використанням фармацевтично прийнятного носія, розріджувача або наповнювача, і вводять різними шляхами. Переважно такі композиції призначені для перорального введення. Такі фармацевтичні композиції і способи їх одержання добре відомі в цій галузі. Дивись, наприклад, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et al., eds., 21st ed., Mack Publishing Co., 2005). Фактично введена кількість сполуки за цим винаходом визначатиметься лікарем на підставі відповідних обставин, в тому числі стану, який підлягає лікуванню, обраного шляху введення, фактично введеної сполуки або сполук за цим винаходом, віку, маси і реакції окремого пацієнта і тяжкості симптомів пацієнта. Добові дози звичайно знаходяться в діапазоні від приблизно 1 мг до приблизно 1000 мг. У деяких випадках рівні доз, які не перевищують нижню межу вищевказаного діапазону, можуть бути більш ніж достатніми, тоді як в інших випадках можуть бути застосовані дози, які перевищують верхню межу вищевказаного діапазону. Рівні доз можуть визначатися фахівцем у цій галузі. Сполуки за цим винаходом або їх фармацевтично прийнятні солі можуть бути одержані різними способами, відомими в цій галузі, а також способами, які описані в наведених нижче Препаративних методиках і Прикладах. Конкретні стадії синтезу для кожного з описаних шляхів можуть комбінуватися різними способами для одержання сполук за цим винаходом або їх фармацевтично прийнятних солей. Реагенти та вихідні матеріали в цілому є легко доступними для фахівця у цій галузі. Інші можуть бути одержані із застосуванням стандартних методів органічної хімії та хімії гетероциклічних сполук, методів, які є відомими фахівцю у цій галузі, і методів, описаних у наведених нижче Прикладах, включаючи будь-які нові методи. Наведені нижче Препаративні методики і Приклади пояснюють цей винахід. Сполуки, описані у цьому документі, названі та нумеровані із застосуванням програмного продукту Symyx Draw версії 3.2, Symyx Draw версії 4.0 або IUPACNAME ACDLABS. Індивідуальні ізомери, енантіомери або діастереомери можуть бути розділені або відокремлені фахівцем в цій галузі на будь-якій зручній стадії синтезу сполук певними методами, такими як селективна кристалізація або хіральна хроматографія (дивися, наприклад, Enantiomers, Racemates, and Resolutions (J. Jacques, et al., John Wiley and Sons, Inc., 1981)). Позначення "Ізомер 1" стосується сполуки, яка елююється при хіральній хроматографії в першу чергу. Позначення "Ізомер 2" стосується сполуки, яка елююється при хіральній хроматографії другою. 4 UA 116125 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Вживані у цьому описі терміни, які наведені нижче, мають такі значення: "ADP" означає аденозиндифосфат; "ATP" означає аденозинтрифосфат; "BALB/c" означає мишей-альбіносів; "BCA" означає біцинхонінову кислоту; "DMSO" означає диметилсульфоксид; "DTT" означає дитіотреїтол; "EDTA" означає етилендіамінтетраоцтову кислоту; "ee" означає енантіомерний надлишок; "Пр" означає приклад; "FBS" означає ембріональну бичачу сироватку; "FP" означає флуоресцентну поляризацію; "GAPDH" означає гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназу; "HEC" означає гідроксиетилцелюлозу; "HEPES" означає 4-(2-гідроксиетил)-1піперазинетансульфонову кислоту; "год" означає годину або години; "IC 50" означає концентрацію засобу, яка спричинює 50% максимальної пригнічувальної реакції, можливої для цього засобу; "IVTI" означає in vivo цільове пригнічування; "MCM2" означає білок підтримки мініхромосом; "хв" означає хвилину або хвилини; "PBS" означає забуферений фосфатом фізіологічний розчин; "P.O." означає пероральне введення; "Препар" означає препаративну методику; "PVDF" означає полівінилідиндифторид; "RPMI" означає Roswell Park Memorial Institute (Інститут раку імені Розуелла Парка); "RNase" означає рибонуклеазу; "RuPhos" означає 2-дициклогексилфосфіно-2',6'-діізопропоксибіфеніл; "Rt" означає час утримування; "SDS-PAGE" означає електрофорез у поліакриламідному гелі у присутності додецилсульфату натрію; "SCX" означає сильний катіонний обмін; "SFC" означає надкритичну рідинну хроматографію; і "THF" означає тетрагідрофуран. Препаративна методика 1 Метил-5-бром-2-йодобензоат 5-бром-2-йодобензойну кислоту (1998 г, 6,11 моль) порціями додають в розчин (20°C) сірчаної кислоти (100 мл) в метанолі (13 л). Суспензію гріють при кипінні зі зворотним холодильником протягом 24 год, потім охолоджують до температури 20°С, і видаляють розчинник при зниженому тиску. Залишок вливають в суміш (1:1) метил-трет-бутилового ефіру і талої води (20 л), і розділяють фази. Водну фазу екстрагують метил-трет-бутиловим ефіром (1,5 л), органічні фази змішують, і промивають водним 0,2 М розчином NaOH (5 л), насиченим водним розчином хлориду натрію, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і упарюють при зниженому тиску. Неочищений продукт розчиняють при 40-45°С в петролейному ефірі (10 л), фільтрують через шар діатомової землі, і упарюють при зниженому тиску. Залишок розчиняють в петролейному ефірі (5 л), і охолоджують до температури -50°С, відфільтровують перші зібрані тверді речовини, промивають вказані тверді речовини петролейним ефіром, що має температуру танення льоду. Маточний розчин упарюють, повторно розчиняють тверду речовину в петролейному ефірі (1 л), охолоджують до температури -50°С, і відфільтровують другий збір. Перший і другий збори змішують, сушать на відкритому повітрі, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини жовтого кольору (1880 г, 90%). Препаративна методика 2 Метил-5-бром-2-етилбензоат Діетилцинк (3050 мл, 3,05 моль, 1 М розчин у гексані) протягом 3 год додають в розчин (5C) метил-5-бром-2-йодобензоату (1876 г, 5,50 моль) і (1,1'-біс(дифенілфосфіно)фероцен)паладію (II) хлориду (40 г, 0,05 моль). Суміш гріють при температурі 60-65°С протягом 2 год, і перемішують протягом іще 2 год, потім охолоджують до температури 10-15°C, і виливають у водний 1 М розчин HCl (10 л), що має температуру танення льоду. Фази розділяють, екстрагують водний шар метил-трет-бутиловим ефіром (210 л), органічні фази змішують, промивають насиченим водним розчином хлориду натрію, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і упарюють при зниженому тиску. Розчиняють в етилацетаті (400 мл), і додають петролейний ефір (8 л), потім відстоюють при температурі 15-20°С протягом 16 год, фільтрують через шар силікагелю, промивають сумішшю етилацетат/петролейний ефір (1:20, 8 л), і упарюють фільтрат при зниженому тиску, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді 79 81 масла блідо-жовтого кольору (1306 г, 96%). ES/MS m/е: ( Br/ Br) 243/245 (М+Н). 5 UA 116125 C2 Препаративна методика 3 Метил-5-бром-2-(1-брометил)бензоат 5 10 15 20 25 30 35 40 N-бромсукцинімід (1090 г, 6,12 моль) і 2,2'-азо-біс-ізобутиронітрил (11,4 г, 0,069 моль) додають в розчин (20°C) метил-5-бром-2-етилбензоату (1296 г, 5,33 моль) в чотирихлористому вуглеці (7 л). Гріють при кипінні зі зворотним холодильником протягом 4 год, охолоджують до температури 20-30°C, і промивають водою (10 л), водну фазу екстрагують дихлорметаном (5 л), органічні шари змішують, і промивають водою (10 л), Na2SO3 (5 л), і насиченим водним розчином хлориду натрію. Сушать над сульфатом натрію, фільтрують, упарюють при зниженому тиску, і одержують вказану в заголовку сполуку у вигляді твердої речовини блідожовтого кольору (1791 г, 104% неочищеної речовини). ES/MS m/z: 241 (М-HBr). Препаративна методика 4 6-бром-2-[(1R)-1-(4-метоксифеніл)етил]-3-метилізоіндолін-1-он Твердий метил-5-бром-2-(1-брометил)бензоат (1724 г, 5,35 моль) додають у наявний у продажу розчин (R)-1-(4-метоксифеніл)етанаміну (компанія BePharm, WZG111219-071; 974 г, 6,44 моль) і триетиламіну (1710 мл, 12,26 ммоль) у метанолі (12 л). Суміш гріють протягом 10 год при температурі 67°С, після чого випарюють насухо при зниженому тиску. Залишок розділяють етилацетатом (5 л) і водним 1н розчином HCl (10 л), фази відокремлюють, органічну фазу знову промивають водним 1н розчином HCl (5 л), насиченим розчином бікарбонату натрію, насиченим водним розчином хлориду натрію, після чого сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і упарюють при зниженому тиску. Масло темно-червоного кольору розчиняють в метил-трет-бутиловому ефірі (750 мл), і додають петролейний ефір (3 л) при інтенсивному перемішуванні. Тверді речовини відфільтровують, промивають сумішшю метил-трет-бутиловий ефір/петролейний ефір (1:8), петролейним ефіром, і сушать на відкритому повітрі до одержання вказаної в заголовку сполуки у вигляді твердої речовини не зовсім білого кольору (1014 г, 52%). ES/MS m/z: 360 (М+Н). Препаративна методика 5 2-[(1R)-1-(4-метоксифеніл)етил]-3-метил-6-(1-тетрагідропіран-2-ілпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-он 6-бром-2-[(1R)-1-(4-метоксифеніл)етил]-3-метилізоіндолін-1-он (64 г, 177 ммоль), 1(тетрагідро-2Н-піран-2-іл)-4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-діоксаборолан-2-іл)-1Н-піразол (67 г, 295 ммоль), карбонат калію (70 г, 506 ммоль), (1,1'-біс(дифенілфосфіно)фероцен)паладію (II) хлорид (9 г, 11 ммоль), діоксан (800 мл) і воду (212 мл) змішують в атмосфері азоту, і гріють при температурі 70-75°С протягом 16 год. Додають 1-(тетрагідро-2Н-піран-2-іл)-4-(4,4,5,5тетраметил-1,3,2-діоксаборолан-2-іл)-1H-піразол (15 г, 54 ммоль), і гріють при температурі 8085°C протягом 2 год. Концентрують при зниженому тиску до 200 мл, додають етилацетат (500 мл) і воду (500 мл), перемішують протягом 30 хв, і відфільтровують тверді речовини. Тверді речовини і органічний шар змішують, і випарюють при зниженому тиску. Залишок розчиняють в дихлорметані, і фільтрують через шар силікагелю. Шар силікагелю промивають сумішшю дихлорметан/етилацетат (1:0), і потім (2:1), і випарюють насухо при зниженому тиску. 6 UA 116125 C2 5 10 15 20 25 30 Тверду речовину суспендують в суміші (2:1) петролейний ефір/етилацетат (600 мл) протягом 30 хв при температурі 25-30°C, і фільтрують для збирання твердої речовини до одержання вказаної в заголовку сполуки у вигляді твердої речовини не зовсім білого кольору (68 г, 89%). ES/MS m/z: 432 (М+Н). Препаративна методика 6 3-(6-хлор-5-фторопіримідин-4-іл)-2-[(1R)-1-(4-метоксифеніл)етил]-3-метил-6-(1тетрагідропіран-2-ілпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-он Біс(триметилсиліл)амід натрію (210 мл, 210 ммоль, 1 М розчин в THF) краплями протягом 60 хв додають в суспензію 2-[(1R)-1-(4-метоксифеніл)етил]-3-метил-6-(1-тетрагідропіран-2-ілпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону (62 г, 144 ммоль) і 4,6-дихлор-5-фторопіримідину (31 г, 186 ммоль) у тетрагідрофурані (620 мл), що має температуру танення льоду. Розчин перемішують протягом 60 хв при температурі 0°C, після чого суміш розбавляють етилацетатом (1 л) і водою (1 л). Органічну фазу промивають насиченим водним розчином хлориду натрію, і випарюють при зниженому тиску. Залишок розчиняють в суміші (1:1) петролейний ефір/етилацетат, фільтрують через шар силікагелю, і упарюють до одержання вказаної в заголовку сполуки у вигляді піни жовтого кольору (83 г, 103%). ES/MS m/z: 562 (М+Н). Препаративна методика 7 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-2-[(1R)-1-(4-метоксифеніл)етил]-3-метил-6-(1-тетрагідропіран-2ілпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-он Триетиламін (40 мл, 287 ммоль) і 20% гідроксид паладію на вуглеці (14 г) додають до розчину 3-(6-хлор-5-фторопіримідин-4-іл)-2-[(1R)-1-(4-метоксифеніл)етил]-3-метил-6-(1тетрагідропіран-2-іл-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону (80 г, 142 ммоль) у етилацетаті (2,1 л), і 2 гідрогенізують газоподібним воднем (30 фунтів/дюйм (0,2 МПа)) при температурі 20-25°C протягом 16 год. Умови реакції повторюють з 5 г 3-(6-хлор-5-фторопіримідин-4-іл)-2-[(1R)-1-(4метоксифеніл)етил]-3-метил-6-(1-тетрагідропіран-2-іл-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону. Обидві реакційні суміші змішують, фільтрують через діатомову землю, і упарюють до одержання вказаної в заголовку сполуки у вигляді піни жовтого кольору (77 г, 102%). ES/MS m/z: 528 (М+Н). Препаративна методика 8 6-бром-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-2-[(1R)-1-(4-метоксифеніл)етил]-3-метилізоіндолін-1-он 7 UA 116125 C2 5 10 6-бром-2-[(1R)-1-(4-метоксифеніл)етил]-3-метилізоіндолін-1-он (2,814 ммоль, 1,014 г) розчиняють в тетрагідрофурані (28 мл). Додають 4-хлор-5-фторопіримідин (5,628 ммоль, 518 мкл), і охолоджують до температури 0°С. Протягом 7 хв додають гексаметилдисилазид калію (4,502 ммоль, 9 мл, 0,5 М розчин в толуолі), і перемішують протягом 1 год, потім нагрівають до температури навколишнього середовища, і перемішують протягом 90 хв. Виливають в метил-трет-бутиловий ефір і водний 1 М розчин HCl, додають воду, і шари розділяють. Промивають водним 1н розчином HCl, фільтрують, промивають насиченим водним розчином хлориду натрію, сушать над сульфатом магнію, фільтрують через 2 см шар силікагелю, і упарюють при зниженому тиску, до одержання масла. Очищають на силікагелі сумішшю 20-40% етилацетат/гексан до одержання вказаної в заголовку сполуки у вигляді піни (547 мг, 43%). ES/MS m/z: 456 (М+Н). Приклад 1 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он 15 20 25 30 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-2-[(1R)-1-(4-метоксифеніл)етил]-3-метил-6-(1-тетрагідропіран-2ілпіразол-4-іл)ізоіндолін-1-он (65 г, 123 ммоль) розчиняють у трифтороцтовій кислоті (600 мл), і гріють при температурі 75-80°C протягом 16 год. Випарюють при зниженому тиску, і розбавляють етилацетатом (500 мл) і водою (500 мл). рН водного шару доводять до 8-9 водним 6н розчином NaOH, екстрагують водний шар етилацетатом (3500 мл), органічні шари змішують, промивають насиченим водним розчином хлориду натрію, сушать над сульфатом натрію, фільтрують, і упарюють при зниженому тиску. Неочищений продукт хроматографують на силікагелевій колонці сумішшю 50-100% етилацетат/петролейний ефір. Фракції, що містять згаданий продукт, змішують, і випарюють під зниженим тиском до одержання піни жовтого кольору (33 г, 87% неочищеного продукту). Вказані умови реакції повторюють з 3-(5фторопіримідин-4-іл)-2-[(1R)-1-(4-метоксифеніл)етил]-3-метил-6-(1-тетрагідропіран-2-ілпіразол4-іл)ізоіндолін-1-оном, і продукти змішують (10 г, 18,9 ммоль). Змішані продукти розчиняють в метанолі, і перемішують з SiliaBond Thiol (Silia MetS Thiol) при температурі 15-20°С протягом 20 год, фільтрують, і упарюють при зниженому тиску до одержання вказаної в заголовку сполуки з 77% ee (38 г, 87%). 8 UA 116125 C2 Приклад 2 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, Ізомер 2 5 10 15 20 25 30 35 Головний енантіомер (Ізомер 2) 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-ону (38 г, 123 ммоль) відокремлюють від другорядного енантіомеру (Ізомер 1) 3(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-ону із застосуванням системи препаративної хіральної HPLC (високоефективної рідинної хроматографії) та надкритичної рідинної хроматографії (SFC) (Колонка: Chiralpak OJ-H (5 мкм), 30250 см, елюент: 15% розчин ізопропанолу в СО2, потік: 120 г/хв при УФ 214 нм). Другий елюйований ізомер (Ізомер 2) являє собою вказану в заголовку сполуку (17 г, 45%, >98% ee). Хіральний аналіз (колонка: Chiralpak OJ-H (5 мкм) 4,6250 мм, елюент: 20% розчин ізопропанолу в CO2, потік: 3 мл/хв при УФ 214 нм, Rt=5,78 хв. ES/MS m/z: 310 (М+Н). Приклад 3 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он RuPhos паладію(II) фенетиламінхлорид (60 мкмоль, 43 мг), діоксан (0,5 мл) і трет-бутоксид калію (1 М розчин в тетрагідрофурані, 60 мкмоль, 60 мкл) змішують в атмосфері азоту, і одержану суміш обробляють ультразвуком протягом 0,5 хв. Цю каталітичну RuPhos-вмісну суміш додають в заповнену азотом реакційну посудину, що вміщує 6-бром-3-(5-фторопіримідин4-іл)-2-[(1R)-1-(4-метоксифеніл)етил]-3-метилізоіндолін-1-он (544 мг, 1,192 ммоль), трет-бутил-4(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-діоксаборолан-2-іл)піразол-1-карбоксилат (1,79 ммоль, 526 мг), 1,4діоксан (6 мл), карбонат натрію (3,6 ммоль, 2,4 мл, водний 1,5 М розчин), і гріють в мікрохвильовій печі при температурі 150°C протягом 30 хв. Суміш розбавляють етилацетатом, промивають водним 1,5 М розчином карбонату натрію, промивають насиченим водним розчином хлориду натрію, сушать над сульфатом магнію, фільтрують через діатомову землю, і упарюють до одержання залишку світло-жовтого кольору. Цей залишок розчиняють в анізолі (1 мл) і трифтороцтовій кислоті (7 мл), гріють при температурі 80°C протягом 4 год, потім гріють при температурі 70°C протягом 18 год. Суміш упарюють при зниженому тиску, розчиняють в метанолі, завантажують на 10 г SCX колонку, промивають метанолом (100 мл), елююють 2 М розчином аміаку в метанолі, і упарюють. Очищають на 40 г силікагелевій колонці градієнтом 18% метанол/дихлорметан до одержання вказаної в заголовку сполуки у вигляді піни білого кольору (279 мг, 76%). ES/MS m/z: 310 (М+Н). Приклад 4 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, Ізомер 2, гідрат H2O 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, Ізомер 2 (9,6 г, 0,03 моль) суспендують в 2% ацетону у воді (50 мл), і перемішують суміш при температурі 50°C 9 UA 116125 C2 5 10 15 20 25 30 протягом 1,5 год. Додають ацетон (1 мл), і гріють суміш при температурі 65°C протягом 1 год перед повільним охолодженням до кімнатної температури протягом 12 год. Тверді речовини відфільтровують, і промивають чотирма об’ємами води. Тверду речовину сушать у вакуумі при температурі 50°C протягом 6 год до одержання вказаної в заголовку сполуки (8,6 г, 90%). Порошкова рентгенографія Порошкові рентгенограми кристалічних твердих речовин одержують із застосуванням порошкового рентгенівського дифрактометру Bruker D4 Endeavor, спорядженого джерелом CuKa (=1,54060 е), і детектором Vantec, що працює при 35 кВ і 50 мА. Зразок сканують у межах 4-40 2 з величиною кроку, що дорівнює 0,0087° 2, при швидкості сканування 0,5 с/крок, з 0,6 мм розходженням, фіксованим рівнем антирозсіювання 5,28 мм та 9,5 мм діафрагмами детектору. Сухим порошком наповнюють кварцовий тримач зразку, і одержують рівну поверхню із застосуванням предметного скла. З кристалографії добре відомо, що, для будь-якої даної кристалічної форми, відносна інтенсивність дифракційних піків може змінюватись унаслідок переважної орієнтації, що є наслідком певних факторів, наприклад, таких як морфологія і форма кристалу. Якщо впливи переважної орієнтації наявні, інтенсивність піків змінюється, однак характеристичні положення піків поліморфних модифікацій залишаються незмінними. Окрім того, з кристалографії також добре відомо, що для будь-якої даної кристалічної форми кутові положення піків можуть дещо змінюватись. Наприклад, положення піків можуть зсуватись унаслідок змін температури або вологості, при яких аналізується зразок, зміщення зразку, або присутності чи відсутності внутрішнього стандарту. У цьому випадку змінність положення піків ± 0,2 при 2 буде враховувати ці потенційні зміни без перешкоджання однозначній ідентифікації вказаної кристалічної форми. Підтвердження кристалічної форми може бути здійснено на основі будь-якої унікальної комбінації характерних піків (в градусах 2), звичайно більших виступних піків. Порошкові рентгенограми кристалічної форми, зібрані при температурі навколишнього середовища і відносній вологості, підганяють на основі стандартних піків NIST 675 при 8,85 і 26,77 градуса 2-тета. Одержаний зразок Прикладу 4 характеризується порошковою рентгенограмою, одержаною із застосуванням випромінювання CuKa як такого, що має дифракційні піки (значення 2-тета), як описано у наведений нижче Таблиці 1. Зокрема, ця рентгенограма містить пік при 22,27 у комбінації з одним або декількома піками, вибраними з групи, яку складають 13,46, 16,54, 16,66, 18,10 та 23,13 з допуском на кути дифракції 0,2 градуси. Таблиця 1 Порошкові рентгенографічні піки сполуки Прикладу 4 Пік 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 35 Кут ( 2-тета) 7,16 13,46 14,82 16,54 16,66 16,96 18,10 18,84 19,33 21,78 22,27 23,13 23,51 23,86 25,99 27,21 Інтенсивність (%) 14 51 19 32 32 14 27 15 15 15 100 30 15 13 18 14 Приклад 5 (3R)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он, ацетонітриловий сольват 10 дигідрохлорид, UA 116125 C2 CH3CN 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 2HCl 0,25 М розчин HCl (1 мл) додають у 3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4іл)ізоіндолін-1-он (Приклад 3, 0,084 мг, 0,27 ммоль), і зразок обробляють ультразвуком. Весь матеріал є розчинним. Суміш упарюють до сухості, одержуючи маслянистий залишок. Додають ацетонітрил (2 мл). Розчин набуває жовтого кольору, і починають утворюватись кристали. Монокристали виділяють для проведення рентгенографічного дослідження монокристалів. Зразок визначають як ацетонітриловий сольват дигідрохлоридної солі. Атоми хлору забезпечують достатнє аномальне розсіювання для здійснення визначення абсолютної стереохімії молекули шляхом рентгенографічного дослідження монокристалів. Для кристалографічного аналізу із застосуванням рентгенівських променів використовують прозорий безбарвний призмоподібний зразок C18H17Cl2FN6O з приблизними розмірами 0,180 мм0,200 мм0,220 мм. Загалом збирають 3318 фреймів. Загальний час експозиції 1,84 год. Фрейми інтегрують із застосуванням пакету програмного продукту Bruker SAINT, що застосовує вузькофреймовий алгоритм. Інтеграція даних із застосуванням орторомбічної елементарної комірки дала загалом 13411 відображень до максимального кута  66,30 (розділення 0,84 е), 3304 з яких є незалежними (середня надлишковість 4,059, завершеність = 2 97,8%, Rint=7,25%, Rsig=6,30%) і 2885 (87,32%) були більшими за 2(F ). Кінцеві константи 3 комірок a=8,0583(2) е, b=36,3803(9) е, c=6,96840(10) е, об’єм=2042,88(8) е , засновані на уточненні XYZ-центроїдів 6295 відображень вище 20 (I) з 11,242132,0. Дані коригують на впливи поглинання із застосуванням методу мультисканування (програма SADABS). Співвідношення мінімального до максимального уявного пропускання становить 0,761. Обчислені мінімальний і максимальний коефіцієнти пропускання (в залежності від розміру кристала) становлять 0,5466 і 0,6033. Структуру розшифровують, і уточнюють із застосуванням пакету програм Bruker SHELXTL, використовуючи просторову групу P 21 21 2 із Z=4 для формульної одиниці, C18H17Cl2FN6O. 2 Кінцеве анізотропне уточнення повноматричним методом найменших квадратів при F з 255 змінними зійшлось на R1=4,27% для спостережуваних даних, і wR2=10,80% для всіх даних. Критерій згоди дорівнює 1,066. Найбільшим піком при кінцевому узагальненні розходження - 3 - 3 значень електронної густини є 0,295 е /е , і найбільшою діркою є -0,204 е /е із середнім - 3 квадратичним відхиленням 0,056 е /е . На основі остаточної моделі, обчислена густина 3 становить 1,376 г/см і F(000), 872 е . Абсолютний структурний параметр уточнюється до 0,0(0), що вказує на відповідність абсолютної структури молекули цільовій сполуці. Молекула ацетонітрилового розчинника є дещо невпорядкованою і, відповідно, уточнюється ізотропно, тоді як (3R)-3-(5-фторопіримідин-4-іл)-3-метил-6-(1H-піразол-4-іл)ізоіндолін-1-он та іони хлориду уточнюються анізотропно. Цей результат для сполуки Прикладу 5 встановлює абсолютну стереохімію молекули як R-енантіомеру, тим самим встановлюючи також стереохімію сполуки Прикладу 3, похідним якої є сполука Прикладу 5. Крім того, сполуки Прикладу 2 і Прикладу 3 піддають аналізу із застосуванням системи хіральна HPLC/надкритична рідинна хроматографія (SFC), використовуючи ті самі умови для того, щоб визначити наявність енантіомера для кожного Прикладу (Колонка: Chiralcel OJ-H 4,6 мм150 мм, 20% розчин ізопропанолу в СО2, 5 мл/хв, УФ 225 нм). Для сполук Прикладу 2 та Прикладу 3, ізомер 1 елююється через 1,53', і ізомер 2 елююється через 1,81'-1,84'. За даними цього аналізу сполука Прикладу 2 має 100% ee, і сполука Прикладу 3 має 96,4% ee. Ці результати показують, що енантіомером, присутнім як в Прикладі 2, так і в Прикладі 3, є ізомер 2. Оскільки абсолютною стереохімією для сполуки Прикладу 3 є R-енантіомер, як зазначено вище, а обидві сполуки Прикладу 2 і Прикладу 3 визначені із застосуванням хіральної HPLC/SFC як ізомер 2, абсолютною стереохімією для сполуки Прикладу 2, таким чином, також є R-енантіомер. Крім того, оскільки сполука Прикладу 2 використовується для одержання сполуки Прикладу 4, абсолютною стереохімією для сполуки Прикладу 4 є R-енантіомер. Візуалізаційний аналіз Acumen для виявлення фосфорильованого MCM2 в клітинах H1299 Acumen eX3 використовують для визначення впливу сполук на утворення ендогенного 11 UA 116125 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 фосфорильованого MCM2 на Serine53 (pMCM2-S53). Фосфорилювання MCM2 кіназою CDC7 визначають за допомогою специфічного антитіла проти pMCM2-S53, і кількісно визначають з використанням флуоресцентно мічених вторинних антитіл із застосуванням Acumen  eX3 для моніторингу активності CDC7 у клітинах. Як відомо, фосфорилювання MCM2 на Serine53 корелює з пригнічуванням CDC7. Клітини Н1299 (АТСС (Американська колекція типових культур), ą за каталогом CRL-5803) утримують в середовищі для вирощування RPMI-1640 (компанія Hyclone, ą за каталогом: SH30809.01), доповненому 10% FBS. Клітини збирають, використовуючи стандартні процедури культивування клітин, після чого підраховують із застосуванням аналізатора Vi-Cell XR Cell Viability Analyzer (лічильник компанії Beckman). 3000-6000 клітин H1299 в 100 мкл середовища для вирощування висівають у кожну лунку 96-лункового чорно-прозорого титрувального мікропланшету Biocoat Poly-D-Lysine з плоским дном (планшети для культивування клітин BioСoat Multiwell 356640 (компанія Becton Dickinson)), і інкубують протягом ночі при 37C, 5% СО2. Клітини обробляють досліджуваною сполукою (50 мкл/лунку), розведеною в середовищі, що містить 0,6% DMSO, і інкубують протягом 4 год при 37C. У кожну лунку додають 7,4% розчин формальдегіду (150 мкл), одержаний розбавленням PBS 37% вихідного розчину формальдегіду, і планшети інкубують при кімнатній температурі протягом 30 хв. Формальдегід видаляють, і додають холодний метанол (100 мкл). Планшети інкубують протягом 20 хв при температурі 4C для підвищення проникності клітин. Планшети тричі промивають PBS (100 мкл/лунку). Планшети інкубують (50 мкл/лунку) з розбавленим 1:1000 антитілом проти pMCM2-S53 (яке було одержане із використанням NP_004517.2 (дивись PubMed Sequence Database), кон’югованим з гемоціаніном лімфи равлика із застосуванням малеімідної активації за стандартним 90-денним протоколом імунізації кролів для продукування кролячих поліклональних антитіл (Thermo Scientific Pierce Antibodies, компанія Thermo Fisher Scientific)) в PBS з додаванням 2% BSA протягом ночі при 4C. Планшети промивають PBS (4100 мкл/лунку), і інкубують (100 мкл/лунку) з розбавленим 1:1000 вторинним козячим антикролячим IgG Alexa Fluor 488 (компанія Invitrogen, ą за каталогом CA11304s) в PBS протягом 1 год при кімнатній температурі. Планшети промивають PBS (4100 мкл/лунку). Додають PBS (50 мкл/лунку), що містить РНКазу (50 мкг/мл) і пропідію йодид (15 мкM), і планшети інкубують при кімнатній температурі протягом 30 хв. Планшети герметизують чорною плівкою, і зчитують на Acumen eX3 (компанія TTP LABTECH) із застосуванням 500-530 нм і 575-640 нм оптичних фільтрів для Alexa Fluor 488 і пропідію йодиду, відповідно. Кількість pMCM2-S53-позитивних клітин нормалізується до загальної кількості клітин для кожної лунки, і розраховується як відсоток пригнічування по відношенню до контролю на планшеті. Відсоток пригнічування з десятиточкової кривої даних концентрації сполуки переводять в чотирипараметричне логістичне рівняння для визначення значення IC 50. Сполуки, охоплювані обсягом цього винаходу, досліджували в цьому аналізі по суті так як описано вище. Сполука Прикладу 2, як визначено, має значення IC 50 0,261 мкМ0,004 (n=2). Сполука Прикладу 3, як визначено, має значення IC50 0,29 мкМ. Сполука Прикладу 4, як визначено, має значення IC50 0,29 мкМ0,0813 (n=2). Ці результати показують, що сполуки Прикладів 2, 3 і 4 пригнічують pMCM2-S53 у H1299 клітинному аналізі і отже є інгібіторами CDC7. In vitro ферментний аналіз CDC7/DBF4 Для визначення значень IC50 сполуки проти CDC7/DBF4 кінази застосовують аналіз Transcreener Kinase ADP-FP. Цей аналіз Kinase ADP-FP оцінює активність CDC7/DBF4 у присутності сполук-інгібіторів визначенням концентрації ADP, утвореного в кіназній реакції. Кіназну реакцію здійснюють на 96-лунковому аналітичному планшеті з використанням 25 мкл реакційного об'єму. При проведенні аналізу ADP-FP, для одержання кінцевих умов реакції, додають HEPES (25 мМ), рН 7,5, 0,03% Triton Х-100, хлорид магнію (10 мМ), DTT (1 мМ), MCM2 (400 нМ) (амінокислоти 1-209, фізіологічний субстрат CDC7/DBF4), спермін (4 мМ), CDC7/DBF4 (2640 нг/мл) (рекомбінантний людський CDC7/DBF4, експресований в клітинах комах), 4% диметилсульфоксиду і розчини послідовно розведеної сполуки (розведеної 1:3 від 20000 нМ до 1 нм). Для започаткування реакції до сполуки додають спочатку фермент і субстрат, потім ATP до 5 мкм. Планшети інкубують при кімнатній температурі протягом 60 хв. Для створення умов, які відповідають згаданому ADP-FP, додають 25 мкл засобу виявлення гасіння, що містить HEPES (52 мМ) рН 7,5, EDTA (20 мМ), хлорид натрію (0,4 М), додециловий простий ефір поліоксиетиленгліколя (0,02%) (BRIJ-35), анти-ADP антитіло (10 мкг/мл), ADP (4 нМ) і мітку Transcreener ADP Alexa fluor 633 для зупинення реакції. Планшети інкубують 12 UA 116125 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 протягом 1 год, після чого зчитують із застосуванням Wallac Envision 2104 MultiLabel Reader (компанія PerkinElmer) в режимі поляризації флуоресценції із застосуванням поляризаційних фільтрів з довжиною хвилі Ex620nm і Em688nm. Необроблені дані у одиницях міліполяризації (mP) перетворюють на мікромолі ADP, використовуючи підготовлену стандартну криву ADP/ATP, починаючи з 5 мкМ ADP (послідовне розведення 1:1 в буфері для реакції) до 0,0025 мкМ ADP. Значення IC50 для кожної сполуки одержують з використанням даних відсотку пригнічування, розрахованих з даних реакції у мкМ ADP відносно контролів на планшеті (DMSO в порівнянні з ферментними контролями, пригніченими 100 мМ EDTA). Після цього відсоток пригнічування і десятиточкову криву даних концентрації сполуки підганяють до чотирипараметричного логістичного рівняння. Сполуки, охоплювані обсягом цього винаходу, досліджували в цьому аналізі по суті так як описано вище. Сполука Прикладу 2, як визначено, має значення IC 50 3,7 нМ. Сполука Прикладу 3, як визначено, має значення IC50 4,5 нМ. Сполука Прикладу 4, як визначено, має значення IC50 3,3 нМ0,634 (n=2). Ці результати показують, що сполуки Прикладу 2, Прикладу 3 і Прикладу 4 пригнічують продукування ADP в in vitro ферментному аналізі, і отже є інгібіторами CDC7. In vitro антипроліферативний аналіз In vitro анти-проліферативну активність сполуки Прикладу 2 визначають аналізом з підрахунком кількості клітин по відношенню до панелі зі 114 ліній ракових клітин раку ободової та прямої кишки, раку молочної залози, раку легенів і раку крові (лейкозу), одержаних з АТСС (Американська колекція типових культур), HSRRB (Health Science Research Resources Bank), RIKEN (Інститут фізико-хімічних досліджень, Японія) або ЕСАСС (European Collection of Cell Cultures). Клітини культивують, і утримують в живильних середовищах за інструкціями постачальників. Визначають час поділу клітин кожної клітинної лінії; всі клітинні лінії вільні від забруднення мікоплазмами. Перед доданням сполуки для проведення аналізів антипроліферативної активності клітини культивують протягом ночі в 96-лункових планшетах. Оптимальну густину посіву клітин ретельно оцінюють для кожної клітинної лінії шляхом посіву культури клітин з 4 різною густиною клітин в 100 мкл середовища та з урахуванням їх часу поділу і розміру. Після цього для випробування сполук вибирають густину посіву, яка забезпечує приблизно 90% злиття на кінець двох періодів часу подвоєння. Як еталон застосовують стауроспорин у розведенні 1:3. Сполуку Прикладу 2 одержують у вигляді 4 мМ концентрованого розчину у DMSO, і розводять в культуральному середовищі у співвідношенні 1:2. У кожну лунку 96-лункового планшету з культурою, культивованою протягом ночі, додають 50 мкл середовища, що містить сполуку, для одержання бажаних кінцевих концентрацій 20 мкМ, 10 мкМ, 5 мкМ, 2,5 мкМ, 1,25 мкМ, 0,625 мкМ, 0,312 мкМ, 0,156 мкМ, 0,078 мкМ і контрольних концентрацій DMSO. Для кожної призначеної для обробки концентрації передбачені дві лунки. Клітини додатково культивують протягом двох періодів часу подвоєння у присутності сполуки. Наприкінці часу обробки, клітини спочатку досліджують під мікроскопом на морфологічні зміни, такі як загибель клітин або видиме збільшення розміру клітин. Клітини з кожної подвійної лунки збирають окремо. Клітини, прикріплені до субстрату, збирають шляхом попередньої трипсинізації. Зібрані клітини ресуспендують в середовищі для вирощування, і підраховують із застосуванням лічильника для клітин. Сполуки, охоплювані обсягом цього винаходу, досліджували в цьому аналізі по суті так як описано вище. Як представлено в наведеній нижче Таблиці 2, сполука Прикладу 2, досліджувана у фармакологічно відповідних концентраціях (