Стійкі до фагів молочнокислі бактерії для текстурування харчових продуктів

Реферат: Винахід належить до стійких до фагів молочнокислих бактерій з покращеними текстуруючими властивостями, способу їх одержання та до композицій, що містять зазначені бактерії. UA 113144 C2 (12) UA 113144 C2 UA 113144 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Даний винахід стосується бактеріальних клітин з підвищеною фагостійкістю, заквашувальних культур, що включають клітини, і молочних продуктів, які ферментовані заквашувальною культурою. Попередній рівень У харчовій промисловості використовують множину бактерій, зокрема, лактобактерії, для поліпшення смаку і текстури харчових продуктів, а також для продовження терміну придатності цих харчових продуктів. У молочній промисловості лактобактерії інтенсивно використовують для сквашування молока (ферментації), а також для текстурування продукту, в який вони внесені. Серед лактобактерій, що використовуються в харчовій промисловості, можуть бути вказані роду Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus і Bifidobacterium. Лактобактерії видів Streptococcus thermophilus широко використовують окремо або в комбінації з іншими бактеріями для отримання харчових продуктів, зокрема, ферментованих продуктів. Зокрема, їх використовують для отримання ферментів, що використовуються для отримання ферментованого молока, наприклад, йогурту. Деякі з них відіграють домінуючу роль в розвитку текстури ферментованого продукту. Ця характеристика тісно пов'язана з продукуванням полісахаридів. Штами Streptococcus thermophilus можна розділити на текстуруючі і нетекстуруючі штами. У WO2007095958A1 описуються штами Streptococcus thermophilus з текстуруючими властивостями. На фіг. 1 можна бачити, що штам CHCC8833 (DSM17876), який виявляє найбільші текстуруючі властивості, має показник напруження зсуву близько 59 Па. У галузі продовжує існувати потреба в нових текстуруючих штамах молочнокислих бактерії, зокрема, Streptococcus thermophilus, для текстурування харчових продуктів. Зокрема, існує потреба в новому текстуруючому штамі Streptococcus thermophilus, який може бути використаний разом зі штамом Lactobacillus species. Іншою потребою промисловості є штам, стійкий до бактеріофагів, в нормі присутнім в харчовій промисловості. Короткий опис Автори даного винаходу забезпечили нову групу молочнокислих бактерій видів Streptococcus thermophilus і Lactobacillus bulgaricus, які несподівано виявилися більш стійкими до атак фагів в порівнянні з (материнським) штамом, з якого вони були отримані. Додатково, несподівано було встановлено, що ця група бактерій дозволяє отримати більш високе напруження зсуву і/або густину гелю в порівнянні з материнським штамом при використанні бактерій для ферментації молока. Несподіваним є те, що фагостійкий мутантний штам виявляє більш виражені текстуруючі властивості, наприклад, більш високе напруження зсуву і/або густину гелю (при використанні штаму для ферментації молока) в порівнянні з материнським штамом, і зокрема, несподівано, що фагостійкий мутантний штам зі штаму, який (також) має мутацію в galK гені (відносно штаму дикого типу), додає більш виражені текстуруючі властивості (при використанні штаму для ферментації молока) в порівнянні з материнським штамом. Відповідно до цього несподіваного відкриття даний винахід стосується способу отримання штаму текстуруючих молочнокислих бактерій шляхом скринінгу фагостійких мутантів материнського штаму, наприклад, способу отримання текстуруючих молочнокислих бактерій (наприклад, бактерії, які крім того, що вони фагостійкі, по суті фагостійкі і/або мають підвищену фагостійкість в порівнянні з материнським штамом, мають більш виражені текстуруючі властивості в порівнянні з материнським штамом), що включає стадії: a) забезпечення штаму молочнокислих бактерій (материнський штам); і b) виділення мутантного штаму з материнського штаму, де мутантний штам стійкий до більшості фагів (наприклад, більшість типів фагів або більшість штамів фагів) в порівнянні з материнським штамом. Додатково, даний винахід стосується штамів текстуруючих молочнокислих бактерій, таких як штами S. thermophilus або штами Lactobacillus bulgaricus, модифікованих для придбання стійкості до більшості фагів в порівнянні з материнським штамом, зокрема, проти одного з фагів CHPC658, CHPC1057, CHPC1089 і CHPC1152. Детальний опис У першому аспекті даний винахід стосується способу отримання молочнокислих бактерій (наприклад, бактерії, які фагостійкі, по суті фагостійкі і/або мають підвищену фагостійкість в порівнянні з материнським штамом або які додають більш високе напруження зсуву і/або густину гелю в порівнянні з материнським штамом при використанні бактерій для ферментації молока), що включає стадії: a) забезпечення штаму молочнокислих бактерій (материнський штам); і 1 UA 113144 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 b) виділення мутантного штаму з материнського штаму, де мутантний штам стійкий до більшості фагів (наприклад, більшість типів фагів або більшість штамів фагів) в порівнянні з материнським штамом і/або де мутант стійкий до фагів, до яких не стійкий материнський штам (при однакових умовах). У аспекті, який цікавить, даний винахід стосується способу отримання молочнокислих бактерій (наприклад, бактерії, які фагостійкі, по суті фагостійкі і/або мають підвищену фагостійкість в порівнянні з материнським штамом і/або які додають більш високе напруження зсуву і/або густину гелю в порівнянні з материнським штамом при використанні бактерій для ферментації молока), що включає стадії: a) забезпечення штаму молочнокислих бактерій (материнський штам); і a1) впливи на штам молочнокислих бактерії бактеріофагом, наприклад, бактеріофагом, здатним лізувати материнський штам, таким як фаг, вибраний з групи, яка складається з CHPC658, CHPC1057, CHPC1089 і CHPC1152; і b) виділення мутантного штаму з материнського штаму, де мутантний штам стійкий до фагу (або де штам не лізований фагом). Також даний винахід стосується способу, що включає стадії: a) забезпечення штаму молочнокислих бактерій (материнський штам); a1) впливи на штам молочнокислих бактерії бактеріофагом, наприклад, бактеріофагом, здатним лізувати материнський штам, таким як фаг, вибраний з групи, яка складається з CHPC658, CHPC1057, CHPC1089 і CHPC1152; a2) інкубування бактеріальних клітин, які пройшли вплив, в ростовому середовищі; і b) виділення мутантного штаму з материнського штаму, де мутантний штам не лізований бактеріофагом. Способи за даним винаходом можуть включати стадію: c) мутації материнського штаму (наприклад, обробка хімікатами або обробка радіацією, або при використанні методів генної інженерії), наприклад, перед, під час або після стадії a1). Також будь-який спосіб за даним винаходом може включати стадію: d) введення мутації в ген galK або в регуляторну послідовність galK (наприклад, промотор) штаму (наприклад, обробка хімікатами або обробка радіацією, або при використанні методів генної інженерії), наприклад, перед, під час або після стадії с), або перед, під час або після стадії a1). У варіанті втілення, який цікавить, даного винаходу спосіб включає стадії: - забезпечення штаму молочнокислих бактерій (материнський штам); - мутації материнського штаму (наприклад, обробка хімікатами або обробка радіацією, або при використанні методів генної інженерії); - впливи на отриманий штам молочнокислих бактерії бактеріофагом, наприклад, бактеріофагом, здатним лізувати материнський штам, таким як фаг, вибраний з групи, яка складається з CHPC658, CHPC1057, CHPC1089 і CHPC1152; - інкубування бактеріальних клітин, які пройшли вплив, в ростовому середовищі; і - виділення мутантного штаму з материнського штаму, де мутантний штам не лізований бактеріофагом. Спосіб за даним винаходом приводить до мутації в області промотору гена galK, такій як в області -10 (блок Прібнова) або в області між блоком Прібнова і сайтом зв'язування рибосом. Також спосіб за даним винаходом може привести до мутації, внаслідок якої підвищена галактозна ферментативна активність в порівнянні з материнським штамом. Мутація в результаті може привести до заміни одного або більше нуклеотидів в області між блоком Прібнова і сайтом зв'язування рибосом гена galK, такої як заміна С в послідовності TTCAGT нижче від області блока Прібнова дикого типу на нуклеотид, вибраний з групи, яка складається з А, Т і G. У іншому варіанті втілення даного винаходу мутація може привести до: - заміни одного або більше нуклеотидів в області між блоком Прібнова і сайтом зв'язування рибосом гена galK, такої як заміна С в послідовності TTCAGT (SEQ ID NO:6) нижче від області блока Прібнова дикого типу на нуклеотид, вибраний з групи, яка складається з А, Т і G; і/або - заміни одного або обох С і G області -10 дикого типу (TACGAT, SEQ ID NO:7) на нуклеотид, незалежно вибраний з групи, яка складається з А і Т; і/або - заміни С області -10 дикого типу (TACGAT, SEQ ID NO:7) на нуклеотид, незалежно вибраний з групи, яка складається з А і Т; і/або - заміни С області -10 дикого типу (TACGAT, SEQ ID NO:7) на Т; і/або - область -10 має нуклеотидну послідовність TATGAT (SEQ ID NO:8), TATTAT (SEQ ID NO:9) або TACTAT (SEQ ID NO:10). 2 UA 113144 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Потрібно розуміти, що материнський штам, що використовується в способі за даним винаходом, може представляти штам gal+, переважно штам, здатний знижувати показник pH щонайменше на 1,0 після 16 годин інкубації при температурі 37ºC в M17 з 2 % галактози 4 (галактозу додають як єдиний вуглевод), інкубують в кількості щонайменше 10 клітин на мл середовища. Прикладами такого штаму є штам, де: - один або більше нуклеотидів в області між блоком Прібнова і сайтом зв'язування рибосом гена galK замінений, така заміна як С в послідовності TTCAGT (SEQ ID NO:6) нижче від області блока Прібнова дикого типу на нуклеотид, вибраний з групи, яка складається з А, Т і G; і/або - один або обидва С і G в області -10 дикого типу (TACGAT, SEQ ID NO:7) замінені на нуклеотид, незалежно вибраний з групи, яка складається з А і Т; і/або - С в області -10 дикого типу (TACGAT, SEQ ID NO:7) замінений на нуклеотид, незалежно вибраний з групи, яка складається з А і Т; і/або - С в області -10 дикого типу (TACGAT, SEQ ID NO:7) замінений на Т; і/або - область -10 має нуклеотидну послідовність TATGAT (SEQ ID NO:8), TATTAT (SEQ ID NO:9) або TACTAT (SEQ ID NO:10). Нові штами gal+ є частиною даного винаходу. Спосіб за даним винаходом може включати одну або більше додаткових стадію(стадій), вибрану з групи, яка складається з: c1) скринінгу мутантного штаму з фагостійкістю, такоюй як підвищена фагостійкість в порівнянні з материнським штамом; і c2) скринінгу мутантного штаму, що має фенотип Gal+, такий як з підвищеною галактоза розкладаючою активністю в порівнянні з материнським штамом. У одному варіанті втілення даний винахід стосується способу отримання молочнокислих бактерій, що включає стадії: - забезпечення штаму молочнокислих бактерій (материнський штам); - необов'язкової мутації материнського штаму; - впливи бактеріофагом на необов'язково мутований материнський штам, наприклад, бактеріофагом, здатним лізувати материнський штам, таким як фаг, вибраний з групи, яка складається з CHPC658, CHPC1057, CHPC1089 і CHPC1152; - необов'язкового інкубування бактеріальних клітин, які пройшли вплив, в ростовому середовищі; і - скринінгу мутантного штаму з фагостійкістю, такою як підвищена фагостійкість в порівнянні з материнським штамом; і/або - скринінгу мутантного штаму, що має фенотип Gal+, такий як з підвищеною галактоза розкладаючою активністю в порівнянні з материнським штамом. Мутантний штам, отриманий способом за даним винаходом, може представляти спонтанний мутант, мутант, отриманий мутагенезом материнського штаму, наприклад, обробкою хімікатами або обробкою радіацією, або мутант, отриманий при використанні методів генної інженерії. Мутант, який цікавить, за даним винаходом представляє мутант CHCC6008, зокрема, мутант, що представляє gal+ і стійкий до CHCP1152. У одному варіанті втілення даного винаходу мутантний штам фагостійкий, по суті фагостійкий і/або має підвищену фагостійкість в порівнянні з материнським штамом, де фаг вибирають з групи, яка складається з: бактеріофага, здатного лізувати материнський штам, CHPC658, CHPC1057, CHPC1089 і CHPC1152. Переважно бактерії (материнський штам) вибирають з видів, вибраних з групи, яка складається з Lactococcus spp., Streptococcus spp. (наприклад, Streptococcus thermophilus), Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp., Propionibacterium spp. і Bifidobacterium spp. У варіанті втілення, який цікавить, способу за даним винаходом бактерії (материнський штам) вибирають зі штаму, що має одну або більше ознак, вибраних з групи, яка складається зі здатності текстурувати молоко, здатності продукувати полісахариди, такі як екзополісахариди або капсульні полісахариди, здатності додавати в'язкості при інкубуванні в молоці і здатності додавати більш високе напруження зсуву при інкубуванні в молоці. У іншому аспекті даний винахід стосується молочнокислих бактерій або штаму, що отримується способом за даним винаходом. У іншому аспекті даний винахід стосується молочнокислих бактерій або штаму, таких як бактерії або штам, що отримується способом за даним винаходом, що дозволяє отримати в'язкість ферментованого молока більшу ніж близько 70 Па (Паскаль) (таку як більше ніж 73 Па, більше ніж 77 Па або більше ніж 79 або більше ніж 80 Па), виміряну як напруження зсуву через 4 12 годин росту при температурі 37ºC, наприклад, при інкубуванні в кількості щонайменше 10 клітин на мл молока. Передбачається, що можна отримати штами, які дозволяють отримати 3 UA 113144 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в'язкість ферментованого молока аж до 100 Па, аж до 120 Па, аж до 150 Па або аж до 200 Па. Приклади отримуваних меж в'язкості: від 70 до 200 Па, від 75 до 150 Па, від 78 до 120 Па, від 79 до 100 Па і від 80 до 90 Па. Зокрема, даний винахід стосується штаму S. thermophilus, здатному додавати ферментованому молоку в'язкості в межах від 79 до 100 Па. Приклади штаму за даним винаходом представляють бактеріальний штам, що належить до родів Streptococcus thermophilus, вибраних з групи, яка складається з CHCC11342 (DSM 22932), CHCC11977 (DSM22935), CHCC12339 (DSM24090) і CHCC13140 (DSM 24023), і мутантів і варіантів будь-якого з них. Додатково, даний винахід стосується всім нових штамів, приведених в описі даної патентної заявки, нарівні з їх мутантами і варіантами. Зокрема, даний винахід стосується штаму CHCC11977 і його мутанту. У іншому аспекті даний винахід стосується молочнокислих бактерій або штаму за даним винаходом, що дозволяє отримати напруження зсуву ферментованого молока більше ніж близько 70 Па (таке як більше ніж 73 Па, більше ніж 77 Па або більше ніж 80 Па, виміряне як напруження зсуву через 12 годин росту при температурі 37ºC, наприклад, при інкубуванні в 4 кількості щонайменше 10 клітин на мл молока. Бактерії штаму можуть належати до видів Streptococcus thermophilus або Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Також даний винахід стосується бактеріального штаму, що належить до видів Lb. delbrueckii sbsp. bulgaricus, такому як штам, вибраний з групи, яка складається з CHCC12813 (DSM24074) і CHCC12841, і їх мутантів і варіантів. Штамами, які цікавлять, є ті, які дозволяють отримати напруження зсуву в ферментованому молоці більше ніж близько 60 Па (таке як більше ніж 65 Па, більше ніж 69 Па або більше ніж 72 Па), виміряне як напруження зсуву через 12 годин росту 4 при температурі 37ºC, наприклад, при інокулюванні в кількості щонайменше 10 клітин на мл молока. Зокрема, цікавлять ті, які дозволяють отримати напруження зсуву ферментованого молока в межах від 60 до 100 Па. Зокрема, цікавлять ті, які дозволяють отримати напруження зсуву (таке як в межах від 65 до 90 Па, в межах від 69 до 85 Па або в межах від 72 до 80 Па), виміряне як напруження зсуву через 12 годин росту при температурі 37ºC, наприклад, при 4 інокулюванні щонайменше 10 клітин на мл молока. У іншому аспекті даний винахід стосується молочнокислих бактерій або штаму або мутанту або варіанту даного винаходу, що дозволяє отримати густину гелю ферментованого молока більшу ніж близько 110 Па (таку як більшу ніж 115, більшу ніж 120 або більшу ніж 125 Па), виміряну через 12 годин росту при температурі 37ºC, наприклад, при інокулюванні в кількості 4 щонайменше 10 клітин на мл молока. Переважно густина гелю складає в межах від 110 до 200 Па або більш переважно в межах від 120 до 190 Па або в межах від 125 до 180 Па. Бактерії або штам можуть належати до видів Streptococcus thermophilus або Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Зокрема, даний винахід стосується штаму S. thermophilus, що дозволяє отримати густину гелю ферментованого молока в межах від 125 до 175 Па. У варіанті втілення, який цікавить, даний винахід стосується молочнокислих бактерій або штаму, що належать до видів Lb. delbrueckii sbsp. bulgaricus. Варіанти, які цікавлять, такого варіанту втілення даного винаходу представляють бактерії або штам, що дозволяють отримати в'язкість ферментованого молока більшу ніж близько 60 Па (таку як більшу ніж 65 Па, більшу ніж 69 Пa або більшу ніж 72 Па), виміряну як напруження зсуву через 12 годин росту при 4 температурі 37ºC, наприклад, при інокулюванні в кількості щонайменше 10 клітин на мл молока, і/або бактерії або штам, що дозволяють отримати в'язкість ферментованого молока в межах від 60 до 100 Па (таку як в межах від 65 до 90 Па, в межах від 69 до 85 Па або в межах від 72 до 80 Па), виміряну як напруження зсуву через 12 годин росту при температурі 37ºC, 4 наприклад, при інокулюванні в кількості щонайменше 10 клітин на мл молока. У іншому аспекті даний винахід стосується композиції, що включає молочнокислі бактерії або штам за даним винаходом, такі як бактерії, що належать до штаму CHCC11977 або його 10 мутанту. Переважно така композиція включає щонайменше 10 КУО (колонієутворювальні одиниці) вказаних бактерій. У одному варіанті втілення даного винаходу композиція може включати, як суміш, так і комбінацію, штамів, що належать видам Lactobacillus, таким як Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (синонім: Lactobacillus bulgaricus), L. johnsonii або L. fermentum strain; і штамів молочнокислих бактерій за даним винаходом, таких як штам, що належить до видів Streptococcus thermophilus, наприклад, штам, вибраний з групи, яка складається з CHCC11342 (DSM 22932), CHCC11977 (DSM22935), CHCC12339 і CHCC13140 (DSM 24023), і мутанти і варіанти будь-якого з них, таку як композиція, де штам, який належить до видів Lactobacillus представляє штам, що належить до видів Lactobacillus, який продукує фермент полісахарид(такий як гетерополісахарид, гомополісахарид) і/або фруктозил-трансферазу. Композиція за 10 даним винаходом може включати щонайменше 10 КУО (колонієутворювальні одиниці) штаму, 4 UA 113144 C2 10 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 що належить до видів Lactobacillus; і/або щонайменше 10 КУО штаму, що належить до видів Streptococcus thermophilus. У варіанті втілення, який цікавить, даного винаходу композиція за даним винаходом включає 10 щонайменше 10 КУО (колонієутворювальні одиниці) штаму, що належить до видів Lactobacillus, які продукують фермент полісахарид- (такий як гетерополісахарид, 10 гомополісахарид) і/або фруктозил-трансферазу; і щонайменше 10 КУО штаму, що належить до видів Streptococcus thermophilus. Композиція може бути використана як заквашувальна культура і може бути в замороженій, ліофільній або рідкій формі. У іншому аспекті даний винахід стосується способу отримання продукту з ферментованого молока, що включає ферментування молочного субстрату (такого як коров'яче молоко) молочнокислими бактеріями за даним винаходом, штамом за даним винаходом або композицією за даним винаходом. Спосіб додатково може включати ферментування молочного субстрату штамом, що належить до видів Lactobacillus, таким як штам L. bulgaricus або L. fermentum, наприклад, штамом, вибраним з групи, яка складається з CHCC10019, CHCC10935 або CHCC3984, і мутантами і варіантами будь-якого з них. Наприклад, молочний субстрат ферментують композицією, штамом або бактеріями за даним винаходом, такими як штам, що належить до видів Streptococcus thermophilus, перед, під час або після ферментації штамом, що належить до видів Lactobacillus, або молочний субстрат ферментують штамом, що належить до видів Streptococcus thermophilus, під час ферментації штамом, що належить до видів Lactobacillus, які продукують полісахариди. Спосіб отримання продукту з ферментованого молока за даним винаходом може включати додавання ферменту в молочний субстрат перед, під час і/або після ферментування, такого як фермент, вибраний з групи, яка складається з ферменту, здатного перехресно зшивати білки, трансглютамінази, аспарагінової протеази, хімозину і сичужного ферменту. У іншому аспекті даний винахід стосується молочного продукту, такого як продукт з ферментованого молока (наприклад, йогурт або пахта) або сир (наприклад, свіжий сир або паста філату), отриманого способом за даним винаходом. Продукт з ферментованого молока може представляти, наприклад, продукт з порушеним згустком, питний продукт або продукт з непорушеним згустком. Молочний продукт за даним винаходом необов'язково включає інгредієнт, вибраний з групи, яка складається з фруктового концентрату, сиропу, пробіотичної бактеріальної культури, барвника, загущувального агента, агента, що додає смаку і аромату, і консервуючого агента. Отже, даний винахід стосується продукту з ферментованого молока, отриманого способом за даним винаходом, що необов'язково включає інгредієнт, вибраний з групи, яка складається з фруктового концентрату, сиропу, пробіотичної бактеріальної культури, барвника, загущувального агента, агента, що додає смаку і аромату, і консервуючого агента; і/або який необов'язково має форму продукту з порушеним згустком, з непорушеним згустком або питного продукту. Також даний винахід стосується молочного продукту, отриманого ферментацією молочного субстрату (такого як коров'яче молоко) молочнокислими бактеріями за даним винаходом (наприклад, штам, що належить до виду Streptococcus thermophilus, такий як DSM 22884) і видів молочнокислих бактерій, вибраних з Lactobacillus bulgaricus і Lactobacillus fermentum (таким як CHCC10019 (DSM19252), CHCC3984 (DSM19251) і CHCC2008 (DSM22584)). У варіанті втілення, який цікавить, даного винаходу молочний продукт за даним винаходом має в'язкість більшу ніж 100 Па (таку як більшу ніж 102 або більшу ніж 104 Па), виміряну як напруження зсуву, наприклад, через 12 годин росту при температурі 37ºC. У переважному варіанті втілення даного винаходу в'язкість складає більшу ніж 100 Па, отримана тільки за рахунок росту бактеріальних клітин, але більш високі показники в'язкості отримують додаванням хімічних сполук, таких як желатин, карагенан і тому подібне. У іншому варіанті втілення даного винаходу молочний продукт має в'язкість/текстуру в межах від 100 до 200 Па, таку як в межах від 100 до 150 Па або в межах від 105 до 125 Па, виміряну, як напруження зсуву. У додатковому варіанті втілення даного винаходу молочний продукт представляє питний продукт, наприклад, питний йогурт. Також даний винахід стосується нових бактеріофагів, що використовуються в способі за даним винаходом, таких як бактеріофаг, вибраний з групи, яка складається з CHPC658 (DSM 23961), CHPC1057, CHPC1089 і CHPC1152 (DSM 23994), і їх мутантів і варіантів, таких як мутанти і варіанти, здатні лізувати вказані вище штами, наприклад, штам CHCC6008. 5 UA 113144 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Додатково, даний винахід стосується нових бактеріальних штамів, що використовуються як материнський штам в способі за даним винаходом, таких як штами, вибрані з групи, яка складається з CHCC11342 (DSM22932), CHCC10019 (DSM19252), CHCC11379 (DSM 22884), CHCC11976 (DSM 22934) і їх мутантам. Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "молочнокислі бактерії" стосується грампозитивних мікроаерофільних або анаеробних бактерій, які ферментують цукор з продукуванням кислот, включаючи молочну кислоту як основну продуковану кислоту, оцтову кислоту і пропіонову кислоту. Найбільш використовувані в промисловому виробництві бактерії стосуються сімейства "Lactobacillales", яке включає Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. і Propionibacterium spp. Додатково, бактерії, які продукують молочну кислоту, належать до групи облігатних анаеробних бактерій, біфідобактерії, тобто Bifidobacterium spp., як правило, включають в групу молочнокислих бактерії. Їх часто використовують як харчові культури самі по собі або в комбінації з іншими молочнокислими бактеріями. Молочнокислі бактерії включають бактерії видів Lactobacillus sp. і Streptococcus thermophilus, які, як правило, використовують при виробництві молочних продуктів у вигляді, як заморожених, так і ліофільних культур для вирощування виробничої закваски, або так званих культур "прямого внесення" (DVS), призначених для безпосередньої інокуляції в ферментер або бродильний чан для отримання молочного продукту, такого як продукт з ферментованого молока. Такі культури, як правило, вказуються як "заквашувальні культури" або "закваски". Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "молоко" включає в об'єм поняття секрет молочних залоз, отриманий доїнням ссавців, таких як корови, вівці, кози, буйволиці або верблюдиці. У переважному варіанті втілення даного винаходу молоко представляє молоко корови. Термін молоко також включає в об'єм поняття розчини білок/жир, отримані з рослинних матеріалів, наприклад, соєве молоко. Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "молочний субстрат" може представляти будь-яке сире молоко і/або молоко, яке пройшло технологічну обробку, яке може бути ферментоване способом за даним винаходом. Отже, використовуваний молочний субстрат включає без обмеження розчини/суспензію будь-якого молока або молочних продуктів, що включає білок, таких як незбиране молоко або молоко з низьким вмістом жиру, знежирене молоко, пахта, відновлене сухе молоко, концентроване молоко, сухе молоко, сироватка, пермеат сироватки, лактоза, маточна рідина після кристалізації лактози, концентрат сироваткового білка або вершків. Очевидно, що молочний субстрат може бути отриманий від будь-якого ссавця, наприклад, він може представляти по суті чисте молоко ссавців або відновлене сухе молоко. Переважно, щонайменше частина білка в молочному субстраті представляє білок спочатку присутній в молоці, такий як казеїн або сироватковий білок. Однак частина білка може представляти білки, не присутні спочатку в молоці. Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "молоко" стосується молочного секрету, отриманого доїнням ссавців, таких як корови, вівці, кози, буйволиці або верблюдиці. У переважному варіанті втілення даного винаходу молоко представляє коров'яче молоко. Перед ферментацією молочний субстрат може бути гомогенізований і пастеризований згідно зі способами по попередньому рівню техніки. Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "гомогенізація" стосується інтенсивного перемішування з отриманням суспензії або емульсії. У випадку, коли гомогенізацію проводять перед ферментацією, вона може бути проведена, таким чином, щоб зменшити розмір молочного жиру, таким чином, щоб він більше не відділявся від молока. Це може бути досягнуто проштовхуванням молока під тиском через маленькі отвори. Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "пастеризація" стосується обробки молочного субстрату для зниження вмісту або видалення живих організмів, таких як мікроорганізми. Переважно пастеризація досягається шляхом підтримки певної температури протягом певного періоду часу. Певна температура, як правило, досягається нагріванням. Температура і тривалість можуть бути вибрані таким чином, щоб вбивати або інактивувати певні бактерії, такі як шкідливі бактерії. Потім може йти стадія швидкого охолоджування. Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "ферментація" стосується перетворення вуглеводів в спирти або кислоти при впливі мікроорганізмів. Переважно ферментація в способах за даним винаходом включає перетворення лактози в молочну кислоту. Процес ферментації, що використовується для отримання продуктів з ферментованого молока, добре відомий, і фахівець в галузітехніки, до якої належить даний винахід, добре знає, 6 UA 113144 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 як вибрати відповідні технологічні умови, такі як температура, кисень, додавання вуглеводів, кількість і характеристики мікроорганізму(ів) і час обробки. Очевидно, що умови ферментації вибирають, таким чином, щоб сприяти досягненню даного винаходу, тобто, отриманню молочного продукту в твердій або рідкій формі (продукт з ферментованого молока). Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "продукт з порушеним згустком", зокрема, стосується продукту з ферментованого молока, який піддають механічній обробці після ферментації, з отриманням в результаті зруйнованого і зрідженого згустку, отриманого на стадії ферментації. Як правило, механічну обробку без обмеження проводять перемішуванням, перекачуванням, фільтрацією або гомогенізацією гелю або змішуванням з іншими інгредієнтами. Продукти з порушеним згустком, як правило, без обмеження мають вміст сухих знежирених речовин молока в межах від 9 до 15 %. Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "продукт з непорушеним згустком" включає в об'єм поняття продукт на основі молока, інокульований заквашувальною культурою, наприклад, стартовою культурою, і упакований після стадії інокуляції з подальшою ферментацією в упаковці. Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "питний продукт" включає напої, такі як "питний йогурт" і тому подібне. Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "питний йогурт" як правило, стосується молочного продукту, отриманого ферментацією комбінацією видів Lactobacillus і Streptococcus thermophilus. Як правило, питний йогурт має вміст сухого знежиреного молочного залишку 8 % або більше. Додатково, кількість живих культур в 6 напої типу питного йогурту, як правило, складає щонайменше 10 колонієутворювальних одиниць (КУО) на мл. Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "питний продукт" включає будьякий питний продукт на основі сквашених молочних субстратів, включаючи, таким чином, напої з ферментованого молока і рідкі питні йогурти. У способах за даним винаходом сквашування проводять як ферментацію мікроорганізмами необов'язково з додаванням кислоти, такої як органічна кислота (наприклад, молочна кислота, лактобіонова кислота або GDL). Питні продукти за даним винаходом є питними в тому значенні, що вони мають рідку форму і споживаються, як напої, тобто, вони підходять для пиття, а не для споживання ложкою. Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "в рідкій формі" стосується продуктів в рідкому стані, таким чином, демонструючи характеристику готовності текти. Отже, форма рідини, як правило визначається контейнером, в який вона заповнена, на противагу, наприклад, гелеподібній речовині, яка м'яка, але не вільно текуча, така як, наприклад, йогурт або пудинг. Питні продукти за даним винаходом можуть мати в'язкість, що дозволяє споживачеві пити продукти при використанні трубочки, якщо потрібно. Питні продукти за даним винаходом можуть мати pH менше ніж 4,6, переважно менше ніж 4,4, більш переважно менше ніж 4,2 і ще більш переважно pH близько 4 або менше. У одному аспекті питний продукт має pH менше ніж 3,8, такий як менше ніж 3,6. Питні продукти за даним винаходом можуть мати вміст жиру в межах від 0 до 2 %, переважно менше 1,5 %, менше 1 % або менше 0,5 %, більш переважно близько 0,1 % або менш. Питний продукт може мати вміст сухого знежиреного молочного залишку менше ніж 20 %, переважно менше ніж 8,5 %, менше ніж 8 %, менше ніж 7,5 %, менше ніж 7 %, менше ніж 6,5 % або менше ніж 6 % і більш переважно близько 5 %. Питні продукти за даним винаходом можуть мати вміст білка в межах від 0,5 до 4 %. У одному переважному аспекті питний продукт має вміст білка менше 1 %. У одному переважному аспекті питний продукт має вміст білка в межах від 2 до 3 %. Питні продукти за даним винаходом можуть мати термін придатності більший ніж 7 днів, переважно більший ніж 14 днів, більш переважно більший ніж 28 днів, такий як більший ніж 3 місяці. Питні продукти за даним винаходом можуть мати підвищену стабільність до осадження. Стабільність може бути визначена після зберігання питного продукту протягом відповідної кількості днів вимірюванням висоти сироватки, що збирається на поверхні за рахунок синерезису. Вона також може бути визначена після посилення синерезису, таким способом, як центрифугування. Для питного продукту, наприклад, питного йогурту, обробка з високим зсувовим зусиллям (наприклад, гомогенізація) після ферментації в нормі необхідна для руйнування білкової сітки для придання гладкості, гомогенності і здатності до пиття. Руйнування сітки приводить до того, що питні йогурти мають знижену стабільність до осадження, наслідком чого є осадження білка на дно протягом терміну придатності. Високий вміст жиру і високий вміст білка підвищують стабільність до осадження, при цьому в продукти з низьким вмістом жиру (0-0,5 % жири) і з 7 UA 113144 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 низьким вмістом білка (1-2,5 %) в нормі потребують додавання стабілізатора, щоб уникнути осадження білка. Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "бактеріофаг" має традиційне значення, відоме в попередньому рівні техніки, тобто вірус, який вибірково вражає одну або більше бактерій. Більшість бактеріофагів специфічні до конкретних родів або видів, або штамів бактерій. Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "бактеріофаг" є синонімом терміну "фаг". Бактеріофаги можуть включати без обмеження бактеріофаги, що належать до будь-якого з наступних сімейств вірусів: Corticoviridae, Cystoviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae або Tectiviridae. Бактеріофаг може представляти літичний бактеріофаг або лізогенний бактеріофаг. Літичний бактеріофаг представляє такий, який йде літичним шляхом при проходженні літичного циклу, а не лізогенним шляхом. Літичний бактеріофаг піддається вірулентній реплікації, що приводить до лізису мембран клітин, руйнування клітин і виділення потомства частинок бактеріофага, здатного інфікувати інші клітини. Лізогенний бактеріофаг представляє такий, здатний йти лізогенним шляхом, в якому бактеріофаг стає сплячою, пасивною частиною генома клітини при проходженні завершення літичного циклу. У одному варіанті втілення даного винаходу молочнокислі бактерії за даним винаходом стійкі до одного або більше бактеріофагів або однієї або більше комбінацій бактеріофагів, в іншому варіанті втілення даного винаходу молочнокислі бактерії за даним винаходом стійкі до того ж бактеріофагу, штам якого депонований за даним винаходом. Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "фагостійкий" взаємозамінний терміном "фаготривкий". Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "мутант" стосується штаму, отриманому зі штаму, або штаму, який може бути отриманий зі штаму за даним винаходом (або материнського штаму) при використанні, наприклад, генної інженерії, обробки випромінюванням і/або хімічної обробки. Переважно мутант представляє функціональний еквівалент мутанта, наприклад, мутант, який по суті має такі ж або поліпшені властивості (наприклад, в'язкість, густину гелю, обволікання ротової порожнини, смак і аромат, посткислотоутворення, швидкість підкислення і/або фагостійкість), як у материнського штаму. Такий мутант є частиною даного винаходу. Зокрема, використовуваний в описі даної патентної заявки термін "мутант" стосується штаму, отриманому обробкою штаму за даним винаходом при використанні будь-якого традиційного способу мутагенної обробки, включаючи обробку хімічним мутагеном, таким як етан метан сульфонат (EMS) або N-метил-N'-нітро-N-нітрогуанідин (NTG), УФ випромінювання або спонтанно виникаючі мутації. Мутант може бути підданий декільком мутагенезам (єдину обробку потрібно розуміти, як одну стадію мутагенезу з проведенням подальшої стадії скринінгу/відбору), але переважно проведення не більше ніж 20 або не більше ніж 10, або не більше ніж 5 обробок (або стадій скринінгу/відбору). Переважно в бактеріальному геномі мутанта замінені менше ніж 5 %, або менше ніж 1 % або менше ніж 0,1 % нуклеотидів іншими нуклеотидами або видалені в порівнянні з материнським штамом. Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "варіант" стосується штаму, який є функціональним еквівалентом штаму за даним винаходом, наприклад, який по суті має такі ж або поліпшені властивості (наприклад, в'язкість, густину гелю, обволікання ротової порожнини, смак і аромат, посткислотоутворення, швидкість кислотоутворення і/або фагостійкість). Такі варіанти можуть бути визначені при використанні відповідних технологій відбору і є частиною даного винаходу. У контексті даної патентної заявки "текстуру" вимірюють, як напруження зсуву через 12 годин росту при температурі 37°C". Одиницею вимірювання напруження зсуву і густина гелю є Паскаль (Па). Дослідження, що використовується для аналізу текстури: На наступний день після інкубації ферментоване молоко доводять до температури 13°C і обережно перемішують при використанні палички із закріпленим на ній диском з отворами до досягнення зразком гомогенності. Реологічні властивості зразка оцінюють при використанні реометра (StressTech, Reologica Instruments, Sweden), забезпеченого C25 коаксіальною вимірювальною системою. Тест на віскозиметрі проводять при градієнті швидкості зсуву, що варіює в межах від 0,27 до 300 1/с в 21 стадію. Градієнт швидкості зсуву спочатку збільшують, а потім знижують і фіксують верхню і нижню точки кривої напруження зсуву і видимої в'язкості. Час затримки і час інтеграції становить 5 і 10 секунд, відповідно. Використовувані в описі даної патентної заявки (зокрема, в прикладеній формулі винаходу) форми однини включають і множину, якщо в контексті ясно не переглядається інше. Використовуване в описі даної патентної заявки дієслово "включати" і його форми потрібно інтерпретувати у відкритому, а не закритому значенні, якщо ясно не вказане інше (тобто в значенні "включаючи без обмеження"), якщо ясно не вказано інше. Приведені межі значень 8 UA 113144 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 приведені, як спосіб стисло показати весь діапазон, тобто кожний окремий показник з цього діапазону, якщо ясно не вказано інше. Всі описані в даному винаході способи можуть бути проведені будь-яким відповідним чином, якщо ясно не вказано інше, або якщо з контексту ясно не переглядається інше. Використання в описі даної патентної заявки будь-якого прикладу або всіх прикладів або термінів, вказуючих на приведення прикладу (наприклад, такий як) приведено для кращого розуміння і ілюстрації і не обмежує об'єм домагань даного винаходу, викладених в прикладеній формулі винаходу. Жодне формулювання в описі не повинне розглядатися, як вказуюче на будь-який не викладений в формулі винаходу елемент як істотний для здійснення даного винаходу. Фігури На фіг. 1 приведене напруження зсуву галактоза-позитивного штаму CHCC11342 і галактоза-позитивного фагостійкого мутанта CHCC11977, виміряне при використанні реометра StressTech. Вимірюють напруження зсуву молока, яке коагулювало, після росту протягом ночі/як мине ніч в молоці при температурі 37ºC. На фіг. 2 приведене напруження зсуву фагостійкого мутанта CHCC10019, виміряне при використанні реометра StressTech. Вимірюють напруження зсуву молока, яке коагулювало, після росту протягом ночі/як мине ніч в молоці при температурі 37ºC. На фіг. 3 приведена густину гелю CHCC12339 і фагостійкого мутанта CHCC9204, виміряна при використанні реометра StressTech. Вимірюють густину гелю молока, яке коагулювало, після росту протягом ночі/як мине ніч в молоці при температурі 37ºC. На фіг. 4 приведене напруження зсуву CHCC13140, фагостійкого мутанта CHCC5086, виміряне при використанні реометра StressTech. Вимірюють напруження зсуву молока, яке коагулювало, після росту протягом ночі/як мине ніч в молоці при температурі 37ºC. Експериментальна частина Приклад 1: Отримання фагостійких штамів Streptococcus thermophilus з поліпшеними текстуруючими властивостями Отримання CHCC11977 Материнський штам CHCC11342 отримують за прикладом 5. Штам представляє мутант CHCC6008 і вважається ферментуючим галактозу штамом S. thermophilus. Штам CHCC11977 виділяють на M17 агаровій пластині після посіву смугами 0,1 мл на M17 9 протягом ночі культури CHCC11342 разом з 0,1 мл фагу CHPC1152, що містить 10E09 (10 ) частинок фагу на мл, і інкубують протягом двох днів при температурі 37ºC. Один мутант, названий CHCC11977, три рази очищений на колонці і повторно тестований при використанні тесту на бляшки на M17 агаровій пластині при температурі 37°C при використанні фагу CHPC1152, де фагостійкість підтверджена (не спостерігається жодної бляшки). Потім мутантний штам також тестують в M17 бульйоні при температурі 37ºC в присутності фагу CHPC1152. CHCC11977 зберіг фагостійкість також в рідкому культуральному середовищі, в той час як CHCC11342, як і очікувалося, був атакований CHPC1152. Також CHCC11977 тестують в молоці при різних температурах (без додавання вражаючого фагу), виявляючи активність сквашування в порівнянні з материнським штамом CHCC11342. Аналіз CHCC11342 на текстурування ферментованого молока На наступний день після інкубації ферментоване молоко доводять до температури 13°C і обережно перемішують при використанні палички із закріпленим на ній диском з отворами до досягнення зразком гомогенності. Реологічні властивості кожного зразка оцінюють при використанні реометра (StressTech, Reologica Instruments, Sweden), забезпеченого C25 коаксіальною вимірювальною системою. Тест на віскозиметрі проводять при градієнті швидкості зсуву, що варіює в межах від 0,27 до 300 1/с в 21 стадію. Градієнт швидкості зсуву спочатку збільшують, а потім знижують і фіксують верхню і нижню точки кривої напруження зсуву і видимої в'язкості. Час затримки і час інтеграції становить 5 і 10 секунд, відповідно. Для подальших досліджень -1 використовують напруження зсуву рівне 300 с . Результати дослідження на реометрі показують, що CHCC11342 має показник напруження зсуву 73,0 Па в порівнянні з CHCC6008 з показником напруження зсуву 68,0 Па, дивіться, фіг. 1. Аналіз CHCC11977 на текстурування молока Отримують ферментоване молоко і аналізують текстуру, як вказано вище для galпозитивного фагостійкого мутанта. Результати вимірювання на реометрі показують, що CHCC11977 має показник напруження зсуву, який додатково поліпшений на 10 % в порівнянні з CHCC11342 (показник напруження зсуву 80,0 Па для CHCC11977 в порівнянні з 73,0 Па для материнського штаму CHCC11342, дивіться, фіг. 1). 9 UA 113144 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Додатково, густина гелю (G*) збільшена на 20 % для фагостійкого мутанта CHCC11977, що має показник 126,0 Па в порівнянні з CHCC11342 (густина гелю 104,0 Па), таким чином, можна поліпшити найважливіші реологічні параметри напруження зсуву і густини гелю виділенням фагостійкого мутанта з галактоза-позитивного материнського штаму. Секвенування galK області промотору з CHCC11342 Для виявлення типу мутації для галактоза-позитивного мутанта CHCC11342 секвенують початок гена galK (кодуючого галактокіназу з S. thermophilus). Для CHCC11342 визначають мутацію області промотору galK (дивіться нижче). Мутація відбувається в трьох послідовностях нижче від області -10 промотору блока гена galK, приводячи до зсуву нуклеотидів C-A. Область промотору гена galK з CHCC11342. Точка мутації в CHCC11342 промоторі galk позначена сірим кольором. Опублікована послідовність galK з S. thermophilus ST111 (Genbank каталожний номер AY704368) вказана для порівняння. -35: -35- область промотору; -10: -10область промотору; RBS: сайт зв'язування рибосоми. Додаткові фагостійкі мутанти Для виявлення можливості взаємозв'язку між фагостійкістю і галактоза-позитивним фенотипом виділяють п'ять додаткових фагостійких мутантів на M17 галактозних агарових пластинках зі штаму CHCC6008 (gal-), який представляє материнський штам з CHCC11342 (gal+). Всі п'ять фагостійких штамів CHCC11396, CHCC11397, CHCC11398, CHCC11399 і CHCC11340 (стійкий до фагу CHPC1152) не здатні ферментувати галактозу, що означає, що gal+ фенотип не має безпосереднього зв'язку з фагостійкістю. З іншого боку, було продемонстровано, що при аналізі на бляшки CHCC11342 (gal+) все ще чутливий до фагу CHPC1152. Приклад 2: Отримання фагостійких штамів Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus з поліпшеними текстуруючими властивостями З материнського штаму CHCC10019 (DSM19252) таким чином виділяють фагостійкі мутанти: Мутанти збирають з MRS агарових пластинок, що містять 10 мM CaCl 2/10 мM MgCl2 після посіву смугами 0,1 мл на MRS протягом ночі культури CHCC10019 разом з 0,1 мл CHPC658 6 лізату фагу, що містить 10 частинок фагу на мл і анаеробної інкубації протягом двох днів при температурі 37°C. Виділяють і тестують тридцять мутантів посівом перехресними штрихами на фаг CHPC658. Двадцять дев'ять мутантів виявили стійкість при посіві перехресними штрихами, після чого три рази колонії очищають на MRS агарових пластинках при температурі 37ºC. 29 мутантів тестують в титраційному мікропланшеті на профіль підкислення і фагостійкість. Отримують два титраційні мікропланшети з молоком, і кожен мікропланшет інокулюють 2 %-ми відповідного мутанта. На один мікропланшет додають 2 % розчинник пептон-сіль (контроль) в 6 кожну ямку і в інший титраційний мікропланшет додають 2 % CHPC658, що містить 10 частинок фагів на мл. Два мікропланшети інкубують при температурі 37°C протягом двох днів, і кожні 12 хвилин записують показник pH кожної ямки. Всі мутанти фагостійкі в порівнянні з материнським штамом CHCC10019, атакованим фагом CHPC658. Дванадцять мутантів вибирають на основі профілю підкислення в MRS і молоці (аналогічно материнському штаму) і в'язкості штамів. Аналіз фагостійких мутантів CHCC10019 на текстурування ферментованого молока Після інкубації дванадцяти штамів і материнського штаму CHCC10019 протягом ночі в молоці при температурі 37ºC, ферментоване молоко доводять до температури 13ºC і обережно перемішують при використанні палички із закріпленим на ній диском з отворами до досягнення зразком гомогенності. Реологічні властивості кожного зразка оцінюють при використанні реометра (StressTech, Reologica Instruments, Sweden), забезпеченого C25 коаксіальною вимірювальною системою. Тест на віскозиметрі проводять при градієнті швидкості зсуву, що варіює в межах від 0,27 до 300 1/с в 21 стадію. Градієнт швидкості зсуву спочатку збільшують, а потім знижують і фіксують верхню і нижню точки кривої напруження зсуву і видимої в'язкості. Час затримки і час інтеграції становить 5 і 10 секунд, відповідно. Для подальших досліджень використовують напруження -1 зсуву рівне 300 с . Результати реологічних вимірювань показують, що всі дванадцять мутантів (такі як CHCC12813 і CHCC12841) мають поліпшену в'язкість, виміряну, як напруження зсуву в 10 UA 113144 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 порівнянні з CHCC10019. Найвищий показник напруження зсуву отриманий для CHCC12841 (74,0 Па), в той час як CHCC10019 має показник напруження зсуву 58,0 Па, дивіться, фіг. 2. На фігурі приведені реологічні дані дванадцяти мутантів. Всі мутанти мають підвищене напруження зсуву в межах на від 10 % аж до 28 % в порівнянні з CHCC10019. Основуючись на активності підкислення і реологічних даних під час росту мутантів при спільному культивуванні з іншими штамами, був вибраний CHCC12813, як найбільш перспективний кандидат з виділених мутантів для подальших тестів на застосування. Цей експеримент демонструє, що найважливіший реологічний параметр напруження зсуву бактеріального штаму буде значно поліпшений виділенням з штаму фагостійких мутантів. Приклад 3: Виділення фагостійких мутантів Streptococcus thermophilus штаму CHCC9204 Фагостійкий мутант виділяють з материнського штаму CHCC9204, зареєстрованого в колекції культур Chr. Hansen. Мутант виділяють на M17-2 % лактозних агарових пластинках при використанні 10 мM MgCl2/CaCl2 після посіву смугами 0,1 мл на M17 лактозу протягом ночі 9 культури CHCC9204 разом з 0,1 мл фагу CHPC1057, що містить 1×10 частинок фагу на мл і інкубації протягом ночі при температурі 37ºC. Серед декількох мутантів одного штаму названий CHCC12339 три рази очищають на колонці і повторно тестують при використанні тесту на бляшки на M17 лактозних агарових пластинках при температурі 37°C при використанні фагу CHPC1057 для випробування фагом, і підтверджують фагостійкість (не спостерігається жодної бляшки). Також тестування CHCC12339 в молоці показало підкислювальну активність, порівнянну з материнським штамом. Аналіз текстуруючих властивостей фагостійкого штаму CHCC12339 в ферментованому молоці Після інкубації мутанта CHCC12339 і материнського штаму CHCC9204 протягом ночі в молоці при температурі 37ºC, ферментоване молоко доводять до температури 13ºC і обережно перемішують при використанні палички із закріпленим на ній диском з отворами до досягнення зразком гомогенності. Реологічні властивості кожного зразка оцінюють при використанні реометра (StressTech, Reologica Instruments, Sweden), забезпеченого C25 коаксіальною вимірювальною системою. Тест на віскозиметрі проводять при градієнті швидкості зсуву, що варіює в межах від 0,27 до 300 1/с в 21 стадію. Градієнт швидкості зсуву спочатку збільшують, а потім знижують і фіксують верхню і нижню точки кривої напруження зсуву і видимої в'язкості. Час затримки і час інтеграції становить 5 і 10 секунд, відповідно. Для подальших досліджень використовують напруження -1 зсуву рівне 300 с . Результати реологічних вимірювань показують, що мутант CHCC12339 приводить до підвищення густину гелю (G*) на 22 % в порівнянні з CHCC9204, дивіться, фіг. 3. На фігурі приведене порівняння показників щільності гелю (G*) для фагостійкого мутанта CHCC12339 (78,0 Па) і материнського штаму CHCC9204 (64,0 Па). Приклад 4: Виділення фагостійких мутантів Streptococcus thermophilus штаму CHCC5086 Фагостійкий мутант виділяють з материнського штаму CHCC5086, зареєстрованого в колекції культур Chr. Hansen. Мутант виділяють на M17-2 % лактозних агарових пластинках при використанні 10 мM MgCl2/CaCl2 після посіву смугами 0,1 мл на M17 лактозу протягом ночі культури CHCC5086 8 разом з 0,1 мл фагу CHPC1089, що містить 1×10 частинок фагу на мл і інкубації протягом ночі при температурі 37°C. Серед декількох мутантів одного штаму названий CHCC13140 три рази очищають на колонці і повторно тестують при використанні тесту на бляшки на M17 лактозних агарових пластинках при температурі 37ºC при використанні фагу CHPC1089 для випробування фагом, і підтверджують фагостійкість (не спостерігається жодної бляшки). Також тестування CHCC13140 в молоці показало підкислювальну активність, порівнянну з материнським штамом. Аналіз текстуруючих властивостей фагостійкого мутанта CHCC13140 в ферментованому молоці Після інкубації мутанта CHCC13140 і материнського штаму CHCC5086 протягом ночі в молоці при температурі 37°C, ферментоване молоко доводять до температури 13ºC і обережно перемішують при використанні палички із закріпленим на ній диском з отворами до досягнення зразком гомогенності. Реологічні властивості кожного зразка оцінюють при використанні реометра (StressTech, Reologica Instruments, Sweden), забезпеченого C25 коаксіальною вимірювальною системою. Тест на віскозиметрі проводять при градієнті швидкості зсуву, що варіює в межах від 0,27 до 300 1/с в 21 стадію. Градієнт швидкості зсуву спочатку збільшують, а потім знижують і фіксують верхню і нижню точки кривої напруження зсуву і видимої в'язкості. Час затримки і час інтеграції 11 UA 113144 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 становить 5 і 10 секунд, відповідно. Для подальших досліджень використовують напруження -1 зсуву рівне 300 с . Результати реологічних вимірювань показують, що мутант CHCC13140 приводить до підвищення густину гелю на 14 % в порівнянні з CHCC5086, дивіться фіг. 4. На фігурі приведене порівняння даних напруження зсуву для фагостійкого мутанта CHCC13140 (напруження зсуву 33,0 Па) і материнського штаму CHCC5086 (28,0 Па). Приклад 5: Отримання галактоза-позитивного мутанта штаму Streptococcus Загальний метод отримання gal+штамів Перед виділенням мутанта з материнського штаму (наприклад, CHCC6008) на агарові пластини M17 штрихами наносять 2 % галактозу (M17-gal пластини). CHCC6008 не показав росту на лактозі, як єдиному джерелі вуглеводів, і отже, підтверджується, що материнський штам є gal-. Культивований протягом ночі материнський штам потім наносять на M17-gal пластини і виділяють декілька колоній після двох днів росту при температурі 37°C. Декілька мутантів очищають на M17-gal пластинах і повторно тестують в бульйоні M17, що містить 2 % галактози як єдиний вуглевод. Мутант може бути отриманий при використанні методів генної інженерії, обробці радіацією і/або обробці хімікатами або мутант може представляти спонтанний мутант. Мутант вважається галактоза-позитивним у випадку, коли pH знижується щонайменше на 1,0 після 16 годин інкубації при температурі 37ºC в M17 з 2 % галактозою (галактозу додають як 4 єдиний вуглевод) при інокулюванні в кількості, щонайменше 10 клітин на мл середовища. У той час, як CHCC6008 не знижує значно pH в M17-gal бульйоні, CHCC11342 - один з очищених мутантів - досягає pH 5,4 після 16 годин при температурі 37ºC, і, отже, вважається ферментуючим галактозу (gal+) мутантом CHCC6008. Виділення штамів, ферментуючих галактозу Мутант виділяють, як мутант ферментуючого галактозу штаму S. Thermophilus CHCC6008 (=ST6008, DSM18111). Клітини CHCC6008 не піддають якому-небудь мутагенезу впливом мутагенних сполук або впливом УФ променів перед стадією виділення мутанта. Отже, виділені штами подібні до спонтанних галактоза-позитивних мутантів CHCC6008. Перед виділенням мутанта CHCC6008 на агарові пластини M17 смугами наносять 2 % галактозу (M17-gal пластини). CHCC6008 не показав росту на галактозі, як єдиному джерелі вуглеводів. Культивовані протягом ночей CHCC6008 потім наносять на M17-gal пластини і виділяють декілька колоній після двох днів росту при температурі 37ºC. Декілька мутантів очищають на пластинах M17-gal і повторно тестують в бульйоні M17, що містить 2 % галактози як єдиний вуглевод. У той час як CHCC6008 не значно знижує pH в бульйоні M17-gal, CHCC11379 - один з очищених мутантів досягає pH до 5,3 через 10 годин при температурі 37ºC, і, отже, вважається ферментуючим галактозу мутантом CHCC6008. Штами CHCC11342 і CHCC11976 виділяють таким же чином. Виділення мутантів при використанні методів генної інженерії Галактоза-позитивні мутанти також можуть бути отримані сайт-направленим мутагенезом. Олігонуклеотиди несуть мутований нуклеотид в galK-10 блоці промотору, що використовується для ампліфікації специфічного фрагмента ДНК проведенням ПЛР. Фрагмент ПЛР, який несе задану мутацію, клонують в плазмідний вектор і трансформують цільовий штам S. thermophilus, мутацію інтегрують в хромосому і змінюють galK область промотору дикого типу проведенням рекомбінації. Виділення штамів проводять, як вказано вище. Аналіз текстури ферментованого молока На наступний день після інкубації ферментоване молоко доводять до температури 13ºC і обережно перемішують при використанні палички із закріпленим на ній диском з отворами до досягнення зразком гомогенності. Реологічні властивості зразка оцінюють при використанні реометра (StressTech, Reologica Instruments, Sweden), забезпеченого C25 коаксіальною вимірювальною системою. Тест на віскозиметрі проводять при градієнті швидкості зсуву, що варіює в межах від 0,27 до 300 1/с в 21 стадію. Градієнт швидкості зсуву спочатку збільшують, а потім знижують і фіксують верхню і нижню точки кривої напруження зсуву і видимої в'язкості. Час затримки і час інтеграції становить 5 і 10 секунд, відповідно. Для подальших досліджень -1 використовують напруження зсуву рівне 300 с . Результати дослідження на реометрі показують, що CHCC11379 має напруження зсуву, поліпшене на 10 % в порівнянні з CHCC6008 12 UA 113144 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (показник напруження зсуву 74,0 Па (паскаль) для CHCC11379 в порівнянні з 67,5 Па для материнського штаму CHCC6008). Аналіз текстури молока У іншому експерименті CHCC11379 використовують як частину йогуртної закваски, де штам з S. thermophilus культивують в знежиреному молоці при температурі 43ºC спільно зі штамом виду Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus. Відмінність полягає тільки в тому, що при отриманні йогурту використовують CHCC11379 замість дикого типу CHCC6008, напруження зсуву також підвищене на 10 % (105,0 Па для йогуртної закваски, що містить CHCC11379, в порівнянні з 94,7 Па для йогуртної закваски, що містить CHCC6008). Секвенування galK області промотору з CHCC11379 Для виявлення типу мутації для gal позитивного мутанта CHCC11379 секвенують початок гена galK (кодуючого галактокіназу S. thermophilus). Для CHCC11379 визначають мутацію області промотору galK (дивіться нижче). Швидше усього, відповідна мутація приведе до більш сильної активності промотору в порівнянні материнським штамом 6088, що пояснює отриманий gal-позитивний фенотип. Це ґрунтується на тому факті, що консенсусна послідовність -10-блока промотору представляє "TATAAT", і що мутація 3 нуклеотиду в -10 блоці (області) CHCC6008 ("TATAAT") приводить до того, що -10 блок має більш високу схожість з консенсусною послідовністю CHCC11379 ("TATGAT"). Область промотору гена galK з CHCC11379. Точка мутації в CHCC11379 промоторі galk позначена сірим кольором. Опублікована послідовність galK з S. thermophilus ST111 (Genbank каталожний номер AY704368) вказана для порівняння. -35: -35- область промотору; -10: -10область промотору; RBS: сайт зв'язування рибосоми. Переважні варіанти втілення даного винаходу включають найкращий спосіб здійснення даного винаходу, відомий його авторам. Варіанти переважних варіантів втілення даного винаходу очевидні для фахівця в галузі техніки, до якої належить даний винахід, при прочитанні опису даної патентної заявки. Автори даного винаходу чекають від фахівця в галузі техніки, до якої належить даний винахід, використання таких варіантів у встановленому порядку, і автори даного винаходу мають на увазі, що даний винахід може бути здійснений іншим способом, ніж приведений в описі даної патентної заявки. Отже, даний винахід включає всі модифікації і еквіваленти предмета домагань, викладеного в прикладеній формулі винаходу. Додатково, будь-яка комбінація вказаних вище елементів у всіх можливих варіантах входить в об'єм домагань даного винаходу, якщо ясно не вказане інше, або якщо в контексті ясно не переглядається інше. Депонування і проведення експертизи Штами Streptococcus thermophilus CHCC11977 і CHCC11342 депоновані 8 вересня 2009 року в DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Німецька колекція мікроорганізмів і культур клітин) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany) під інвентарними номерами DSM22935 і DSM22932. Бактеріофаги CHPC658, CHPC1057 і CHPC1152 депоновані в DSMZ 27.08.2010 під інвентарними номерами DSM23961, DSM23962 і DSM23994, відповідно. Інші депозити DSMZ: CHCC10019 (DSM19252), CHCC3984 (DSM19251): дата депонування 3 квітня 2007 року, CHCC2008 (DSM22584): дата депонування 19 травня 2009 року, CHCC11379 (DSM22884): дата депонування 26 серпня 2009 року, CHCC11976 (DSM22934): дата депонування 8 вересня 2009 року; CHCC13140 (DSM 24023), CHCC12813 (DSM24074) і CHPC1089 (DSM 24022): дата депонування 29 вересня 2010 року; CHCC12339 (DSM24090): дата депонування 14 жовтня 2010 року; Streptococcus thermophilus CHCC5086 (DSM22587): дата депонування: 19 травня 2009 року; CHCC9204 (DSM19243): дата депонування 29 березня 2007 року. Штами депоновані відповідно до умов Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури. Заявник повідомляє, що зразок депонованого мікроорганізму може бути доступний тільки експерту, що розглядає дану патентну заявку. Посилання 13 UA 113144 C2 5 Appl. Environ. Microbiol. 71, 7, р. 3659-67 (2005); International Journal of Food Microbiology 113 (2007) 195-200; Applied And Environmental Microbiology, Feb. 2002, р. 784-790; J Dairy Sci 92: 477-482 (2009) WO2008/040734A1, WO2007/025097A2, US7241610B2, WO2007/144770A2, WO2004/085607A, WO2008/148561A, WO11000879A, WO11000883A, WO10023178A. Всі посилання в даній патентній заявці включені в повному об'ємі. 14 UA 113144 C2 15 UA 113144 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 1. Спосіб отримання молочнокислих бактерій, що включає стадії: a) забезпечення штаму молочнокислих бактерій Streptococcus thermophilus або Lactobacillus delbrueckii як материнського штаму; а1) піддавання вказаного материнського штаму впливу бактеріофага, який здатний лізувати вказаний материнський штам; b) виділення мутантного штаму з материнського штаму, де мутантний штам не лізується вказаним бактеріофагом; c) введення мутації в регуляторну послідовність galK штаму до, під час або після стадії а1); с2) скринінгу на предмет знаходження мутантного штаму, який має підвищену активність з розкладання галактози порівняно з материнським штамом; де вказаний мутантний штам дозволяє отримати більш високе напруження зсуву і/або густину гелю порівняно з материнським штамом при застосуванні бактерій для ферментації молока. 2. Спосіб за п. 1, де стадія а1) включає вплив на материнський штам бактеріофагом, вибраним з групи, яка складається з фагів, депонованих в Німецькій колекції мікроорганізмів та культур клітин, GmbH (DSMZ) під інвентарними номерами: DSM 23961, DSM 23962, DSM 24022 і DSM 23994. 16 UA 113144 C2 5 10 15 20 25 3. Спосіб за п. 1 або 2, де вказану мутацію в регуляторну послідовність galK штаму вводять шляхом використання методів генної інженерії. 4. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де мутацію вводять в ділянку промотору гена galK. 5. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де мутація введена в ділянку -10 (блок Прибнова) або в ділянку між блоком Прибнова і сайтом зв'язування рибосом гена galK. 6. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де мутація приводить в результаті до: - заміни одного або більше нуклеотидів в ділянці між блоком Прибнова і сайтом зв'язування рибосом гена galK, такої як заміна С в послідовності TTCAGT (SEQ ID NО:6) нижче від ділянки блока Прибнова дикого типу на нуклеотид, вибраний з групи, яка складається з А, Т і G; і/або - заміни одного або обох С і G ділянки -10 дикого типу (TACGAT, SEQ ID NО:7) на нуклеотид, незалежно вибраний з групи, яка складається з А і Т; і/або - заміни С ділянки -10 дикого типу (TACGAT, SEQ ID NО:7) на нуклеотид, незалежно вибраний з групи, яка складається з А і Т; і/або - заміни С ділянки -10 дикого типу (TACGAT, SEQ ID NО:7) на Т; і/або - ділянка -10 має нуклеотидну послідовність TATGAT (SEQ ID NO:8), ТАТТАТ (SEQ ID NО:9) або ТАСТАТ (SEQ ID NO:10). 7. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, що включає додаткову стадію скринінгу мутантного штаму з фагостійкістю, такою як підвищена фагостійкість порівняно з материнським штамом. 8. Бактеріальний штам, що належить до виду Streptococcus thermophilus, для ферментування молочного субстрату, вибраний з групи, яка складається з штамів, депонованих в DSMZ під інвентарними номерами: DSM 22935, DSM 24090 і DSM 24023. 9. Бактеріальний штам, що належить до виду Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, для ферментування молочного субстрату, депонований в DSMZ під інвентарним номером DSM 24074. 10. Композиція, що включає бактеріальний штам за п. 8 або 9, такі як бактерії, що належать до штаму, вибраного з групи, яка складається з штамів, депонованих в DSMZ під інвентарними номерами: DSM22935, DSM 24023, DSM 24090, DSM 24074. 17 UA 113144 C2 18 UA 113144 C2 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 19