Спосіб модулювання функції серинової/треонінової протеїнкінази сполуками, що є похідними 5-азахіноксаліну, спосіб ідентифікації сполук, що модулюють функцію серинової/треонінової протеїнкінази, спосіб запобіган
Номер патенту: 71555
Опубліковано: 15.12.2004
Автори: МакМахон Джералд, Кучер Бернхард, Апп Гаральд, Гюнтер Екхард
Формула / Реферат
1. Спосіб модулювання функції серинової/треонінової протеїнкінази, який включає стадію впливу на клітини, що експресують вищезгадану серинову/треонінову протеїнкіназу сполукою, що є похідною 5-азахіноксаліну.
2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вищезгаданою сериновою/треоніновою протеїнкіназою є RAF.
3. Спосіб ідентифікації сполук, що модулюють функцію серинової/треонінової протеїнкінази, який включає наступні стадії:
вплив на клітини, що експресують вищезгадану серинову/треонінову протеїнкіназу, вищезгаданої сполуки, і
моніторинг ефекту на вищезгадані клітини.
4. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що вищезгаданим ефектом є зміна або відсутність зміни фенотипу клітини.
5. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що вищезгаданим ефектом є зміна або відсутність зміни в проліферації клітини.
6. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що вищезгаданим ефектом є зміна або відсутність зміни в каталітичній активності вищезгаданої серинової/треонінової протеїнкінази.
7. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що вищезгаданим ефектом є зміна або відсутність зміни у взаємодії між вищезгаданою сериновою/треоніновою протеїнкіназою з природним партнером, що зв'язується з протеїнкіназою.
8. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що включає наступні стадії:
лізис вищезгаданих клітин для одержання лізату, що містить серинову/треонінову протеїнкіназу,
адсорбцію вищезгаданої серинової/треонінової протеїнкінази на антитілі,
інкубацію вищезгаданої адсорбованої серинової/треонінової протеїнкінази з субстратом або субстратами, і
адсорбцію вищезгаданого субстрату або субстратів на твердій основі або антитілі,
де вищезгадана стадія визначення моніторингу вищезгаданого ефекту на вищезгадані клітини включає вимірювання концентрації фосфату у вищезгаданому субстраті або субстратах.
9. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що вищезгаданою сериновою/треоніновою протеїнкіназою є RAF, і при цьому спосіб включає стадії:
лізис вищезгаданих клітин з одержанням лізату, що містить RAF,
адсорбцію вищезгаданого RAF на антитілі,
інкубування адсорбованої RAF з МЕК і МАРК, і
адсорбцію вищезгаданих МЕК і МАРК на твердій основі або антитілі, або антитілах,
де вищезгадана стадія визначення моніторингу вищезгаданого ефекту на вищезгадані клітини включає визначення концентрації фосфату у вищезгаданих МЕК і МАРК.
10. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вищезгадана сполука є похідною 5-азахіноксаліну, яка має структуру, наведену в формулі І
де
(а) R1, R2 R3, R4 і R6 незалежно вибирають з групи, яка складається з:
водню;
насиченого або ненасиченого алкілу, необов’язково заміщеного п'ятичленним чи шестичленним арильним або гетероарильним циклічним залишком, де вищезгаданий циклічний залишок необов’язково заміщений одним, двома або трьома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки;
аміну формули NХ2Х3, де Х2 і Х3 незалежно вибрані з групи, яка включає водень, насичений або ненасичений алкіл і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки;
галогену або тригалогенметилу;
кетону формули -СО-Х4, де Х4 вибирають з групи, яка включає водень, алкіл та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки;
карбонової кислоти формули -(Х5)n-СООН або складного ефіру формули -(Х6)n-СОО-Х7, де X5, Х6 і X7 незалежно вибрані з групи, яка включає алкіл та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки, і де n - це 0 або 1;
спирту формули (Х8)n-ОН або алкокси-залишку формули -(Х8)n-O-Х9, де Х8 і Х9 незалежно вибрані з групи, яка включає водень, насичений або ненасичений алкіл і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки, кільце яких необов’язково заміщене одним або кількома замісниками, незалежно вибраними з групи, яка включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки, і де n - це 0 або 1;
аміду формули -NНСОХ10, де Х10 вибирають з групи, яка включає алкіл, гідроксил і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки, кільце яких необов’язково заміщене одним або кількома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро або складноефірні залишки;
-SO2NX11X12, де Х11 і Х12 незалежно вибирають з групи, яка включає водень, алкіл та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки;
п'ятичленного чи шестичленного арильного або гетероарильного циклічного залишку, необов’язково заміщеного одним, двома або трьома замісниками, незалежно вибраними з групи, яка включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки;
альдегіду формули -СО-Н; та
сульфону формули -SO2-Х13, де Х13 вибраний з групи, яка включає насичений або ненасичений алкіл й п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки; та
(б) Х1 вибирають з групи, яка складається з азоту, сірки та кисню.
11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що вищезгадані R1, R2 R3, R4 i R6 незалежно вибрані з групи, яка включає
водень;
насичений або ненасичений алкіл, необов’язково заміщений п'ятичленним або шестичленним арильним або гетероарильним циклічним залишком, кільце якого необов’язково заміщене одним, двома або трьома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, гідрокси, алкокси, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки; і
п'ятичленний або шестичленний арильний або гетероарильний циклічний залишок, необов’язково заміщений одним, двома або трьома замісниками, незалежно вибраними з групи, яка включає алкіл, галоген, тригалогенметил, гідрокси, алкокси, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки.
12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що вищезгадані R1 і R2 незалежно вибрані з групи, яка включає
водень; і
феніл, необов’язково заміщений замісником, вибраним з групи, яка включає алкіл, галоген, тригалогенметил, нітро, карбоксилат, гідрокси- та алкокси-залишки.
13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що вищезгаданий Х1 - це азот або кисень.
14. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим, що вищезгадані замісники R6 і Х1 об’єднані та утворюють залишок R6Х1, а R1 та R2 вибирають з групи, яка включає замісники, представлені в таблиці:
Продовження таблиці
Продовження таблиці
Продовження таблиці
15. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що вищезгадана сполука є похідною 5-азахіноксаліну, яка вибрана з групи, що включає сполуки SAQAR, представлені у таблиці за п. 14.
16. Спосіб запобігання або лікування хвороби в організмі, який відрізняється тим, що у вказаний організм вводять сполуки похідної 5-азахіноксаліну формули І
де
(а) R1, R2 R3, R4 і R6 незалежно вибирають з групи, яка складається з:
водню;
насиченого або ненасиченого алкілу, необов’язково заміщеного п'ятичленним чи шестичленним арильним або гетероарильним циклічним залишком, де вищезгаданий циклічний залишок необов’язково заміщений одним, двома або трьома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки;
аміну формули NХ2Х3, де Х2 і Х3 незалежно вибрані з групи, яка включає водень, насичений або ненасичений алкіл і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки;
галогену або тригалогенметилу;
кетону формули -СО-Х4, де Х4 вибирають з групи, яка включає водень, алкіл та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки;
карбонової кислоти формули -(Х5)n-СООН або складного ефіру формули -(Х6)n-СОО-Х7, де X5, Х6 і X7 незалежно вибрані з групи, яка включає алкіл та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки, і де n - це 0 або 1;
спирту формули (Х8)n-ОН або алкокси-залишку формули -(Х8)n-O-Х9, де Х8 і Х9 незалежно вибрані з групи, яка включає водень, насичений або ненасичений алкіл і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки, кільце яких необов’язково заміщене одним або кількома замісниками, незалежно вибраними з групи, яка включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки, і де n - це 0 або 1;
аміду формули -NНСОХ10, де Х10 вибирають з групи, яка включає алкіл, гідроксил і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки, кільце яких необов’язково заміщене одним або кількома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро або складноефірні залишки;
-SO2NX11X12, де Х11 і Х12 незалежно вибирають з групи, яка включає водень, алкіл та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки;
п'ятичленного чи шестичленного арильного або гетероарильного циклічного залишку, необов’язково заміщеного одним, двома або трьома замісниками, незалежно вибраними з групи, яка включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки;
альдегіду формули -СО-Н; та
сульфону формули -SO2-Х13, де Х13 вибраний з групи, яка включає насичений або ненасичений алкіл й п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки; та
(б) Х1 вибирають з групи, яка складається з азоту, сірки та кисню.
17. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що R1, R2 R3, R4 i R6 незалежно вибрані з групи, яка включає
водень;
насичений або ненасичений алкіл, необов’язково заміщений п'ятичленним або шестичленним арильним або гетероарильним циклічним залишком, кільце якого необов’язково заміщене одним, двома або трьома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, гідрокси, алкокси, карбоксилат, нітро- та складноефірні залишки; і
п'ятичленний або шестичленний арильний або гетероарильний циклічний залишок, необов’язково заміщений одним, двома або трьома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, гідрокси, алкокси, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки.
18. Спосіб за п. 17, який відрізняється тим, що вищезгадані R1 і R2 незалежно вибрані з групи, яка включає
метил, необов’язково заміщений фенілом, який необов’язково заміщений замісниками, які вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, гідрокси- і алкокси-залишки; і
феніл, необов’язково заміщений замісниками, які вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, гідрокси- та алкокси-залишки.
19. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що вищезгаданий Х1 є азотом або киснем.
20. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що вищезгадані замісники R6 і Х1 об’єднані та утворюють залишок R6Х1, а R1 та R2 вибирають з групи, яка включає замісники SAQAR, представлені у таблиці за п.14.
21. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що вищезгадана сполука є похідною 5-азахіноксаліну, яка вибрана з групи, що включає сполуки SAQAR, представлені у таблиці за п.14.
22. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що вищезгаданим організмом є ссавець.
23. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що вищезгаданою хворобою є рак або фіброз.
24. Спосіб за п. 23, який відрізняється тим, що вищезгаданою хворобою є рак, вибраний з групи, яка включає рак легень, рак яєчників, рак грудей, рак мозку, внутрішньоаксіальний рак мозку, рак товстої кишки, рак простати, саркому, саркому Капоші, меланому та гліому.
25. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що вищезгадана хвороба пов'язана з відхиленням у передачі сигналу шляхом, що характеризується взаємодією між сериновою/треоніновою протеїнкіназою й природним партнером, що зв'язується з протеїнкіназою.
26. Спосіб за п. 25, який відрізняється тим, що вищезгаданою сериновою/треоніновою протеїнкіназою є RAF.
27. Сполука, що є похідною 5-азахіноксаліну та має структуру, наведену у формулі І:
де
(а) R1, R2 R3, R4 і R6 незалежно вибирають з групи, яка складається з:
водню;
насиченого або ненасиченого алкілу, необов’язково заміщеного п'ятичленним чи шестичленним арильним або гетероарильним циклічним залишком, де вищезгаданий циклічний залишок необов’язково заміщений одним, двома або трьома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки;
аміну формули NХ2Х3, де Х2 і Х3 незалежно вибрані з групи, яка включає водень, насичений або ненасичений алкіл і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки;
галогену або тригалогенметилу;
кетону формули -СО-Х4, де Х4 вибирають з групи, яка включає водень, алкіл та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки;
карбонової кислоти формули -(Х5)n-СООН або складного ефіру формули -(Х6)n-СОО-Х7, де X5, Х6 і X7 незалежно вибрані з групи, яка включає алкіл та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки, і де n - це 0 або 1;
спирту формули (Х8)n-ОН або алкокси-залишку формули -(Х8)n-O-Х9, де Х8 і Х9 незалежно вибрані з групи, яка включає водень, насичений або ненасичений алкіл і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки, кільце яких необов’язково заміщене одним або кількома замісниками, незалежно вибраними з групи, яка включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки, і де n - це 0 або 1;
аміду формули -NНСОХ10, де Х10 вибирають з групи, яка включає алкіл, гідроксил і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки, кільце яких необов’язково заміщене одним або кількома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро або складноефірні залишки;
-SO2NX11X12, де Х11 і Х12 незалежно вибирають з групи, яка включає водень, алкіл та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки;
п'ятичленного чи шестичленного арильного або гетероарильного циклічного залишку, необов’язково заміщеного одним, двома або трьома замісниками, незалежно вибраними з групи, яка включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки;
альдегіду формули -СО-Н; та
сульфону формули -SO2-Х13, де Х13 вибраний з групи, яка включає насичений або ненасичений алкіл й п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки; та
(б) Х1 вибирають з групи, яка складається з азоту, сірки та кисню.
28. Сполука за п. 27, яка відрізняється тим, що вищезгадані R1, R2 R3, R4 i R6 незалежно вибрані з групи, яка включає
водень;
насичений або ненасичений алкіл, необов’язково заміщений п'ятичленним або шестичленним арильним або гетероарильним циклічним залишком, кільце якого необов’язково заміщене одним, двома або трьома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, гідрокси, алкокси, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки; і
п'ятичленний або шестичленний арильний або гетероарильний циклічний залишок, необов’язково заміщений одним, двома або трьома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенметил, гідрокси, алкокси, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки.
29. Сполука за п. 28, яка відрізняється тим, що вищезгадані R3 і R4 є воднем.
30. Сполука за п. 29, яка відрізняється тим, що вищезгадані R1 і R2 незалежно вибрані з групи, яка включає
метил, необов’язково заміщений фенілом, який необов’язково заміщений замісниками, які вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, гідрокси- і алкокси-залишки; і
феніл, необов’язково заміщений замісниками, які вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, гідрокси- та алкокси-залишки.
31. Сполука за п. 29, яка відрізняється тим, що вищезгадані R1 і R2 незалежно вибрані з групи, яка включає водень, метил, феніл і 4-гідроксифеніл.
32. Сполука за п. 30, яка відрізняється тим, що вищезгаданий Х1 є азотом або киснем.
33. Сполука за п. 32, яка відрізняється тим, що вищезгадані замісники R6 і Х1 об’єднані та утворюють залишок R6Х1, а R1 та R2 вибирають з групи, яка включає замісники SAQAR, представлені у таблиці за п.14.
34. Сполука за п. 33, яка відрізняється тим, що вищезгадана сполука є похідною 5-азахіноксаліну, яка вибрана з групи, що включає сполуки SAQAR, представлені у таблиці за п.14.
35. Фармацевтична композиція, яка включає сполуку 5-азахіноксаліну за будь-яким одним з пп. 27-34 або її сіль і фізіологічно прийнятний носій або розріджувач.
36. Спосіб синтезу сполуки за п. 27, який включає стадії
взаємодію першого реагенту з другим реагентом в розчиннику та у присутності основи з утворенням першої проміжної речовини, де вищезгаданим першим реагентом є 2-аміно-6-хлор-3-нітропіридин і де вищезгаданим другим реагентом є спирт або амін,
взаємодію вищезгаданої першої проміжної речовини з третім реагентом в присутності каталізатора та відновлюючого агента, де вищезгаданим третім реагентом є 1,2-діон, і
очищення продукту.
37. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що вищезгаданий другий реагент вибраний з групи, яка включає реагенти SAQAR, представлені у таблиці за п.14.
38. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що вищезгаданий третій реагент вибраний з групи, яка включає 4-гідроксифенілгліоксал, 1-феніл-1,2-пропандіон та бензил.
39. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що вищезгаданим відновлюючим агентом є водень.
40. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що вищезгаданим каталізатором є нікелевий каталізатор Ренея.
Текст
1. Спосіб модулювання функції серинової/треонінової протеїнкінази, який включає стадію впливу на клітини, що експресують вищезгадану серинову/треонінову протеїнкіназу сполукою, що є похідною 5-азахіноксаліну. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вищезгаданою сериновою/треоніновою протеїнкіназою є RAF. 3. Спосіб ідентифікації сполук, що модулюють функцію серинової/треонінової протеїнкінази, який включає наступні стадії: вплив на клітини, що експресують вищезгадану серинову/треонінову протеїнкіназу, вищезгаданої сполуки, і моніторинг ефекту на ви щезгадані клітини. 4. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що вищезгаданим ефектом є зміна або відсутність зміни фенотипу клітини. 5. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що вищезгаданим ефектом є зміна або відсутність зміни в проліферації клітини. 6. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що вищезгаданим ефектом є зміна або відсутність зміни в каталітичній активності вищезгаданої серинової/треонінової протеїнкінази. 2 (19) 1 3 71555 4 (а) R1, R2 R3, R4 і R6 незалежно вибирають з групи, або шестичленні арильні або гетероарильні залияка складається з: шки; водню; п'ятичленного чи шестичленного арильного або насиченого або ненасиченого алкілу, необгетероарильного циклічного залишку, необов’язково заміщеного п'ятичленним чи шестиов’язково заміщеного одним, двома або трьома членним арильним або гетероарильним циклічним замісниками, незалежно вибраними з групи, яка залишком, де вищезгаданий циклічний залишок включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбокнеобов’язково заміщений одним, двома або трьосилат, нітро та складноефірні залишки; ма замісниками, які незалежно вибрані з групи, що альдегіду формули -СО-Н; та включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксульфону формули -SO 2-Х13 , де Х13 вибраний з силат, нітро та складноефірні залишки; групи, яка включає насичений або ненасичений аміну формули NХ2 Х3 , де Х2 і Х3 незалежно вибраалкіл й п'ятичленні або шестичленні арильні або ні з групи, яка включає водень, насичений або гетероарильні залишки; та ненасичений алкіл і п'ятичленні або шестичленні (б) Х1 вибирають з групи, яка складається з азоту, арильні або гетероарильні циклічні залишки; сірки та кисню. галогену або тригалогенметилу; 11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що кетону формули -СО-Х4, де Х4 вибирають з групи, вищезгадані R1, R2 R3, R4 i R6 незалежно вибрані з яка включає водень, алкіл та п'ятичленні або шесгрупи, яка включає тичленні арильні або гетероарильні залишки; водень; карбонової кислоти формули -(Х5) n-СООН або насичений або ненасичений алкіл, необов’язково складного ефіру формули -(Х6)n-СОО-Х7, де X5 , Х6 заміщений п'ятичленним або шестичленним ариі X7 незалежно вибрані з групи, яка включає алкіл льним або гетероарильним циклічним залишком, та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетекільце якого необов’язково заміщене одним, двома роарильні циклічні залишки, і де n - це 0 або 1; або трьома замісниками, які незалежно вибрані з спирту формули (Х8)n-ОН або алкокси-залишку групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенмеформули -(Х8)n-O-Х9, де Х8 і Х9 незалежно вибрані тил, гідрокси, алкокси, карбоксилат, нітро та склаз групи, яка включає водень, насичений або ненадноефірні залишки; і сичений алкіл і п'я тичленні або шестичленні арип'ятичленний або шестичленний арильний або льні або гетероарильні циклічні залишки, кільце гетероарильний циклічний залишок, необов’язково яких необов’язково заміщене одним або кількома заміщений одним, двома або трьома замісниками, замісниками, незалежно вибраними з групи, яка незалежно вибраними з групи, яка включає алкіл, включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбокгалоген, тригалогенметил, гідрокси, алкокси, карсилат, нітро та складноефірні залишки, і де n - це боксилат, нітро та складноефірні залишки. 0 або 1; 12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що аміду формули -NНСОХ10, де Х10 вибирають з грувищезгадані R1 і R2 незалежно вибрані з групи, яка пи, яка включає алкіл, гідроксил і п'ятичленні або включає водень; і феніл, необов’язково заміщений шестичленні арильні або гетероарильні циклічні замісником, вибраним з групи, яка включає алкіл, залишки, кільце яких необов’язково заміщене одгалоген, тригалогенметил, нітро, карбоксилат, гідним або кількома замісниками, які незалежно виброкси- та алкокси-залишки. рані з групи, що включає алкіл, галоген, тригало13. Спосіб за п. 12, який відрізняється тим, що генметил, карбоксилат, нітро або складноефірні вищезгаданий Х1 - це азот або кисень. залишки; 14. Спосіб за п. 13, який відрізняється тим,що -SO2N X11 X12, де Х11 і Х12 незалежно вибирають з вищезгадані замісники R6 і Х1 об’єднані та утвогрупи, яка включає водень, алкіл та п'ятичленні рюють залишок R6Х1, а R1 та R2 вибирають з групи, яка включає замісники, представлені в таблиці: 5 71555 6 7 71555 15. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що вищезгадана сполука є похідною 5-азахіноксаліну, яка вибрана з групи, що включає сполуки SAQAR, представлені у таблиці за п. 14. 16. Спосіб запобігання або лікування хвороби в організмі, який відрізняється тим, що у вказаний організм вводять сполуки похідної 5-азахіноксаліну формули І R R R 6 N 4 X1 3 N R 2 N R 1 (I), де (а) R1, R2 R3, R4 і R6 незалежно вибирають з групи, яка складається з: водню; насиченого або ненасиченого алкілу, необов’язково заміщеного п'ятичленним чи шестичленним арильним або гетероарильним циклічним залишком, де вищезгаданий циклічний залишок необов’язково заміщений одним, двома або трьома замісниками, які незалежно вибрані з групи, що 8 включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоксилат, нітро та складноефірні залишки; аміну формули NХ2 Х3 , де Х2 і Х3 незалежно вибрані з групи, яка включає водень, насичений або ненасичений алкіл і п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки; галогену або тригалогенметилу; кетону формули -СО-Х4, де Х4 вибирають з групи, яка включає водень, алкіл та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки; карбонової кислоти формули -(Х5) n-СООН або складного ефіру формули -(Х6)n-СОО-Х7, де X5 , Х6 і X7 незалежно вибрані з групи, яка включає алкіл та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки, і де n - це 0 або 1; спирту формули (Х8)n-ОН або алкокси-залишку формули -(Х8)n-O-Х9, де Х8 і Х9 незалежно вибрані з групи, яка включає водень, насичений або ненасичений алкіл і п'я тичленні або шестичленні арильні або гетероарильні циклічні залишки, кільце яких необов’язково заміщене одним або кількома замісниками, незалежно вибраними з групи, яка включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбок 9 71555 10 силат, нітро та складноефірні залишки, і де n - це 22. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що 0 або 1; вищезгаданим організмом є ссавець. аміду формули -NНСОХ10, де Х10 вибирають з гру23. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що пи, яка включає алкіл, гідроксил і п'ятичленні або вищезгаданою хворобою є рак або фіброз. шестичленні арильні або гетероарильні циклічні 24. Спосіб за п. 23, який відрізняється тим, що залишки, кільце яких необов’язково заміщене одвищезгаданою хворобою є рак, вибраний з групи, ним або кількома замісниками, які незалежно вибяка включає рак легень, рак яєчників, рак грудей, рані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалорак мозку, внутрішньоаксіальний рак мозку, рак генметил, карбоксилат, нітро або складноефірні товстої кишки, рак простати, саркому, саркому залишки; Капоші, меланому та гліому. -SO2N X11 X12, де Х11 і Х12 незалежно вибирають з 25. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що групи, яка включає водень, алкіл та п'ятичленні вищезгадана хвороба пов'язана з відхиленням у або шестичленні арильні або гетероарильні залипередачі сигналу шляхом, що характеризується шки; взаємодією між сериновою/треоніновою протеїнкіп'ятичленного чи шестичленного арильного або назою й природним партнером, що зв'язується з гетероарильного циклічного залишку, необпротеїнкіназою. ов’язково заміщеного одним, двома або трьома 26. Спосіб за п. 25, який відрізняється тим, що замісниками, незалежно вибраними з групи, яка вищезгаданою сериновою/треоніновою протеїнківключає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбокназою є RAF. силат, нітро та складноефірні залишки; 27. Сполука, що є похідною 5-азахіноксаліну та альдегіду формули -СО-Н; та має структур у, наведену у формулі І: сульфону формули -SO 2-Х13 , де Х13 вибраний з R3 групи, яка включає насичений або ненасичений R2 R4 N алкіл й п'ятичленні або шестичленні арильні або гетероарильні залишки; та R6 (б) Х1 вибирають з групи, яка складається з азоту, X1 N N R1 (I), сірки та кисню. де 17. Спосіб за п. 16, який відрізняється тим, що (а) R1, R2 R3, R4 і R6 незалежно вибирають з групи, R1, R2 R3 , R4 i R6 незалежно вибрані з групи, яка яка складається з: включає водню; водень; насиченого або ненасиченого алкілу, необнасичений або ненасичений алкіл, необов’язково ов’язково заміщеного п'ятичленним чи шестичлензаміщений п'ятичленним або шестичленним ариним арильним або гетероарильним циклічним зальним або гетероарильним циклічним залишком, лишком, де вищезгаданий циклічний залишок кільце якого необов’язково заміщене одним, двома необов’язково заміщений одним, двома або трьоаботрьома замісниками, які незалежно вибрані з ма замісниками, які незалежно вибрані з групи, що групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенмевключає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбоктил, гідрокси, алкокси, карбоксилат, нітро- та скласилат, нітро та складноефірні залишки; дноефірні залишки; і аміну формули NХ2 Х3 , де Х2 і Х3 незалежно вибрап'ятичленний або шестичленний арильний або ні з групи, яка включає водень, насичений або негетероарильний циклічний залишок, необов’язково насичений алкіл і п'ятичленні або шестичленні заміщений одним, двома або трьома замісниками, арильні або гетероарильні циклічні залишки; які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, галогену або тригалогенметилу; галоген, тригалогенметил, гідрокси, алкокси, каркетону формули -СО-Х4, де Х4 вибирають з групи, боксилат, нітро та складноефірні залишки. яка включає водень, алкіл та п'ятичленні або шес18. Спосіб за п. 17, який відрізняється тим, що тичленні арильні або гетероарильні залишки; вищезгадані R1 і R2 незалежно вибрані з групи, яка карбонової кислоти формули -(Х5) n-СООН або включає складного ефіру формули -(Х6)n-СОО-Х7, де X5 , Х6 метил, необов’язково заміщений фенілом, який і X7 незалежно вибрані з групи, яка включає алкіл необов’язково заміщений замісниками, які вибрані та п'ятичленні або шестичленні арильні або гетез групи, що включає алкіл, галоген, гідрокси- і алроарильні залишки, і де n - це 0 або 1; кокси-залишки; і спирту формули (Х8)n-ОН або алкокси-залишку феніл, необов’язково заміщений замісниками, які формули -(Х8)n-O-Х9, де Х8 і Х9 незалежно вибрані вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, гідроз групи, яка включає водень, насичений або ненакси- та алкокси-залишки. сичений алкіл і п'я тичленні або шестичленні ари19. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що льні або гетероарильні циклічні залишки, кільце вищезгаданий Х1 є азотом або киснем. яких необов’язково заміщене одним або кількома 20. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що замісниками, незалежно вибраними з групи, яка вищезгадані замісники R6 і Х1 об’єднані та утвовключає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбокрюють залишок R6Х1, а R1 та R2 вибирають з групи, силат, нітро та складноефірні залишки, і де n - це яка включає замісники SAQAR, представлені у 0 або 1; таблиці за п.14. аміду формули -NНСОХ10, де Х10 вибирають з гру21. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що пи, яка включає алкіл, гідроксил і п'ятичленні або вищезгадана сполука є похідною 5-азахіноксаліну, шестичленні арильні або гетероарильні циклічні яка вибрана з групи, що включає сполуки SAQAR, залишки, кільце яких необов’язково заміщене одпредставлені у таблиці за п.14. ним або кількома замісниками, які незалежно виб 11 71555 12 рані з групи, що включає алкіл, галоген, тригалофеніл, необов’язково заміщений замісниками, які генметил, карбоксилат, нітро або складноефірні вибрані з групи, що включає алкіл, галоген, гідрозалишки; кси- та алкокси-залишки. -SO2N X11 X12, де Х11 і Х12 незалежно вибирають з 31. Сполука за п. 29, яка відрізняється тим, що групи, яка включає водень, алкіл та п'ятичленні вищезгадані R1 і R2 незалежно вибрані з групи, яка або шестичленні арильні або гетероарильні заливключає водень, метил, феніл і 4-гідроксифеніл. шки; 32. Сполука за п. 30, яка відрізняється тим, що п'ятичленного чи шестичленного арильного або вищезгаданий Х1 є азотом або киснем. гетероарильного циклічного залишку, необ33. Сполука за п. 32, яка відрізняється тим, що ов’язково заміщеного одним, двома або трьома вищезгадані замісники R6 і Х1 об’єднані та утвозамісниками, незалежно вибраними з групи, яка рюють залишок R6Х1, а R1 та R2 вибирають з групи, включає алкіл, галоген, тригалогенметил, карбокяка включає замісники SAQAR, представлені у силат, нітро та складноефірні залишки; таблиці за п.14. альдегіду формули -СО-Н; та 34. Сполука за п. 33, яка відрізняється тим, що сульфону формули -SO 2-Х13 , де Х13 вибраний з вищезгадана сполука є похідною 5-азахіноксаліну, групи, яка включає насичений або ненасичений яка вибрана з групи, що включає сполуки SAQAR, алкіл й п'ятичленні або шестичленні арильні або представлені у таблиці за п.14. гетероарильні залишки; та 35. Фармацевтична композиція, яка включає спо(б) Х1 вибирають з групи, яка складається з азоту, луку 5-азахіноксаліну за будь-яким одним з пп. 27сірки та кисню. 34 або її сіль і фізіологічно прийнятний носій або 28. Сполука за п. 27, яка відрізняється тим, що розріджувач. вищезгадані R1, R2 R3, R4 i R6 незалежно вибрані з 36. Спосіб синтезу сполуки за п. 27, який включає групи, яка включає стадії водень; взаємодію першого реагенту з другим реагентом в насичений або ненасичений алкіл, необов’язково розчиннику та у присутності основи з утворенням заміщений п'ятичленним або шестичленним арипершої проміжної речовини, де вищезгаданим пельним або гетероарильним циклічним залишком, ршим реагентом є 2-аміно-6-хлор-3-нітропіридин і кільце якого необов’язково заміщене одним, двома де вищезгаданим другим реагентом є спирт або або трьома замісниками, які незалежно вибрані з амін, групи, що включає алкіл, галоген, тригалогенмевзаємодію вищезгаданої першої проміжної речотил, гідрокси, алкокси, карбоксилат, нітро та склавини з третім реагентом в присутності каталізатодноефірні залишки; і ра та відновлюючого агента, де ви щезгаданим п'ятичленний або шестичленний арильний або третім реагентом є 1,2-діон, і гетероарильний циклічний залишок, необов’язково очищення продукту. заміщений одним, двома або трьома замісниками, 37. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що які незалежно вибрані з групи, що включає алкіл, вищезгаданий другий реагент вибраний з групи, галоген, тригалогенметил, гідрокси, алкокси, каряка включає реагенти SAQAR, представлені у таббоксилат, нітро та складноефірні залишки. лиці за п.14. 29. Сполука за п. 28, яка відрізняється тим, що 38. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що вищезгадані R3 і R4 є воднем. вищезгаданий третій реагент вибраний з групи, 30. Сполука за п. 29, яка відрізняється тим, що яка включає 4-гідроксифенілгліоксал, 1-феніл-1,2вищезгадані R1 і R2 незалежно вибрані з групи, яка пропандіон та бензил. включає 39. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що метил, необов’язково заміщений фенілом, який вищезгаданим відновлюючим агентом є водень. необов’язково заміщений замісниками, які вибрані 40. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що з групи, що включає алкіл, галоген, гідрокси- і алвищезгаданим каталізатором є нікелевий каталізакокси-залишки; і тор Ренея. Наведений опис допомагає зрозуміти винахід, але не є рівнем техніки винаходу. Клітинна сигналізація є фундаментальним механізмом, в якому зовнішні стимули регулюють різноманітні клітинні процеси. Одним з ключових біохімічних механізмів передачі сигналу є оборотне фосфорилування білків, що дозволяє регулювати активність повністю розвинутих білків, змінюючи їх стр уктур у та функцію. Найкраще описані протеїнкінази еукаріот, що фосфорилують білки по спиртовій групі серинових, треонінових та тирозинових залишків. Ці кінази поділяються на дві групи: специфічні до фосфорилування серину й треоніну; і специфічні до фос форилування тирозину. Деякі кінази, що мають "подвійну специфічність", здатні до фосфорилування по тирозину, а також по залишкам серину/треоніну. Протеїнкінази можуть також бути о характеризовані за їх розташуванням всередині клітини. Деякі кінази є трансмембранними рецепторними білками, здатними зв'язувати ліганди зовні клітинної мембрани. Зв'язування лігандів змінює рецепторну протеїнкіназну каталітичну активність. Інші є нерецепторними білками, що не містять трансмембранного домену. Нерецепторні протеїнкінази знаходяться в багатьох клітинних компартментах від внутрішньої поверхні клітинної мембрани до ядра. 13 71555 14 Багато кіназ беруть участь у регуляторних касутворювати сполуки, здатні модулювати функції кадах, де до їх субстратів можуть належати інші окремих протеїнкіназ. кінази, чия активність регулюється їх станом фосЦей винахід частково стосується способів мофорилування. Кінець кінцем, активність підлеглого дулювання функції серинових/треонінових протеїефектора модулюється фосфорилуванням внаслінкіназ сполуками - похідними 5-азахіноксаліну. док активації такого шляху. Способи включають клітини, що експресують сеДо сімейства серинових/треонінових кіназ наринову/треонінову протеїнкіназу, таку як RAP. Крім лежать члени, що регулюють багато ланок каскатого, винахід описує способи запобігання й лікудів сигналізації, включаючи каскади, що контровання хвороб, пов'язаних з серинолюють ріст клітини, міграцію, диференціацію, вою/треоніновою протеїнкіназою, у організмах експресію генів, скорочення м'язів, метаболізм сполукою, що визначається способами, описаними глюкози, синтез білків у клітині й регулювання клів цьому винаході. Крім того, винахід стосується тинного циклу. фармацевтичних композицій, які складаються зі Прикладом нерецепторних протеїнкіназ, що сполук, що визначаються способами, описаними в фосфорилують білкові мішені по залишках серину цьому винаході. та треоніну, є RAF. R AF модулює каталітичну ак1. Способи скринінгу сполук, що модулюють тивність інших протеїнкіназ, наприклад, протеїнкіфункцію серинової/треонінової протеїнкінази нази, що фосфорилує й таким чином активує актиСпособи цього винаходу пропонують засоби вовану мітогеном протеїнкіназу (МАРК). Сама RAF модулювання функцій рецепторних і цитозольних активується мембранозв'язаним білком RAS, який серинових/треонінових протеїнкіназ. Ці способи у свою чергу активується у відповідь на активовані пропонують засоби модулювання ферментів in лігандом рецепторні тирозинпротеїнкінази, такі як vitro та in vivo. Для застосування in vitro способи рецептор епідермального фактора росту (EGFR) і винаходу стосуються частково способу ідентифірецептор тромбоцитарного фактора росту кації сполук, що модулюють функцію серино(PDGFR). Біологічна важливість RAF у контролювих/треонінових протеїнкіназ. ванні клітинних процесів є особливою, зокрема Таким чином, у першому аспекті винахід стозавдяки тому факту, що змінені форми RAF мосується способу модулювання функції сериножуть викликати рак в організмах. Доказ важливості вої/треонінової протеїнкінази сполукою - похідною RAF у злоякісності наведений у Monia et al., 1996, азабензімідазолу. Азабензімідазолова сполука за Nature Medicine 2:668, представлений тут шляхом бажанням заміщена органічними групами. Спосіб посилання, включаючи всі малюнки та таблиці. полягає у впливі сполуки на клітини, що експресуДля винайдення нових способів лікування раку ють серинову/треонінову протеїнкіназу. й інших хвороб, дослідники в біомедичній галузі й Термін "функція" стосується ролі серинохіміки розробили, синтезували й тестували молевої/треонінової протеїнкінази в клітині. До сімейсткули, що інгібують функцію протеїнкіназ. Деякі малі ва серинових/треонінових протеїнкіназ належать органічні молекули утворюють клас сполук, що члени, що регулюють багато ланок у сигнальних модулюють функцію протеїнкіназ. До прикладів каскадах, включаючи каскади, що контролюють молекул, що інгібують функцію протеїнкіназ, налеріст клітин, міграцію, диференціацію, експресію жать моноциклічні, біциклічні або гетероциклічні генів, скорочення м'язів, метаболізм глюкози, синарильні сполуки (РСТ WO 92/20642), такі як вінітез білків в клітині й регулювання клітинного циклу. лен-азаіндольні похідні (РСТ WO 94/14808), 1Термін "каталітична активність" в контексті вициклопропіл-4-піридилхінолони (патент США находу стосується швидкості, за якої протеїнкіназа №5330992), стирилові сполуки (Levitzki, et al., пафосфорилує субстрат. Каталітичн у активність мотент США №5217999, і "Стирилові сполуки, що жна виміряти як функцію часу, наприклад, визнаінгібують EGF рецепторні тирозинкінази", Lyon і ченням кількості субстрату, перетвореного на проLyon, Docket №208/050), стирилзаміщені піридидукт. Фосфорилування субстрату відбувається в лові сполуки (патент США №5,302,606), певні хінаактивному центрі протеїнкінази. Активний центр золінові похідні (Європейська патентна заявка це западина, в який субстрат зв'язується з протеї№0566266 АІ), селеоіндоли та селеніди (РСТ WO нкіназою й піддається фосфорилуванню. 94/03427), трициклічні полігідроксильні сполуки Термін "субстрат", що використовується в (РСТ WO 92/21660) і сполуки бензилфосфонової цьому винаході, стосується молекули, що фосфокислоти (РСТ WO 91/15495). рилується сериновою/треоніновою протеїнкіназою. Сполуки, що можуть проникати крізь клітинні Краще, якщо субстратом є пептид, і ще краще мембрани й є резистентними до кислотного гідробілок. Стосовно протеїнкінази RAF, кращими сублізу, є потенційно кращими терапевтичними засостратами є МЕК, а субстратом МЕК - МАРК. бами, оскільки вони можуть становитися високобіТермін "активує" стосується підвищення кліодоступними після орального введення пацієнтам. тинної функції протеїнкінази. Краще, якщо функціПроте, багато з цих інгібіторів протеїнкіназ лише єю протеїнкінази є взаємодія з природним партнеслабко інгібують функцію протеїнкіназ. Крім того, ром, що зв'язується з нею, і найкраща каталітична багато з них інгібують багато протеїнкіназ і, таким активність. чином, викликатимуть чисельні побічні ефекти в Термін "інгібувати" стосується зменшення фуякості терапевтичного засобу проти хвороби. нкції протеїнкінази в клітині. Краще, якщо функцією Незважаючи на значний прогрес, що був досяпротеїнкінази є взаємодія з природним партнером, гнутий у створенні сполук для лікування раку, в що зв'язується з нею, і найкраща каталітична акгалузі залишається потреба ідентифікації окремих тивність. структур і протоколів заміщення, що дають змогу Термін "модулює" стосується зміни функції 15 71555 16 протеїнкінази за рахунок підвищення або зменбілки. шення вірогідності того, що утворюється комплекс Термін "піддавання дії", що використовується між протеїнкіназою й природним партнером, що в цьому винаході, стосується змішування розчину, зв'язується з нею. Краще, якщо модулятор підвищо складається з 5-азахіноксалінової сполуки вищує вірогідність того, що такий комплекс утворюнаходу, з рідким середовищем, що містить клітини ється між протеїнкіназою й природним партнером, згідно із способом. Розчин, що містить сполуку, що зв'язується з нею, ще краще, якщо підвищує може також містити інший компонент, такий як або зменшує вірогідність того, що утворюється диметилсульфоксид (DMSO), який полегшує прокомплекс між протеїнкіназою й природним партненикнення 5-азахіноксалінової сполуки або сполук у ром, що зв'язується з нею, залежно від концентраклітини згідно із способом. Розчин, що містить 5ції сполуки, яку перетворює протеїнкіназа, і найазахіноксалінову сполуку, може бути доданий до краще, якщо зменшує вірогідність того, що середовища, що містить клітини, використовуючи утворюється комплекс між протеїнкіназою й припристрій для переносу, наприклад, такий, що в родним партнером, що зв'язується з нею. Краще, основі має піпетку або шприц. якщо модулятор активує каталітичну активність Термін "5-азахіноксалінова сполука" стосуєтьпротеїнкінази, ще краще, якщо активує або інгібує ся 5-азахіноксалінової органічної сполуки, заміщекаталітичну активність протеїнкінази залежно від ної на хімічні замісники. 5-азахіноксалінові сполуки концентрації сполуки, що перетворює протеїнкінамають загальну стр уктур у: за, або найкраще, якщо інгібує каталітичну активність протеїнкінази. Термін «комплекс» стосується з'єднання принаймні двох молекул, зв'язаних одна з одною. Термін "заміщений", у цьому винаході стосуКомплекси передачі сигналу часто містять приється 5-азахіноксалінової сполуки, що є похідною з наймні дві білкових молекули, зв'язаних одна з будь-якою кількістю хімічних замісників. одною. Наприклад, рецепторна тирозинова протеУ кращому втіленні винахід стосується спосоїнкіназа GRB2, SOS, RAF і RAS з'єднується з утвобу модулювання функції серинової/треонінової ренням комплексу передачі сигналу у відповідь на протеїнкінази, де протеїнкіназою є RAF. мітогенний ліганд. Протеїнкіназа RAF фосфорилує білкові мішені Термін «природний зв'язуючий партнер» стопо серинових або треонінових залишках. Однією сується поліпептидів, що зв'язуються з протеїнкітакою білковою мішенню є протеїнкіназа (МЕК), назою в клітинах. Природні партнери, що зв'язущо фосфорилує й в результаті активує протеїнкіються з протеїнкіназами, можуть відігравати певну назу, що активується мітогеном (МАРК). Сам RAF роль у передачі сигналу в процесі передачі сигнаактивується мембранозв'язаним гуанінтрифосфатлу протеїнкіназою. Зміна у взаємодії протеїнкінази гідролізуючим ферментом RAS у відповідь на рей природного партнера, що зв'язується з нею, моцепторні тирозинкінази, що активуються мітогеже виявитись як підвищена або зменшена вірогідном, такі як рецептор епідермального фактора ність того, що утворюється взаємодія, або підвиросту (EGFR) і рецептор тромбоцитарного фактощена, або зменшена концентрація комплексу ра росту (PDGFR). протеїнкінази/природного партнера, що зв'язуєтьСпособи цього винаходу можуть визначити ся з нею. сполуки, що модулюють функцію протеїнкінази Природний партнер, що зв'язується з протеїнRAF в клітинах. R AF фосфорилує протеїнкіназу кіназою, може зв'язуватись з внутрішньоклітинною (МЕК), яка, у свою чергу, фосфорилує протеїнкіначастиною протеїнкінази з високою афінністю. Визу, що активується мітогеном (МАРК). Тести, що сока афінність представляє рівновагу константи виявляють лише фосфорилування МЕК за допозв'язування порядку 10-6Μ або менше. Крім того, могою RAF, не є чутливими, тому що фосфорилуприродний партнер, що зв'язується з протеїнкінавання МЕК є незначним. Для подолання цієї прозою, може також короткочасно взаємодіяти з внутблеми проводять фосфорилування МЕК і МАРК у рішньоклітинною частиною протеїнкінази й хімічно тестах цього винаходу. Сигнал фосфорилування модифікувати її. Природні партнери, що зв'язуютьМАРК підсилює сигнал фосфорилування МЕК і ся з протеїнкіназою, вибрані з групи, до якої налетому дозволяє виконувати RAF-залежне фосфожать, крім іншого, гомологічні домени SRC - 2 рилування, таке як ферментний імуносорбентний (SH2) або 3 (SH3), інші фосфорилтирозинзв'язуючі аналіз. Крім того, тест винаходу виконують з висо(РТВ) домени, фактори обміну гуанінових нуклеоким виходом так, що багато сполук можуть бути тидів, фосфа тази білків та інші протеїнкінази. Легшвидко виявлені за короткий проміжок часу. кодоступними є способи визначення змін у взаєВ іншому аспекті винахід описує спосіб визнамодіях між протеїнкіназами та їх природними чення сполук, що модулюють функцію серинопартнерами, що зв'язуються з ними. вої/треонінової протеїнкінази, що складається з Термін "серинова/треонінова протеїнкіназа" етапів піддавання клітин, що експресують сериностосується ферменту, що має послідовність амінову/треонінову протеїнкіназу, дії сполуки і виявленкислот з принаймні 10% амінокислотною ідентичня впливу на клітини. ністю у порівнянні з іншими ферментами, що фоТермін "виявлення" стосується спостерігання сфорилують білки по залишках серину та треоніну. ефекту додавання сполуки до клітин згідно із споСеринова/треонінова протеїнкіназа каталізує дособом цього винаходу. Вплив може проявлятися давання фосфату до залишків серину та треоніну як зміна фенотипу клітини, проліферації клітини, білків. Серинові/треонінові протеїнкінази можуть каталітичної активності протеїнкінази або як взаєіснувати як мембранозв'язані білки або цитозольні 17 71555 18 модія між протеїнкіназою та природним партнепротеїнкінази, яка існує назовні клітини. ром, що зв'язується з протеїнкіназою. У кращому втіленні винахід стосується спосоТермін "вплив" стосується зміни або відсутнобу визначення сполук, що модулюють функцію сті зміни фенотипу клітини, або проліферації клісеринової/треонінової протеїнкінази, що складатини. "Вплив" може також стосуватися зміни або ється з наступних етапів: (а) лізису клітин для одевідсутності зміни в каталітичній активності протеїнржання лізату, що містить серинову/треонінову кінази. "Вплив" може також стосуватися змін або протеїнкіназу; (б) адсорбції серинової/треонінової відсутності зміни у взаємодії між протеїнкіназою й протеїнкінази до антитіла; (в) інкубування адсорприродним партнером, що зв'язується з протеїнкібованої серинової/треонінової протеїнкінази з субназою. стратом або субстратами; і (г) адсорбції субстрату Краще втілення винаходу стосується способу або субстратів до твердої основи або антитіла. визначення сполук, що модулюють функцію сериЕтап спостерігання впливу на клітини складається нової/треонінової протеїнкінази, де вплив виражаз вимірювання концентрації фосфату субстрату ється як зміна або відсутність зміни фенотипу кліабо субстратів. тини. Термін "лізис", що використовується в цьому Термін "фенотип клітини" стосується зовнішвинаході, стосується способу руйнування цілісноснього вигляду клітини чи тканини або функції кліті клітини так, що її внутрішній вміст вивільнюєтьтини чи тканини. До прикладів фенотипу клітини ся. Лізис клітин виконується багатьма способами, належать розмір клітини (зменшення або збільвідомими фахівцям у галузі. Краще, якщо за допошення), проліферація клітини (підвищення або могою обробки ультразвуком або ще краще, якщо зменшення кількості клітин), диференціація клітин за допомогою детергенту. (зміна або відсутність зміни у формі клітини), виТермін "антитіло", що використовується в цьоживаність клітин, апоптоз (смерть клітин), або виму винаході, стосується білкової молекули, що користання метаболічної поживної речовини (наспецифічно зв'язується з протеїнкіназою. Краще, приклад, поглинання глюкози). Зміна або якщо антитіло зв'язується з одним класом протеїнвідсутність зміни фенотипу клітини легко визначакіназ, і ще краще, якщо специфічно зв'язується з ються способами, що відомі у галузі. протеїнкіназою RAF. В іншому кращому втіленні винахід стосується Термін "специфічно зв'язує", що використовуспособу визначення сполук, що модулюють функється в цьому винаході, стосується антитіла, що цію серинової/треонінової протеїнкінази, де вплизв'язується з протеїнкіназою з вищою афінністю, вом є зміна або відсутність зміни в проліферації ніж інша протеїнкіназа або клітинний білок. Антитіклітин. ло, що специфічно зв'язується з протеїнкіназою, Термін "проліферація клітин" стосується зв'язуватиме більшу концентрацію специфічної швидкості, за якої група клітин ділиться. Кількість протеїнкінази, ніж будь-яка інша протеїнкіназа або клітин, що зростають у посудині, може підрахува ти клітинний білок. фа хівець шляхом звичайного візуального підрахуТермін "адсорбування", що використовується в нку кількості клітин у відомому об'ємі, використоцьому винаході, стосується зв'язування молекули вуючи звичайний світловий мікроскоп. Як альтерз поверхнеюантитіла або твердої основи. До принатива, швидкість проліферації клітин можна кладів твердих основ належать хімічно модифікопідрахувати за допомогою лабораторного привані целюлоза, наприклад, фосфоцелюлоза, та строю, що оптично або за рахунок світлопровіднонейлон. Антитіла можуть бути зв'язані з твердими сті вимірює щільність клітин у певному основами, використовуючи способи, добре відомі середовищі. звичайним фахівцям у цій галузі. Див., наприклад, В іншому кращому втіленні винахід стосується Harlo & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, способу визначення сполук, що модулюють функ1989, Cold Spring Harbor Laboratories. цію серинової/треонінової протеїнкінази, де вплиТермін "вимірювання концентрації фосфату", вом є зміна або відсутність змін у взаємодії між що використовується в цьому винаході, стосується сериновою/треоніновою протеїнкінази та природспособів, що зазвичай відомі звичайним фахівцям ним партнером, що зв'язується з протеїнкіназою. у цій галузі. До цих способів можуть належати підТермін "взаємодія" в контексті винаходу опирахування концентрації фосфорилованого субсує комплекс, що утворюється між внутрішньоклістрату або визначення відносної кількості фосфотинною частиною протеїнкінази та природним паррилованого субстрату. Ці способи можуть тнером, що зв'язується з протеїнкіназою, або включати адсорбцію субстрату до мембрани й сполукою. Термін "взаємодія" може також стосувавизначення кількості фосфорилованого субстрату тися комплексу, що утворюється між сполукою з використанням радіоактивних ізотопів. винаходу з внутрішньоклітинними частинами й В іншому кращому втіленні винахід стосується зовнішньоклітинними частинами протеїнкінази, що способу визначення сполук, які модулюють функдосліджується. Хоча цитозольна протеїнкіназа не цію серинових/треонінових протеїнкіназ, що скламає зовнішньоклітинної частини, рецепторна продається з наступних етапів: (а) лізису клітин для теїнкіназа має зовнішньоклітинну й внутрішньокліодержання лізату, що містить RAF; (б) адсорбутинну частин у. вання RAF до антитіла; (в) інкубування адсорбоТермін "внутрішньоклітинна частина", що виваної RAF з МЕК і МАРК; і (г) адсорбування МЕК і користовується в цьому винаході, стосується часМАРК до твердої основи або антитіла чи антитіл. тини протеїнкінази, яка існує всередині клітини. Етап визначення впливу на клітини складається з Термін "зовнішньоклітинна частина", що викорисвизначення концентрації фосфа ту ви щезгаданих товується в цьому винаході, стосується частини МЕК і МАРК. 19 71555 20 У кращому втіленні винахід стосується спосоТермін "проліки" стосується агента, що перебу визначення сполук, що модулюють функцію творюється на вихідні ліки in vivo. Проліки можна серинової/треонінової протеїнкінази, де сполука легше вводити, ніж вихідні ліки в деяких ситуаціях. похідна 5-азахіноксаліну має структур у, наведену у Наприклад, проліки можуть бути біодоступними формулі І, як описано в цьому винаході, або будьпри оральному введенні, у той час як вихідні - не яку з її підгруп, наведених у цьому винаході. можуть, або проліки можуть покращувати розчинТермін "сполука" стосується сполуки або її ність, що робить їх придатними для внутрішньофармацевтично прийнятної солі, естеру, аміду, венного введення. проліків, ізомеру або метаболіту. В іншому кращому втіленні винахід стосується Термін "фармацевтично прийнятна сіль" стоспособу визначення сполук, що модулюють функсується композиції сполуки, що не змінює біологічцію серинової/треонінової протеїнкінази, де сполуну активність і властивості сполуки. Фармацевтичка є похідною 5-азахіноксаліну й має структур у, ні солі можуть бути одержані за допомогою реакції наведену у формулі І, де сполука, що є похідною сполуки винаходу з неорганічними або органічни5-азахіноксаліну, вибрана з групи, що складається ми кислотами, такими як соляна кислота, бромвозі сполук SAQAR. днева кислота, сірчана кислота, азотна кислота, Термін "сполуки SAQAR" стосується групи фосфорна кислота, метансульфонова кислота, сполук похідних 5-азахіноксаліну, що мають струкетансульфонова кислота, п-толуолсульфонова туру, наведену у формулі І, і номери А-1 - А-90 в кислота, саліцилова кислота й подібні. наступній таблиці: Сполука № А-1 А-2 А-3 А-4 А-5 А-6 А-7 А-8 А-9 А-10 А-11 А-12 А-13 А-14 A-15 A-16 A-17 A-18 A-19 A-20 A-21 A-22 A-23 A-24 A-25 A-26 A-27 A-28 A-29 A-30 A-31 A-32 A-33 A-34 A-35 R2 Η Η Метил Феніл Метил Феніл Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η R1 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл феніл феніл феніл феніл феніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл R6X1 Феніламіно Бензиламіно Метокси Метокси 4-фторбензиламіно 4-фторбензиламіно Феніламіно 2-карбоксибензиламіно 3-карбоксибензиламіно 4-карбоксибензиламіно 2-нітробензиламіно 3-нітробензиламіно 4-нітробензиламіно 2-метилбензиламіно 3-метилбензиламіно 4-метилбензиламіно 2-хлорбензиламіно 3-хлорбензиламіно 4-хлорбензиламіно 2-фторбензиламіно 3-фторбензиламіно 4-фторбензиламіно 2-(трифторметил)бензиламіно 3-(трифторметил)бензиламіно 4-(трифторметил)бензиламіно фенетил-1-аміно 2-карбоксифеніламіно 3-карбоксифеніламіно 4-карбоксифеніламіно 2-нітрофеніламіно 3-нітрофеніламіно 4-нітрофеніламіно 2-метилфеніламіно 3-метилфеніламіно 4-метилфеніламіно 21 A-36 A-37 A-38 A-39 A-40 A-41 A-42 A-43 A-44 A-45 A-46 A-47 A-48 A-49 A-50 A-51 A-52 A-53 A-54 A-55 A-56 A-57 A-58 A-59 A-60 A-61 A-62 A-63 A-64 A-65 A-66 A-67 A-68 A-69 A-70 A-71 A-72 A-73 A-74 A-75 А-76 A-77 A-78 A-79 A-80 A-81 A-82 A-83 A-84 A-85 A-86 A-87 A-88 A-89 A-90 Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η Η 71555 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл 4-гідроксифеніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл феніл 4-метоксифеніл II. Способи запобігання або лікування хвороб В іншому аспекті винахід стосується способу запобігання або лікування хвороби в організмі. Спосіб складається з наступних етапів: (а) уведення сполуки винаходу, що описується в цьому винаході формулою І, з будь-яким носієм в орга 22 2-хлорфеніламіно 3-хлорфеніламіно 4-хлорфеніламіно 2-фторфеніламіно 3-фторфеніламіно 4-фторфеніламіно 2-(трифторметил)феніламіно З-(трифторметил)феніламіно 4-(трифторметил)феніламіно пірид-2-аміно пірид-3-аміно пірид-4-аміно пірид-2-метиламіно 2-карбоксибензиламіно 3-карбоксибензиламіно 4-карбоксибензиламіно 2-нітробензиламіно 3-нітробензиламіно 4-нітробензиламіно 2-метилбензиламіно 3-метилбензиламіно 4-метилбензиламіно 2-хлорбензиламіно 3-хлорбензиламіно 4-хлорбензиламіно 2-фторбензиламіно 3-фторбензиламіно 4-фторбензиламіно 2-(трифторметил)бензиламіно 3-(трифторметил)бензиламіно 4-(трифторметил)бензиламіно фенетил-1-аміно 2-карбоксифеніламіно 3-карбоксифеніламіно 4-карбоксифеніламіно 2-нітрофеніламіно 3-нітрофеніламіно 4-нітрофеніламіно 2-метилфеніламіно 3-метилфеніламіно 4-метилфеніламіно 2-хлорфеніламіно 3-хлорфеніламіно 4-хлорфеніламіно 2-фторфеніламіно 3-фторфеніламіно 4-фторфеніламіно 2-(трифторметил)феніламіно 3-(трифторметил)феніламіно 4-(трифторметил)феніламіно пірид-2-аміно пірид-3-аміно пірид-4-аміно пірид-2-метиламіно Феніламіно нізмі; і (б) стимулювання або переривання ненормальної взаємодії. Термін «організм» стосується будь-якої живої істоти, що складається з принаймні однієї клітини. Організм можуть бути таким простим, як одна еукаріотична клітина, або таким складним, як 23 71555 24 організм ссавців. У кращих втіленнях організм включаючи (крім іншого) оральне, парентеральстосується людини або ссавців. не, нашкірне, ін'єкційне й аерозольне застосуТермін «попередження» стосується способу вання. Для клітин, що знаходяться зовні організвинаходу, що зменшує вірогідність або позбавляє му існують чисельні способи введення сполуки, можливості того, що організм набуває або ствовключаючи (крім іншого) методи мікроін'єкції в рює умови для розвитку хвороби. клітини, способи трансформації та способи, що Термін «лікування» стосується способу винавикористовують носії. ходу, що чинить терапевтичний вплив і принаймні У кращому втіленні винахід стосується спочастково полегшує або позбавляє організм від собу попередження або лікування хвороби в орхвороби. ганізмі, де сполука - похідна 5-азахіноксаліну має Термін «терапевтичний вплив» стосується інструктур у, наведену у формулі І, як описано в гібування росту клітин, що викликають або робцьому винаході, або будь-яка з її підгруп, наведелять внесок в хворобу (наприклад рак), термін на в цьому винаході. «терапевтичний вплив» також стосується інгібуВ інших кращих втіленнях винахід стосується вання факторів росту, що викликають або робспособу попередження або лікування хвороби в лять внесок в розвиток хвороби. Терапевтичний організмі, де сполука - похідна 5-азахіноксаліну, вплив полегшує деякою мірою один або кілька з що має структур у, наведену у формулі І, вибрана симптомів хвороби. Стосовно лікування раку тез групи, що складається зі сполук SAQAR. рапевтичний вплив стосується одного або кілька В іншому кращому втіленні винахід стосуєтьз наступних етапів: (а) зменшення розміру пухлися способу попередження або лікування хвороби ни; (б) інгібування (тобто уповільнення або зупив організмі, де організмом є організм ссавця. нення) метастазування пухлини; (в) інгібування Краще, якщо термін "ссавець" стосується таросту п ухлини; і (г) полегшення деякою мірою ких організмів як миші, щури, кролі, морські свинодного або кількох симптомів, пов'язаних з хвоки та козли, ще краще, якщо мавп і людиноподібробою. Сполуки, що можуть бути визначені, як них мавп, і найкраще, якщо людини. описано в цьому винаході, виявили ефективність У ще іншому кращому втіленні винахід стосупроти лейкемій, за винятком того, що поряд з ється способу запобігання або лікування хвороби інгібуванням метастазів сполуки можуть уповільв організмі, де хворобою є рак або фіброз. нювати або зменшувати проліферацію клітин або В іншому кращому втіленні винахід стосуєтьріст клітин. ся способу запобігання або лікування хвороби в Термін "хвороба" стосується функцій клітин організмі, де рак вибраний з групи, що складаєтьабо тканин організму, що відрізняються від їх ся з раку легень, раку яєчників, раку грудей, раку нормальних функцій в організмі. Хвороба може мозку, міжвісьового раку мозку, раку товстої кишстосуватися проліферації клітин, диференціації ки, раку простати, саркоми, саркоми Капоші, меклітин або виживаності клітин. ланоми та гліоми. Ненормальна проліферація клітин стосується У ще одному кращому втілені винахід стосураку, такого як фібрози й мезангіальні розлади, ється способу запобігання або лікування хвороби ненормальний ангіогенез і васкулогенез, загоєнв організмі, де спосіб стосується хвороби, пов'яня ран, псоріаз, цукровий діабет та запалення. заної з порушенням шляху передачі сигналу, що Ненормальна диференціація стосується, крім характеризується взаємодією між сериноіншого, нейродегенеративних розладів, повільновою/треоніновою протеїнкіназою і природним го загоєння ран, а також способів трансплантації партнером, який зв'язується з протеїнкіназою. тканин. Термін "шлях передачі сигналу" стосується Ненормальна виживаність клітин стосується розповсюдження сигналу. Взагалі, зовнішньоклістанів, в яких шляхи запрограмованої смерті клітинний сигнал передається через клітинну мемтин (апоптоз), активовані або інгібовані. Кілька брану з утворенням внутрішньоклітинного сигнапротеїнкіназ пов'язані зі шляхами апоптозу. Відлу. Цей сигнал може потім стимулювати клітинну хилення у функції будь-якої однієї протеїнкінази відповідь. Термін також стосується сигналів, що може призвести до безсмертя клітин або передрозповсюджуються цілком всередині клітини. часної смерті клітин. Молекули поліпептидів, що беруть участь в проПроліферація клітин, диференціація й вижицесах передачі сигналу, є типово рецепторними й ваність є феноменом, що просто вимірюється нерецепторними протеїнкіназами, рецепторними способами у галузі. До цих способів можуть най нерецепторними фосфатазами білків, фактолежати підрахунок кількості клітин або зовнішній рами обміну нуклеотидів і факторами вигляд клітин під мікроскопом у часі (наприклад, у транскрипції. днях). Термін "відхилення", у зв'язку з процесом пеТермін "введення" стосується головним чиредачу сигналу, стосується протеїнкінази, що ном надходження до організму, а саме способу надмірно або недостатньо експресується в оргавключення сполук в клітини або тканини організнізмі, піддана мутації таким чином, що її каталітиму. Хвороби можна попереджати або лікувати, чна активність є нижчою або вищою, ніж активякщо клітини або тканини організму існують всеність протеїнкінази дикого типу, або піддана редині організму або зовні організму. Клітини, що мутації таким чином, що вона більше не може існують зовні організму, можуть утримуватись взаємодіяти з природним партнером, що зв'язуабо вирощуватись в посудинах для культур кліється з протеїнкіназою, більше не модифікується тин. Для клітин, що знаходяться всередині оргаіншою протеїнкіназою або фосфатазою білка, або нізму, існує багато способів введення сполук, більше не взаємодіє з природним партнером, що 25 71555 26 зв'язується з протеїнкіназою. галогену, тригалометилу, карбоксилату, нітрогруТермін "стимулюючи або перериваючи ненопи або естеру; рмальну взаємодію" стосується способу, що мо(іх) -SO2N X11 X12, де Х11 і Х12 вибрані з групи, же бути здійснений уведенням сполуки винаходу що складається з водню, алкілу й п'ятичленних в клітини або тканини в організмі. Сполука може чи шестичленних арильних або гетероарильних стимулювати взаємодію між протеїнкіназою й кільцевих складових; природним партнером, що зв'язується з нею за (х) п'ятичленної або шестичленної арильної рахунок утворення сприятливих взаємодій з чиабо гетероарильної кільцевої складової, за басельними атомами на поверхні місця утворення жанням заміщеної на один, два або три замісникомплексу. Як альтернатива, сполука може інгіки, незалежно вибрані з групи, що складається зі бувати взаємодію між протеїнкіназою й природскладових алкілу, галогену, тригалометилу, карним партнерами, що зв'язуються з нею, за рахубоксилату, нітрогр упи та естеру; нок створення сприятливих взаємодій, що (хі) альдегіду формули -CO-Η; і утворюються між атомами на поверхні місця (хіі) сульфон у формули -SO2-X13, де Х13 вибутворення комплексу. В іншому кращому втіленні рано з групи, що складається з насиченого або винахід стосується способу запобігання або лікуненасиченого алкілу й п'ятичленних чи шестивання хвороби в організмі, де сериночленних арильних або гетероарильних складовою/треоніновою протеїнкіназою є RAF. вих; і III. Сполуки та Фармацевтичні композиції ви(б) Х1 вибраний з групи, що складається з находу азоту, сірки та кисню. В іншому аспекті винахід стосується 5Термін "насичений алкіл" стосується алкільазахіноксалінових сполук, що мають структури, ної складової, що не містить будь-якої алкенової наведені у формулі І: або алкінової складової. Алкільна складова може бути розгалужена або нерозгалужена. Термін "ненасичений алкіл" стосується алкільної складової, що містить принаймні одну алкенову або алкінову складову. Алкільна складова може бути розгалужена або нерозгалужена. Термін "амін" стосується хімічної складової де формули NR1R2, де R1 і R2 незалежно вибрані з (а) R1, R2 і R6 незалежно вибрані з групи, що групи, що складається з водню, насиченого або складається з ненасиченого алкілу й п'ятичленних чи шести(і) водню; членних арильних або гетероарильних складо(іі) насиченого або ненасиченого алкілу; вих, де кільце за бажанням заміщено на один або (ііі) аміну формули NХ2 Х3, де Х2 і Х3 незалежкілька замісників, незалежно вибраних з групи, но вибрані з групи, що складається з водню, нащо складається зі складових алкілу, галогену, сиченого або ненасиченого алкілу й п'ятичленних тригалометилу, карбоксилату, нітрогрупи та есчи шестичленних арильних або гетероарильних теру. кільцевих складових; Термін "арил" стосується ароматичної групи, (iv) галогену або тригалометилу; яка має принаймні одне кільце, що має сполучену (ν) кетону формули -СО-Х4, де Х4 вибрано з р-електронну систему й містить карбоциклічнии групи, що складається з водню, алкілу й п'ятиарил (наприклад, феніл) і гетероциклічний арил членних чи шестичленних арильних або гетеро(наприклад, піридин). Термін "карбоциклічний" арильних складових; стосується сполуки, що містить одну або кілька (vi) карбонової кислоти формули -(X5)n-COOH ковалентно замкнутих кільцевих структур так, що або естеру формули -(Х6)-СОО-Х7, де Х5, Х6 і Х7 всі атоми, які утворюють структур у кільця, є атонезалежно вибрані з групи, що складається з алмами вуглецю. Термін, таким чином, відокремлює кілу й п'я тичленних чи шестичленних арильних карбоциклічні кільця від гетероциклічних кілець, в або гетероарильних складових, і де n - це 0 яких кільцева структура містить принаймні один або 1; атом, що відрізняється від вуглецю. Термін "гете(vii) спирту формули (Х8)n-ОН або алкокси роарил" стосується арильної групи, яка містить складової формули -(X8)n-O-X9, де Х8 і X9 незалепринаймні одне гетероциклічне кільце. жно вибрані з групи, що складається з водню, Термін "галоген" стосується атома, вибраного насиченого або ненасиченого алкілу й п'ятичленз групи, що складається зі фтору, хлору, брому та них чи шестичленних арильних або гетероарильйоду. них складових, де кільце за бажанням заміщено Термін "кетон" стосується хімічної складової на один або кілька замісників, незалежно вибраформули -(R)n-CO-R', де R і R’ вибрані з групи, них з групи, що складається з алкілу, галогену, що складається з насиченого або ненасиченого тригалометилу, карбоксилату, нітрогрупи та есалкілу і п'ятичленних чи шестичленних арильних теру, і де n - це 0 або 1; або гетероарильних складових, і де n - 0 або 1. (viii) аміду формули -NHCOX10 , де Х10 вибраТермін "карбонова кислота" стосується хімічна з групи, що складається з алкілу, гідроксилу й ної складової формули -(R)n-СООН, де R вибрана п'ятичленних чи шестичленних арильних або гез групи, що складається з насиченого або ненатероарильних складових, де кільце за бажанням сиченого алкілу й п'ятичленних чи шестичленних заміщено на один або кілька замісників, незалежарильних або гетероарильних складових, і де n но вибраних з групи, що складається з алкілу, 0 або 1. 27 71555 28 Термін "естер" стосується хімічної складової У ще одному кращому втіленні винахід стосуформули -(R)n-COOR', де R і R' незалежно вибється сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має рані з групи, що складається з насиченого або структур у, наведену у формулі І, де R1 - це 4ненасиченого алкілу й п'ятичленних чи шестигідроксифеніл. членних арильних або гетероарильних складоВ інших кращих втіленнях винахід стосується вих, і де n - 0 або 1. сполуки похідної 5-азахіноксаліну, що має струкТермін "спирт" стосується хімічного замісника туру, наведену у формулі І, де R2 вибрано з груформули -ROH, де R вибрана з групи, що склапи, що складається з водню, насиченого або недається з водню, насиченого або ненасиченого насиченого алкілу й фенілу, за бажанням алкілу й п'ятичленних чи шестичленних арильних заміщеного на один, два або три замісники, незаабо гетероарильних складових, де кільце за балежно вибрані з групи, що складається з алкілу, жанням заміщено на один або кілька замісників, галогену, гідрокси й алкокси складових. незалежно вибраних з групи, що складається зі В іншому кращому втіленні винахід стосуєтьскладових алкілу, галогену, тригалометилу, карся сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має боксилату, нітрогр упи та естеру. структур у, наведену у формулі І, де R2 - це воТермін "амід" стосується хімічного замісника день. формули -NHCOR, де R вибрана з групи, що У ще одному кращому втіленні винахід стосускладається з водню, алкілу, гідроксилу й п'ятиється сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має членних чи шестичленних арильних або гетероструктур у, наведену у формулі І, де R2 - це арильних складових, де кільце за бажанням заметил. міщено на один або кілька замісників, незалежно У ще одному кращому втіленні винахід стосувибраних з групи, що складається з алкілу, галоється сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має гену, тригалометилу, карбоксилату, нітрогрупи структур у, наведену у формулі І, де R2 - це феніл. або естеру. В іншому кращому втіленні винахід стосуєтьТермін "складова алкокси" стосується хімічся сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має ного замісника формули -OR, де R - це водень чи структур у, наведену у формулі І, де Х1 - це атом насичена або ненасичена алкільна складова. азоту або кисню. Термін "альдегід" стосується хімічної складоУ ще одному кращому втіленні винахід стосувої формули -(R)n-CHO, де R вибрана з групи, що ється сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має складається з насиченого або ненасиченого алкіструктур у, наведену у формулі І, де Х1 - це лу й п'ятичленних чи шестичленних арильних або кисень. гетероарильних складових, і де n - 0 або 1. У ще одному кращому втіленні винахід стосуТермін "сульфон" стосується хімічної складоється сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має вої формули -SO2-R, де R вибрана з групи, що структур у, наведену у формулі І, де Х1 - це атом складається з насиченого або ненасиченого алкіазоту. лу й п'ятичленних чи шестичленних арильних або В інших кращих втіленнях винахід стосується гетероарильних складових. сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має стр уВ іншому кращому втіленні винахід стосуєтьктуру, наведену у формулі І, де R4 вибрано з груся сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має пи, що складається з водню, насиченого або неструктур у, наведену у формулі І, де R3 і R4 незанасиченого алкілу, за бажанням заміщеного на лежно вибрані з групи, що складається з водню й п'ятичленну чи шестичленну арильну або гетеронасиченого або ненасиченого алкілу. арильну кільцеву складову, за бажанням заміщеУ ще одному кращому втіленні винахід стосуну на один, два або три замісники, незалежно ється сполуки похідної 5-азахіноксаліну, що має вибрані з групи, що складається зі складових алструктур у, наведену у формулі І, де R3 і R4 є атокілу, галогену, тригалометилу, гідрокси, алкокси, мами водню. карбоксилату, нітрогрупи й естеру; і п'ятичленної В інших кращих втіленнях винахід стосується чи шестичленної арильної або гетероарильної сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має стр укільцевої складової, за бажанням заміщеної на ктуру, наведену у формулі І, де R1 і R2 вибрані з один, два або три замісники, незалежно вибрані з групи, що складається з водню, насиченого або групи, що складається зі складових алкілу, галоненасиченого алкілу, п'ятичленного чи шестигену, тригалометилу, гідрокси, алкокси, карбоксичленного арилу або гетероарильної кільцевої лату, нітрогрупи та естер у. складової, за бажанням заміщеної на один, два У інших кращих втіленнях винахід стосується або три замісники, незалежно вибрані з групи, що сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має стр ускладається зі складових алкілу, галогену, тригактуру, наведену у формулі І, де R6 і Х1 складові, лометилу, гідрокси, алкокси, карбоксилату, нітровзяті разом, утворюють сполуку, яка вибрана з групи та естер у. групи, що складається із замісників SAQAR. У інших кращих втіленнях винахід стосується Термін "замісники SAQAR" стосується групи сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має стр узамісників, що складається з метокси, бензиламіктуру, наведену у формулі І, де R1 - це феніл, за но, 4-фторбензиламіно, 2-карбоксибензиламіно, бажанням заміщений на один, два або три заміс3-карбоксибензиламіно, 4-карбоксибензиламіно, ники, незалежно вибрані з групи, що складається 2-нітробензиламіно, 3-нітробензиламіно, 4з алкілу, галогену, гідрокси й алкокси складових. нітробензиламіно, 2-метилбензиламіно, 3-метилВ іншому кращому втіленні винахід стосуєтьбензиламіно, 4-метилбензиламіно, 2ся сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має хлорбензиламіно, 3-хлорбензиламіно, 4структур у, наведену у формулі І, де R1 - це феніл. хлорбензиламіно, 2-фторбензиламіно, 3 29 71555 30 фторбензиламіно, 4-фторбензиламіно, 2розольне, парентеральне та місцеве введення. (трифторметил)бензиламіно, 3Фармацевтичні композиції можуть також бути (трифторметил)бензиламіно, 4одержані за допомогою реакції сполук з неоргані(трифторметил)бензиламіно, фенетил-1-аміно, чними кислотами, такими як соляна кислота, феніламіно, 2-карбоксифеніламіно, 3бромводнева кислота, сірчана кислота, азотна карбоксифеніламіно, 4-карбоксифеніламіно, 2кислота, фосфорна кислота, метансульфонова нітрофеніламіно, 3-нітрофеніламіно, 4кислота, етансульфонова кислота, пнітрофеніламіно, 2-метилфеніламіно, 3толуолсульфонова кислота, саліцилова кислота метилфеніламіно, 4-метилфеніламіно, 2й подібні. хлорфеніламіно, 3-хлорфеніламіно, 4Термін "фізіологічно прийнятний" стосується хлорфеніламіно, 2-фторфеніламіно, 3носія або розчинника, що не перешкоджає біолофтор феніламіно, 4-фторфеніламіно, 2гічній активності й властивостям сполуки. (трифторметил)фен(ламіно, 3Термін "носій" стосується хімічної сполуки, (трифторметил)феніламіно, 4що сприяє включенню сполуки в клітини або тка(трифторметил)феніламіно, пірид-2-аміно, піриднини. Наприклад, диметилсульфоксид (DMSO) є 3-аміно, пірид-4-аміно та пірид-2-метиламіно. носієм, що зазвичай використовується, оскільки Термін "бензиламіно" стосується групи, що він сприяє поглинанню багатьох органічних спомає структур у, наведену в наступній формулі: лук в клітини або тканини організму. Термін "розчинник" стосується хімічної сполуки, розведеної у воді, що розчиняє потрібну сполуку, а також стабілізує біологічно активні сполуки. Солі, розчинені у буферних розчинах, де арильне кільце може бути за бажанням використовуються у галузі як розчинники. Одним заміщене у 2, 3 або 4 положенні. зазвичай використовуваним буферним розчином Термін "феніламіно" стосується групи, що є фосфатний буферний розчин, тому що він намає структур у, наведену в наступній формулі: гадує сольовий стан крові людини. Оскільки буферні солі можуть контролювати рН розчину за низьких концентрацій, забуферений розчинник рідко модифікує біологічну активність сполуки. У ще іншому аспекті винахід стосується споде арильне кільце може бути за бажанням собу синтезування сполук винаходу, що складазаміщене в 2, 3 або 4 положенні. ється з етапів: (а) реакції 2-аміно-6-хлор-3Термін «фенетил-1-аміно» стосується групи, нітропіридину з другою реагуючою речовиною в що має структур у, наведену в наступній формулі: розчиннику й у присутності основи, де друга реагуюча речовина вибрана з групи, що складається зі спирту та аміну, з утворенням першого інтермедіату; (б) реакції першого інтермедіату з 1,2діоном у присутності каталізатора і відновлюючоТермін «пірид-2-аміно» стосується піридиного агента; і (г) очи щення кінцевого продукту. вого кільця, яке заміщене на NH-групу в 2 полоТермін "1,2-діон" стосується хімічної складоженні. Таким самим чином, терміни "пірид-3вої формули R1-C(O)C(O)-R2 де R1 і R2 незалежно аміно" і "пірид-4-аміно" стосуються піридинового вибрані з групи, що складається з водню; насикільця, яке заміщене на NH-групу у 3 і 4 положенченого або ненасиченого алкілу, за бажанням нях, відповідно. заміщеного на п'ятичленну чи шестичленну ариУ ще іншому кращому втіленні винахід стосульну або гетероарильну кільцеву складову, за ється сполуки - похідної 5-азахіноксаліну, що має бажанням заміщену на один, два або три замісструктур у, наведену у формулі І, де сполука ники, вибрані незалежно з групи, що складається похідна 5-азахіноксаліну вибрана з групи, що зі складових алкілу, галогену, тригалометилу, складається зі сполук SAQAR. гідрокси, алкокси, карбоксилату, нітрогрупи та IV. Способи синтезу винаходу естеру; і п'ятичленної чи шестичленної арильної В іншому аспекті винахід стосується фармаабо гетероарильної кільцевої складової, за бацевтичної композиції, що складається зі сполук, жанням заміщеної на один, два або три замісниякі мають структур у формули І, як описано в цьоки, вибрані незалежно з групи, що складається зі му винаході, або будь-якої з її підгруп, наведених складових алкілу, галогену, тригалометилу, гідров цьому винаході, або її солі та фізіологічно прикси, алкокси, карбоксилату, нітрогрупи та естер у. йнятного носія або розчинника. У кращому втіленні винахід стосується споУ кращому втіленні винахід стосується фарсобу синтезу сполук винаходу де розчинником є мацевтичної композиції, де сполука - похідна 5н-бутанол. азахіноксаліну вибрана з групи, що складається зі В іншому кращому втіленні винахід стосуєтьсполук SAQAR. ся способу синтезу сполук винаходу, де основою Термін "фармацевтична композиція" стосує карбонат калію у ви гляді порошку. ється суміші сполуки 5-азахіноксаліну даного виУ ще одному кращому втіленні винахід стосунаходу з іншими хімічними компонентами, такими ється способу синтезу сполуки винаходу, де др уяк розчинники або носії. Фармацевтична компога реагуюча речовина вибрана з групи, що склазиція полегшує введення сполуки в організм. У дається з реагентів SAQAR. галузі існують чисельні способи введення сполук, Термін "реагенти SAQAR" стосується групи включаючи, крім іншого, оральне, ін'єкційне, ае 31 71555 32 реагентів, що складається з метанолу, бензилаактивованій передачі сигналу. міну, 4-фторбензил аміну, 2Завдяки важливий регуляторній ролі RAF в карбоксибензиламіну, 3-карбоксибензиламіну, 4клітинах модифікації послідовності амінокислот карбоксибензиламіну, 2-нітробензиламіну, 3RAF можуть змінити її функцію і, таким чином, нітробензиламіну, 4-нітробензиламіну, 2модифікувати життєдіяльність клітини. Роль RAF метилбензиламіну, 3-метилбензиламіну, 4у проліферації клітини є значною, виходячи зі метилбензиламіну, 2-хлорбензиламіну, 3спостереження, що мутації послідовності амінохлорбензиламіну, 4-хлорбензиламіну, 2кислот RAF пов'язані з пухлинами та раками. фторбензиламіну, 3-фторбензиламіну, 4Оскільки мутації RAF, що призводять до утворенфторбензиламіну, 2-(трифторметил)бензиламіну, ня раку в клітинах, виявляються такими, що їм 3-(трифторметил) бензиламіну, 4властива нездатна до регулювання каталітична (трифторметил)бензиламіну, фенетил-1-аміну, активність, то інгібітори RAF можуть послаблювааніліну, 2-карбоксианіліну, 3-карбоксианіліну, 4ти або навіть перешкоджати проліферації клітикарбоксианіліну, 2-нітроаніліну, 3-нітроаніліну, 4ни, що призводить до раку в цій клітині. нітроаніліну, 2-толуїдину, 3-толуїдину, 4Способи цього винаходу можуть виявити спотолуїдину, 2-хлораніліну, 3-хлораніліну, 4луки, що модулюють функцію протеїнкінази RAF хлораніліну, 2-фтораніліну, 3-фтораніліну, 4в клітинах. RAF фосфорилує протеїнкіназу (МЕК), фтораніліну, 2-(трифторметил)аніліну, 3яка у свою чергу фосфорилує мітоген-активовану (трифторметил)аніліну, 4-(трифторметил)аніліну, протеїнкіназу (МАРК). Тести, що визначають ли2-амінопіридину, 3-амінопіридину, 4ше фосфорилування МЕК за допомогою RAF, не амінопіридину та 2-метиламінопіридину. є чутливими, тому що рівень фосфорилування У ще одному кращому втіленні винахід стосуМЕК є значним. Для подолання цієї проблеми ється способу синтезу сполуки винаходу, де тречутливості використовують фосфорилування тя реагуюча речовина вибрана з групи, що склаМЕК і МАРК у тестах цього винаходу. Сигнал фодається з 4-гідроксифенілгліоксалю, 1-феніл-1,2сфорилування МАРК підсилює сигнал фосфорипропандіону та бензилу. лування МЕК і приводить до RAF-залежного фоТермін "каталізатор", що використовується в сфорилування у ферментному імуносорбентному цьому винаході, стосується хімічної молекули, що аналізі. Крім того, краще, якщо тест винаходу при додаванні до групи реагентів може підвищувиконується так, що багато сполук можуть бути вати швидкість, за якої реагенти реагують з утвошвидко виявлені за короткий проміжок часу. ренням продуктів. Багато типів каталізаторів є Способи цього винаходу визначають сполуки, добре відомими звичайним фахівцям у цій галузі. що інгібують функцію протеїнкінази RAF. Ці споУ кращому втіленні винахід стосується сполуки є похідними 5-азахіноксаліну. Хоча по хідні 5собів синтезування сполук винаходу, де відновазахіноксаліну були перевірені на їх здатність люючий агент - це водень. інгібувати ферменти, що приймають участь у сиВ іншому кращому втіленні винахід стосуєтьнтезі нуклеотидів у бактерій, багато з цих сполук ся способів синтезування сполук винаходу, де не були досліджені стосовно інгібування протеїнкаталізатором є нікелевий каталізатор Ренея. кінази. Короткий опис винаходу, наведений вище, не Оскільки RAF виявляє значну амінокислотну є обмежуючим, й інші риси та переваги винаходу гомологію з іншими сериновими/треоніновими стануть очевидними з наступного опису кращих протеїнкіназами, 5-азахіноксалінові сполуки вивтілень і формули винаходу. находу можуть імовірно інгібувати сериноЦей винахід частково спрямований на спосові/треонінові протеїнкінази, інші, ніж RAF. Таким би модулювання функції серинових/треонінових чином, способи винаходу також стосуються серипротеїнкіназ сполуками похідними 5нових/треонінових протеїнкіназ інших, ніж RAF, азахіноксаліну. Крім того, винахід частково стосувключаючи рецепторні й нерецепторні сериноється способів ідентифікації сполук, що модулюві/треонінові протеїнкінази. ють функцію серинових/треонінових протеїнкіназ. Способи винаходу також стосуються інших До способів належать клітини, що експресують сполук, що модулюють функцію RAF в клітинах, серинову/треонінову протеїнкіназу, таку як RAF. оскільки властивості способу дозволяють визнаRAF - це нерецепторна протеїнкіназа, що чати багато молекул за короткий проміжок часу. зв'язана з клітинною мембраною, коли вона зв'яТаким чином, способи винаходу можуть ідентифізується з активованою RAS, гуанінтрифосфатгідкувати існуючі молекули, не описані у цьому виролізуючим ферментом. RAS активується, коли наході, що модулюють функцію RAF. активована рецепторна тирозинова протеїнкінаІ. Біологічна активність сполук похідних 5за, така як EGFR або PDGFR, зв'язується з адапазахіноксалину торним білком - GRB2, і фактор обміну гуанінових Сполуки - похідні 5-азахіноксаліну цього винуклеотидів - SOS. SOS видаляє гуаніндифосфат находу перевіряли на їх здатність інгібувати фунз RAS, заміщує його на гуанінтрифосфат, і, таким кцію протеїнкінази RAF. У цьому винаході предчином, активує RAS. RAS потім зв'язує RAF і таставлено біологічні тести й результати цих ким чином активує R AF. RAF може потім фосфодосліджень щодо інгібування. Способи, що викорилувати інші білкові мішені по залишкам серину ристовуються для модулювання функції протеїнта треоніну, таких як кіназа (МЕК), що фосфорикіназ сполуками - похідними 5-азахіноксаліну, лує і таким чином активує мітоген-активовану подібні до тих, що описані у заявці США протеїнкіназу (МАРК). Таким чином, RAF існує як №08/702232, на ім'я Tang et al., яка має назву: проміжний контролюючий фактор у мітоген"Комбінаторні бібліотеки індолінолу й відповідні 33 71555 34 продукти та способи лікування хвороби" (Lyon & судини проникають крізь суглоб і руйнують хрящ. Lyon Docket №221/187), зареєстрована 23 серпКрім того, до хвороб проліферації кровоносних ня, 1996 року, стосовно аспекту високої ефективсудин належать хвороби ока, такі як діабетична ності цього способу. Заявка 08/702232 включена ретинопатія, де нові капіляри в сітківці проникасюди шляхом посилання цілком, включаючи ють крізь склоподібний елемент, починають кробудь-які малюнки. воточити й викликати сліпоту. І навпаки, розлади, II. Хвороби, що лікуються сполуками похідщо стосуються звуження, скорочення або закриними 1,4.5-триазанафталіну вання кровоносних судин, такі як рестеноз, також Способи, сполуки та фармацевтичні компоберуть участь у шкідливому регулюванні протеїнзиції, описані в цьому винаході, розроблені для кіназ. інгібування проліферативних розладів клітини Крім того, васкулогенез і ангіогенез пов'язані модулюванням функції протеїнкінази RAF. Проз ростом злоякісних твердих п ухлин і метастаз. ліферативні розлади призводять до небажаної Енергійно зростаюча пухлина потребує багато проліферації клітин одного або кількох осередків поживних речовин і кисню для продовження росклітин у багатоклітинному організмі, що веде до ту. Як наслідок, ненормально велика кількість пошкодження організму. Способи, сполуки та капілярів кровоносних судин часто виростає рафармацевтичні композиції, описані в цьому виназом з пухлиною, і вони діють як постачальники ході, можуть також бути корисними для лікування вищезгаданих компонентів пухлини. Крім того, й попередження інших розладів в організмах, для постачання поживних речовин до пухлини таких як завчасна смерть клітин (тобто, хвороби нові кровоносні судини, що пронизують пухлину, нервової системи) або запалення. Ці хвороби забезпечують прохід клітинам пухлини до кровоможуть прогресувати завдяки молекулам RAF, обігу й метастазування у віддалених ділянках що функціонують неналежним чином, або завдяорганізму. Folkman, 1990, J. Natl. Cancer Inst ки протеїнкіназам RAF, що функціонують нена82:4-6. лежним чином. Ненормальна активність RAF може стимулюЗміни функції протеїнкінази RAF або протеїнвати розлади проліферації клітини. Виявилось, кіназ, пов'язаних з RAF, можуть привести до підщо молекули, які специфічно модулюють функцію вищеної або зменшеної здатності клітин до пропротеїнкінази RAF, здатні інгібувати проліфераліферації за певних хвороб. До змінених умов цію клітин. Зокрема, антизмістовні молекули нукпроліферації клітин належать раки, фібрози, мелеїнової кислоти, які були створені для зв'язузангіальні розлади, ненормальний ангіогенез і вання з мРНК, що кодує протеїнкіназу RAF і васкулогенез, загоєння ран, псоріаз, рестеноз і блокує трансляцію цієї мРНК, ефективно поперезапалення. джали трансформацію клітин А549 in vitro. Monia Фібрози - це ненормальне утворення зовнішet al., 1996, Nature Medicine 2: 688, включений ньоклітинного матриксу. Прикладом фіброзу є сюди цілком шляхом посилання з усіма малюнцироз печінки. Цироз печінки описується як підками та таблицями. Клітини А549 - це злоякісні вищена концентрація складників зовнішньокліклітини людини. тинного матриксу, що призводить до утворення Ці спрямовані на RAF дослідження з викорипечінкового рубця. станням антизмістовних молекул РНК довели, що Ненормальна проліферація клітин відбува5-азахіноксалінові молекули винаходу, які модується внаслідок ненормальної проліферації мелюють функцію протеїнкінази RAF, можуть зазангіальних клітин. До мезанпальних проліфератримувати й імовірно зупиняти проліферацію тивних розладів належать різні ниркові хвороби злоякісних клітин в організмі. Ці сполуки 5людини, такі як гломерулонефрити, діабетичні азахіноксаліну можуть бути перевірені способами нефропатії, злоякісний нефросклероз, синдроми in vitro, як наведено в цьому винаході за допомотромбічних ангіопатій, відторгнення трансплантагою прикладів. Крім того, сполуки 5ту та гломерулопатії. азахіноксаліну можуть бути перевірені на їх вплив До типів раку, що можна лікувати способами на клітини пухлин in vivo способами з використа сполуками винаходу, належать рак легень, рак танням ксенотрансплантата, як наведено в цьому яєчників, рак грудей, рак мозку, міжвісьовий рак винаході за допомогою прикладів. мозку, рак товстої кишки, рак простати, саркома Існують принаймні два шляхи, в яких ненорКапоші, меланома й гліома. Доказ того, що спомальна активність RAF може стимулювати небалуки та способи винаходу можуть ефективно бужану проліферацію клітин окремого типу клітин: ти використані для затримання й зупинення про(1) прямо стимулюючи ріст окремих клітин, або ліферації ракових клітин, наведений в цьому (2) підвищуючи васкуляризацію окремих ділянок, винаході шляхом посилання. таких як тканини пухлин, таким чином полегшуюАнгіогенні й васкулогенні розлади з'являютьчи ріст тканин. ся внаслідок надлишку проліферації кровоносних Використання цього винаходу полегшується судин. Проліферація кровоносних судин є необзавдяки ідентифікації того, чи є проліферація хідною в багатьох нормальних фізіологічних проклітин RAF-обумовленою. Як тільки це з'ясовано, цесах, таких як розвиток ембріону, утворення пацієнти, що страждають на такий розлад, можовтого тіла, загоєння ран і регенерація органів. жуть бути визначені аналізуванням їх симптомів, Проте, проліферація кровоносних судин є також використовуючи процедури, добре відомі лікарям необхідною для розвитку пухлини. До інших приабо ветеринарам зі звичайним досвідом у галузі. кладів розладів проліферації кровоносних судин Такі пацієнти можуть потім лікуватися, як описано належать артрит, де нові капілярні кровоносні в цьому винаході. 35 71555 36 Визначення того, чи є розлад проліферації інше не вказано: клітин RAF-обумовленим, може бути здійснено (і) випаровування виконували обертальним спочатку визначенням рівня активності RAF в випаровуванням у вакуумі; клітині або в окремих розташуваннях тіла пацієн(іі) операції виконували в атмосфері інертнота. Наприклад, у випадках раку рівень однієї або го газу, такого як азот; кількох активностей RAF може бути порівняний з (ііі) рідинну хроматографію високої розподінеобумовленими RAF-типами раку і RAFльної здатності (HPLC) виконували на Merck обумовленим типами раку. Якщо ракові клітини LiChrosorb RP-18 силікагелі зі зворотною фазою, мають вищий рівень активності RAF, ніж RAFпридбану у Е. Merck, Дармштадт, Німеччина; обумовлені типи раку, то краще, якщо такий са(iv) ви ходи наведені лише для ілюстрації і не мий або більший рівень, ніж RAF-обумовлені тиобов'язково є максимально досяжними; пи раку, тоді вони мають лікуватися, використо(ν) точки плавлення наведені без врахування вуючи описані способи модулювання RAF і поправки й визначались, використовуючи цифросполуки винаходу. вий апарат для визначення точки плавлення У випадках розладів проліферації клітин, що HWS Mainz SG 2000; виникли завдяки небажаній проліферації нерако(vi) стр уктури всі х сполук формули (І) цього вих клітин, рівень активності RAF порівнюють з винаходу підтверджували протонною магнітнорівнем, що зустрічається в загальній популяції резонансною спектроскопією на спектрофотоме(наприклад, середній рівень в загальній популяції трі Bruker AMX500-NMR, а також мікроаналізом людини або тварин, за винятком тих людей або елементів, і, в певних випадках, мастварин, що страждають на розлад проліферації спектроскопією; клітин). Якщо небажана проліферація клітин ха(vii) чистоту стр уктур перевіряли тонкошарорактеризується вищим рівнем RAF, ніж у загальвою хроматографією (TLC), використовуючи силіній популяції, тоді цей розлад потрібно лікувати, кагель (Merck Silica Gel 60 F254) або за допомовикористовуючи описані способи й сполуки винагою HPLC; і ходу для модулювання RAF. (viii) проміжні речовини повністю не були опиlll. Фармацевтичні композиції й уведення спосані й чистоту оцінювали тонкошаровою хроматолук - похідних 5-азахіноксаліну графією (TLC) або HPLC. Способи приготування фармацевтичних комПроцедури синтезу позицій сполук, способи визначення кількості Сполука А-2: 6-бензиламіно-3-(4сполуки для введення пацієнтові й шляхи ввегідроксиФеніл)-5-азахіноксалін дення сполук в організм описані в заявці США 4-Гідроксифенілгліоксаль одержували з 4№08/702232, Tang et al., яка має назву: "Комбінагідроксиацетофенону (Lancaster, Acros) згідно з торні бібліотеки індолінолу й відповідні продукти опублікованим методом (J. Amer. Chem. Soc, 71, та способи лікування хвороби" (Lyon & Lyon 1045 (1949)). Docket №221/187), зареєстрована 23 серпня 1996 2-Аміно-6-бензиламіно-3-нітропіридин одерроку, і міжнародна патентна заявка WO 96/22976, жували з 2-аміно-6-хлор-3-нітропіридину наступBuzzetti et al., яка має назву "Водорозчинні похідним чином: 2-аміно-6-хлор-3-нітропіридин (17,35г, ні 3-ариліден-2-оксіндол як інгібітори тирозинкіна0,10моль), бензиламін (Fluka) (10,72г, 0,10моль) і зи", опублікована 1 серпня 1996 року, обидві порошок карбонату калію порошок (10,4г, включені сюди цілком шляхом посилання, вклю0,035моль) у н-бутанолі (100мл) нагрівали при чаючи будь-які малюнки. Фахівці у галузі визнадефлегмації протягом 2 годин. Суспензію фільтватимуть, що такі описи придатні до цього винарували й після охолодження до кімнатної темпеходу й можуть бути легко застосовані. ратури тверду речовину збирали за допомогою Приклади фільтрації, промивали бутанолом і висушували Нижченаведені приклади є необмежуючими й при 50°С у вакуумі для утворення 2-аміно-6лише ілюструють різні аспекти й властивості цьобензиламіно-3-нітропіридину (22,2г, 91%, т.пл. го винаходу. Приклади описують способи синте145-146°С). зування сполук винаходу й способи вимірювання 6-Бензиламіно-3-(4-гідроксифеніл)-5впливу сполуки на функцію протеїнкінази RAF. азахіноксалін одержували з 2-аміно-6Клітини, що використовуються у способах, є бензиламіно-3-нітропіридину наступним чином: 2комерційно доступними. Вектори нуклеїнових аміно-6-бензиламіно-3-нітропіридин (25г, кислот, що потрапляють у клітину, є також коме0,10моль) гідрогенізували під тиском в 5,5бар Н2 рційно доступними й послідовності генів для різв присутності 10г нікелевого каталізатора Ренея у них протеїнкіназ є легко доступними в банках 400мл діоксану при 60°С. За 2 години реакційну даних послідовностей. Таким чином, звичайний суміш охолоджували до кімнатної температури, фа хівець угалузі може легко відтворити клітинні фільтрували й додавали 4лінії своєчасно шляхом комбінування комерційно гідроксифенілгліоксаль і перемішували протягом доступних клітин, комерційно доступних векторів 2 годин в атмосфері аргону. Суспензію потім рознуклеїнових кислот і генів протеїнкіназ, викорисводили водою, тверду речовину збирали за дотовуючи методи, що є у розпорядженні звичайних помогою фільтрації, промивали водою, рекристафа хівців у цій галузі. лізували з 2-пропанолом і висушували при 50°С у Приклад 1: Процедури синтезу сполук похідвакуумі для утворення 6-бензиламіно-(4них 5-азахіноксаліну гідроксифеніл)-5-азахіноксаліну (8г, 24,4%, т.пл. Винахід буде проілюстровано наступними 271-273°С). прикладами, що не є обмеженими, в яких, якщо Сполука А-1: 6-Феніламіно-3-(4 37 71555 38 гідроксифеніл)-5-азахіноксалін гідроксифеніл)-5-азахіноксалін Застосування феніламіну замість бензиламіСполука А-19: 6-(4-Хлорбензиламіно)-3-(4ну у процедурі для Сполуки А-2 та ідентичний гідроксифеніл)-5-азахіноксалін процес дає 6-феніламіно-3-(4-гідроксифеніл)-5Сполука А-20: 6-(2-Фторбензиламіно)-3-(4азахіноксалін. гідроксифеніл)-5-азахіноксалін Сполука А-3: 6-метокси-2-метил-3-Феніл-5Сполука А-21: 6-(3-Фторбензиламіно)-3-(4азахіноксалін Застосування 1-феніл-1,2гідроксифеніл)-5-азахіноксалін пропандіону замість 4-гідроксифенілгліоксалю і Сполука А-22: 6-(4-Фторбензиламіно)-3-(4метанолу замість бензиламіну у процедурі для гідроксифеніл)-5-азахіноксалін Сполуки А-2 та ідентичний процес дає 6-метоксиСполука А-23: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-[22-метил-3-феніл-5-азахіноксалін. (трифторметил)бензиламіно]-5-азахіноксалін Сполука А-4: 6-метокси-2,3-дифеніл-5Сполука А-24: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-[3азахіноксалін (трифторметил)бензиламіно]-5-азахіноксалін Застосування бензилу замість 4Сполука А-25: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-[4гідроксифенілгліоксалю і метанолу замість бен(трифторметил)бензиламіно]-5-азахіноксалін зиламіну у процедурі для Сполуки А-2 та ідентиСполука А-26: 3-(4-Гідроксифеніл)-6чний процес дає 6-метокси-2,3-дифеніл-5(фенетил-1-аміно)-5-азахіноксалін. азахіноксалін. Сполука А-27 - А-48 Сполука А-5: 6-(4-Фторбензиламіно)-2-метилЗастосування належним чином заміщеного 3-феніл-5-азахіноксалін аніліну замість бензиламіну у процедурі для СпоЗастосування 1-феніл-1,2-пропандіону залуки А-2 та ідентичний процес дає наступні Спомість 4-гідроксифенілгліоксалу й 4луки: фторбензиламіну замість бензиламіну у процеСполука А-27: 6-(2-Карбоксифеніламіно)-3-(4дурі для Сполуки А-2 та ідентичний процес дає 6гідроксифеніл)-5-азахіноксалін (4-фторбензиламіно)-2-метил-3-феніл-5Сполука А-28: 6-(3-Карбоксифеніламіно)-3-(4азахіноксалін. гідроксифеніл)-5-азахіноксалін Сполука А-6: 2,3-дифеніл-6-(4Сполука А-29: 6-(4-Карбоксифеніламіно)-3-(4фторбензиламіно)-5-азахіноксалін гідроксифеніл)-5-азахіноксалін Застосування бензилу замість 4Сполука А-30: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(2гідроксифенілгліоксалю й 4-фторбензиламіну нітрофеніламіно)-5-азахіноксалін замість бензиламіну у процедурі для Сполуки А-2 Сполука А-31: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(3та ідентичний процес дає 2,3-дифеніл-6-(4нітрофеніламіно)-5-азахіноксалін фторбензиламіно)-5-азахіноксалін. Сполука А-32: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(4Сполука А-7: 3-феніл-6-феніламіно-5нітрофеніламіно)-5-азахіноксалін азахіноксалін Сполука А-33: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(2Застосування фенілгліоксалю замість 4метилфеніламіно)-5-азахіноксалін гідроксифенілгліоксалю й аніліну замість бензиСполука А-34: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(3ламіну у процедурі для Сполуки А-2 та ідентичметилфеніламіно)-5-азахіноксалін ний процес дає 3-феніл-6-феніламіно-5Сполука А-35: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(4азахіноксалін. метилфеніламіно)-5-азахіноксалін Сполука А-8: А-26 Сполука А-36: 6-(2-Хлорфеніламіно) 3-(4Застосування належним чином заміщеного гідроксифеніл)-5-азахіноксалін бензиламіну замість бензиламіну у процедурі для Сполука А-37: 6-(3-Хлорфеніламіно) 3-(4Сполуки А-2 та ідентичний процес дає наступні гідроксифеніл)-5-азахіноксалін Сполуки: Сполука А-38: 6-(4-Хлорфеніламіно) 3-(4Сполука А-8: 6-(2-Карбоксибензиламіно)-3-(4гідроксифеніл)-5-азахіноксалін гідроксифеніл)-5-азахіноксалін Сполука А-39: 6-(2-Фторфеніламіно) 3-(4Сполука А-9: 6-(3-Карбоксибензиламіно)-3-(4гідроксифеніл)-5-азахіноксалін гідроксифеніл)-5-азахіноксалін Сполука А-40: 6-(3-Фторфеніламіно) 3-(4Сполука А-10: 6-(4-Карбоксибензиламіно)-3гідроксифеніл)-5-азахіноксалін (4-гідроксифеніл)-5-азахіноксалін Сполука А-41: 6-(4-Фторфеніламіно) 3-(4Сполука А-11: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(2гідроксифеніл)-5-азахіноксалін нітробензиламіно)-5-азахіноксалін Сполука А-42: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-[(2Сполука А-12: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(3трифторметил)феніламіно]-5-азахіноксалін нітробензиламіно)-5-азахіноксалін Сполука А-43: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-[(3Сполука А-13: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(4трифторметил)феніламіно]-5-азахіноксалін нітробензиламіно)-5-азахіноксалін Сполука А-44: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-[(4Сполука А-14: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(2трифторметил)феніламіно]-5-азахіноксалін метилбензиламіно)-5-азахіноксалін Сполука А-45: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(пірид-2Сполука А-15: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(3аміно)-5-азахіноксалін метилбензиламіно)-5-азахіноксалін Сполука А-46: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(пірид-3Сполука А-16: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(4аміно)-5-азахіноксалін метилбензиламіно)-5-азахіноксалін Сполука А-47: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(пірид-4Сполука А-17: 6-(2-Хлорбензиламіно)-3-(4аміно)-5-азахіноксалін гідроксифеніл)-5-азахіноксалін Сполука А-48: 3-(4-Гідроксифеніл)-6-(пірид-2Сполука А-18: 6-(3-Хлорбензиламіно)-3-(4метиламіно]-5-азахіноксалін 39 71555 40 Сполуки А-49 - -А-67 Сполука А-76: 6-(4-Метилфеніламіно)-3Застосування належним чином заміщеного феніл-5-азахіноксалін бензиламіну замість бензиламіну і фенілгліоксаСполука А-77: 6-(2-Хлорфеніламіно)-3-феніллю замість 4-гідроксифенілгліоксалю у процедурі 5-азахіноксалін для Сполуки А-2 та ідентичний процес дає настуСполука А-78: 6-(3-Хлорфеніламіно) 3-фенілпні Сполуки: 5-азахіноксалін Сполука А-49: 6-(2-Карбоксибензиламіно)-3Сполука А-79: 6-(4-Хлорфеніламіно) 3-фенілфеніл-5-азахіноксалін 5-азахіноксалін Сполука A-50: 6-(3-Карбоксибензиламіно)-3Сполука А-80: 6-(2-Фторфеніламіно) 3-фенілфеніл-5-азахіноксалін 5-азахіноксалін Сполука А-51: 6-(4-Карбоксибензиламіно)-3Сполука А-81: 6-(3-Фторфеніламіно) 3-фенілфеніл-5-азахіноксалін 5-азахіноксалін Сполука А-52: 6-(2-Нітробензиламіно-3Сполука А-82: 6-(4-Фторфеніламіно) 3-фенілфеніл)-5-азахіноксалін 5-азахіноксалін Сполука А-53: 6-(3-Нітробензиламіно)-3Сполука А-83: 3-Феніл-6-[(2феніл-5-азахіноксалін трифторметил)феніламіно]-5-азахіноксалін Сполука А-54: 6-(4-Нітробензиламіно)-3Сполука А-84: 3-Феніл-6-[(3феніл-5-азахіноксалін трифторметил)феніламіно]-5-азахіноксалін Сполука А-55: 6-(2-Метилбензиламіно)-3Сполука А-85: 3-Феніл-6-[(4феніл-5-азахіноксалін трифторметил)феніламіно]-5-азахіноксалін Сполука А-56: 6-(3-Метилбензиламіно)-3Сполука А-86: 3-Феніл-6-(пірид-2-аміно)-5феніл-5-азахіноксалін азахіноксалін Сполука А-57: 6-(4-Метилбензиламіно)-3Сполука А-87: 3-Феніл-6-(пірид-3-аміно]-5феніл-5-азахіноксалін азахіноксалін Сполука А-58: 6-(2-Хлорбензиламіно)-3Сполука А-88: 3-Феніл-6-(пірид-4-аміно)-5феніл-5-азахіноксалін азахіноксалін Сполука А-59: 6-(3-Хлорбензиламіно)-3Сполука А-89: 3-Феніл-6-(пірид-2феніл-5-азахіноксалін метиламіно)-5-азахіноксалін Сполука А-60: 6-(4-Хлорбензиламіно)-3Сполука А-90: 6-Феніламіно-3-(4феніл-5-азахіноксалін метоксифеніл)-5-азахіноксалін Сполука А-61: 6-(2-Фторбензиламіно)-3Застосування 4-метоксифенілу замість 4феніл-5-азахіноксалін гідроксифенілу у процедурі для Сполуки А-1 та Сполука А-62: 6-(3-Фторбензиламіно)-3ідентичний процес дає 6-феніламіно-3-(4феніл-5-азахіноксалін меотксифеніл)-5-азахіноксалін. Сполука А-63: 6-(4-Фторбензиламіно)-3Приклад 2: Тест на вимірювання функції фофеніл-5-азахіноксалін сфорилування RAF Сполука А-64: 3-Феніл-6-(2Наступний тест визначає кількість каталізо(трифторметил)бензиламіно]-5-азахіноксалін ваного RAF фосфорилування його мішені-білка Сполука А-65: 3-Феніл-6-(3МЕК, а також мішені МЕК - МАРК. Послідовність (трифторметил)бензиламіно]-5-азахіноксалін гена RAF описана у Bonner et al., 1985, Molec. Сполука А-66: 3-Феніл-6-(4Cell. Віol. 5:1400-1407, і є легкодоступною у чисе(трифторметил)бензиламіно]-5-азахіноксалін льних базах даних послідовність гена. Створення Сполука А-67: 3-Феніл-6-(фенетил-1-аміно)-5вектора нуклеїнової кислоти й клітинних ліній, азахіноксалін використовуваних у цій частині винаходу, повнісСполуки А-68 - А-89. тю описані у Morrison et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Застосування належним чином заміщеного Sci. USA 85:8855-8859. аніліну замість бензиламіну й фенілгліоксалю Матеріали та реактиви замість 4-гідроксифенілгліоксалю у процедурі для 1. Sf9 (Spodoptera frugiperda) клітини; GIBCOсполуки А-2 та ідентичний процес дає наступні BRL, Gaithersburg, MD. сполуки: 2. Буфер RIPA: 20мМ Трис/НСІ рН 7,4; 137мМ Сполука А-68: 6-(2-Карбоксифеніламіно)-3NaCI, 10% гліцерин, 1мМ PMSF, 5мг/л Апротеніфеніл-5-азахіноксалін ну, 0,5% Тритон Х-100; Сполука А-69: 6-(3-Карбоксифеніламіно)-33. Рекомбінантний білок тіоредоксин-МЕК (Тфеніл-5-азахіноксалін МЕК): Т-МЕК експресію й очищення виконували Сполука А-70: 6-(4-Карбоксифеніламіно)-3за допомогою афінної хроматографії згідно з інфеніл-5-азахіноксалін струкціями виробника. Сполука А-71: 6-(2-Нітрофеніламіно)-3-фенілКаталог № К 350-01 і R 350-40, Invitrogen 5-азахіноксалін Corp., Сан-Дієго, штат Калі форнія, США. Сполука А-72: 6-(3-Нітрофеніламіно)-3-феніл4. His-MAPK (ERK 2); His-мічений МАРК екс5-азахіноксалін пресували у "XL1 Blue cells", трансформованих Сполука А-73: 6-(4-Нітрофеніламіно)-3-фенілpUC18 вектором, що кодує His-MAPK. His-MAPK 5-азахіноксалін очищали Ni-афінною хроматографією. Каталог Сполука А-74: 6-(2-Метилфеніламіно)-3№27-4949-01, Pharmacia, Аламеда, штат Каліфофеніл-5-азахіноксалін рнія, США, як описано в цьому винаході. Сполука А-75: 6-(3-Метилфеніламіно)-35. Антитіла вівці проти IgG: Jackson феніл-5-азахіноксалін laboratories, West Grove, штат Пенсильванія. Ка 41 71555 42 талог №515-006-008, Номер партії №28563 використання. 6. Антитіло, специфічне до протеїнкінази 6. Видаляли матеріал, що не зв'язався, й проRAF-1: URP2653 з UBI. мивали, як було описано вище (етап 3), 7. Буфер для інкубації: PBS; фосфатний бу7. Додавали 2мкг Т-МЕК і 2мкг His-MAEPK на ферний розчин, GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD. комірку і доводили об'єм до 40мкл кіназним бу8. Буфер для промивання: TBST - 50мМ фером. Способи очищення Т-МЕК і МАРК з кліТрис/HCL рН 7,2, 150мМ NaCI, 0,1% Тритон Х-100 тинних екстрактів наведені в цьому винаході 9. Буфер для блокування: TBST, 0,1% етаношляхом прикладів. ламін рН 7,4; 8. Сполуки попередньо розчиняли (вихідний 10. DMSO, Sigma, Св. Льюіс, штат Міссурі, розчин 10мг/мл у DMSO) або екстрагували 20США кратною TBST та 1% DMSO. Додавали 5мкл по11. Буфер для кінази (KB): 20мМ Hepes/HCI передньо розведених сполук/екстрактів в комірки, рН 7,2, 150мМ NaCI, 0,1% Тритон Х-100, 1мМ як описано в етапі 6. Інкубували протягом 20 хвиPMSF, 5мг/л Апротеніну, 75нм ортованадату налин. До контролю ліків не додавали. трію, 0,5мMDTT i 10мМ МgСl2. 9. Починали реакцію кінази з додаванням 12. Суміш АТР: 100мМ МgСl2, 300мкМ АТФ, 5мкл суміші АТФ; стр ушували планшети на шейкері для ELISA протягом інкубації. 10мкКі g-33P АТФ (Dupont-NEM)/мл. 13. Розчин для зупинки реакції: 1% фосфор10. Зупиняли реакцію кінази за 60 хвилин додаванням 30мкл розчину для зупинки реакції у на кислота; Fisher, Піттсбург, шта т Пенсильванія, кожну комірку. США. 11. Розміщували фосфоцелюлозну підкладку 14. Підкладки Wallac Cellulose Phosphat Filter; та планшет для ELISA у колектор для планшетів Wallac, Турку, Фінляндія. 15. Розчин для промивання фільтрів: 1% фоТОМТЕС. Збирали й промивали фільтр розчином для промивання згідно з інструкціями виробника. сфорна кислота, Fisher, Піттсбург, штат ПенсильВисушували фільтрувальні підкладки. Розміщуванія, США. вали фільтрувальні підкладки в утримувачі. Вста16. Колектор для планшетів Tomtec plate вляли утримувач в апарат для визначення радіоharvester, Wallac, Турку, Фінляндія. 17. Зчитувач планшетів Wallac beta plate активності й вираховували радіоактивний фосфор на фільтрувальних підкладках. reader # 1205, Wallac, Турку, Фінляндія. Як альтернатива, 40мкл аліквот з окремих 18. NUMC 96-коміркові з V-подібним дном комірок планшету для дослідження переносили поліпропіленові планшети для сполук Applied до відповідних положень на фосфоцелюлозній Scientific Каталог №AS-72092. Процедура фільтрувальній підкладці. Після повітряного просушування фільтри переносили у піднос. Після Усі з наступних етапів проводились за кімнам'якого струшування підносу змінювали розчин тної температури, якщо додатково не зазначено. для промивання кожні 15 хвилин протягом годи1. Завантаження планшету для ELISA: лунки ни. Фільтрувальні підкладки висушували на повідля ELISA завантажували 100мкл антисироватки вівці проти миші, очищеної за допомогою афінної трі. Розміщували фільтрувальні підкладки в утримувачі. Вста вляли утримувач в апарат для хроматографії (1мкг/100мкл буфера для заванвизначення радіоактивності й вираховували кільтаження), протягом ночі при 4°С. Планшети для кість радіоактивного фосфору на фільтрувальних ELISA можуть використовуватись протягом двох підкладках. тижнів при зберіганні при 4°С. 2. Перегортали планшет і видаляли рідину. Значення ІС50 вимірювали згідно з протоколом для наступних сполук похідних 5Додавали 100мкл розчину для блокування й інкуазахіноксаліну в тесті ELISA з використанням бували протягом 30хв. RAF-1: 3. Видаляли розчин для блокування і промивали чотири рази буфером для промивання. Струшували планшет на паперовий рушник для видалення надлишку рідини. 4. Додавали 1мкг антитіла, специфічного до RAF-1, до кожної комірки й інкубували протягом 1 години. Промивали, як описано в етапі 3. 5. Розморожували лізати з RAS/RAFінфікованих клітин Sf9 і розводили TBST до 10нг/100мкл. Додавали 10мкг розведеного лізату в лунки й інкубували протягом 1 години. Струшували планшет протягом інкубування. До негативних контрольних зразків не додавали лізату. Лізати RAS/RAF-інфікованих клітин Sf9 комах одержували після інфікування клітин рекомбінантними бакуловірусами при МОІ=5 для кожного вірусу й збирали через 48 годин. Клітини промивали один раз PBS і лізували в буфері RIPA. Нерозчинний матеріал видаляли центрифугуванням (5хв при 10000G). Аліквоти лізатів заморожували в сухому льоді/етанолі і зберігали при - 80°С до Значення IC50 - це концентрація інгібітора на 43 71555 основі 5-азахіноксаліну, потрібного для зменшення максимальної кількості фосфорилованого білка-мішені або росту клітини на 50%. Значення IC50 вимірювали у тесті з фосфорилуванням RAF1, як показано у Таблиці 1: Таблиця 1 Сполука А-1 А-2 А-7 А-36 А-77 А-90 ІС50 (мкМ) 11,5 7,8 33 45,6 20,3 98,0 Приклад 3: Очищення Марk і Меk Білки МАРК і МЕК легко експресуються в клітинах з допомогою субклонування гена, що кодує ці білки, у комерційно доступний вектор, що експресує білки з полігістидиновою міткою. Гени, що кодують ці білки, є легко доступними у лабораторіях, що зазвичай працюють з цими білками або шляхом клонуванням цих генів з клітин, що містять бібліотеки кДНК. Бібліотеки є комерційно доступними і фахівець у галузі може легко розробити зонди нуклеїнових кислот, гомологічних молекулі кДНК, що кодує МЕК або МАРК, з послідовності нуклеїнових кислот МЕК і МАРК, доступних у чисельних базах даних генів, таких як Genbank. Клонування гена може відбуватись за короткий проміжок часу з використанням способів, зараз доступних фа хівцям у галузі. Очищення білків МЕК і МАРК з клітинних екстрактів може бути виконано з використанням наступного протоколу, який був перейнятий у Robbins et ai., 1993, J. Biol. Chem. 268: 5097-5106: 1. Лізис клітин шляхом обробки ультразвуком, осмотичного стресу або способами French Press, легко доступними фахівцям у галузі. Певний буфер для обробки ультразвуком наведений нижче. 2. Урівноваження твердої основи, яка зв'язана з нікелем або кобальтом, буфером для врівноваження, описаним нижче. Полігістидинова мітка специфічно зв'язується з атомами нікелю й кобальту на твердій основі. Врівноваження може бути досягн уто промиванням смоли тричі об'ємом буфера для врівноваження, що в 10 разів менше за об'єм твердої основи. Тверда основа є легко доступною звичайним фахівцям у галузі. 3. Додавали клітинний лізат до твердої основи й врівноважували в посудині протягом деякого часу. Як альтернатива, тверда основи може бути запакована всередині білкової хроматографічної колонки й лізат може пропускатись через тверду основу. 4. Промивали тверду основу буфером для промивання, описаним нижче. 5. Елюювали білок МЕК або МАРК з твердої основи такою кількістю буфера для елюювання (наведений нижче), що видаляє значну частину білка з твердої основи. Буфер для обробки ультразвуком: 50мМ фосфа ту натрію рН 8,0 44 0,3Μ хлориду натрію 10мМ b-меркаптоетанолу 1% ΝΡ40 10MM NaF 0,5мМ Pefablock Буфер для врівноваження: 50мМ фосфа ту натрію рН 8,0 0,3Μ хлориду натрію 10мМ b-меркаптоетанолу 1% ΝΡ40 10мM NaF 1мМ Імідазолу Буфер для промивання: 50мМ фосфа ту натрію рН 8,0 0,3Μ хлориду натрію 10мМ b-меркаптоетанолу 1% ΝΡ40 10мM NaF 10мМ імідазолу Буфер для елюювання: 50мМ фосфа ту натрію рН 8,0 0,3Μ хлориду натрію 10мМ b-меркаптоетанолу 1% ΝΡ40 10мM NaF 10-500мМ імідазолу Приклад 4: Тест на вимірювання функції фосфорилування рецептора EGF Кіназна активність рецептора EGF (EGFRNIH3T3 тест) в цілих клітинах вимірювали, як описано детально в заявці РСТ W0 9640116, зареєстрованій 5 червня, 1996, на ім'я Tang et al., яка має назву "Сполуки індолінолу для лікування хвороб" та включена сюди цілком шляхом посилання, включаючи будь-які малюнки. Значення ІС50, що вимірювали в тесті на фосфорилування рецептора EGF, зображені в Таблиці 2: Таблиця 2 Сполука А-2 А-3 А-4 А-5 А-6 А-7 ІС50 (мкМ) >50 >100 >100 >100 >100 >50 Приклад 5: Тест на вплив сполук похідних 5азахіноксаліну на ріст клітин, що експресують RAS Наступний тест вимірює швидкість росту клітин NIH-3T3, що експресують RAS. Метою тесту є визначення впливу сполук на ріст клітин NIH 3Т3, що надмірно експресують H-Ras. Матеріали: 96-коміркові стерильні планшети з плоским дном 96-коміркові стерильні планшети з круглим дном стерильні 25мл або 100мл посудини піпетки, підставка для багатьох піпеток стерильні кінчики для піпетки стерильні 15мл і 50мл пробірки 45 71555 46 Реактиви кінцеву концентрацію DMSO, яку використовува0,4% SRB у 1 % оцтова кислота ли при найвищій концентрації сполуки під час 10мМ основи Трису скринінгу, у колонки 1-11. Наприклад, якщо най10% ТСА вища концентрація становить 100мкл, і яку ство1% оцтова кислота рювали зі 100мМ ви хідного розчину, то одинична стерильний DMSO (Sigma) концентрація DMSO становить 0,1%, а подвійна сполука в DMSG (100мМ або менший вихідконцентрація DMSO становить 0,2%. Цей планний розчин) шет використовували для титр ування сполуки - 4 Трипсин-EDTA (GIBCO BRL) рядки на сполуку. Клітинна лінія: 2. У стерильній 15мл пробірці створювали 3T3/H-Ras (NIH 3Т3 клон 7 клітин, що експреподвійні розчин найвищої концентрації скринінгу сують геномнілй фрагмент онкогенного H-Ras). сполуки у середовищі для росту плюс подвійний Клітин можуть бути створені з використанням DMSO. Необхідним є 1мл на клітинну лінію. Понаступного протоколу: чаткова концентрація сполуки зазвичай стано1. Субклонували фрагмент гена, що кодує вить 100мкМ, але ця концентрація може змінюваRas, у комерційно доступний вектор, що стабільтись залежно від розчинності сполуки. но трансфікуватиме клітини NIH-3T3. Фрагмент 3. Переносили 240мкл подвійного початковобрали з геномного трансформуючого алелю го розчину сполуки до лунок, яких у чотири рази cHa-ras. більше, у колонку 12 з 96-коміркового планшету з 2. Трансфікували клітини NIH-3T3 субклонокруглим дном. Проводили 1:2 послідовні розвеваним вектором згідно зі способом з використандення по планшету справа наліво за допомогою ням фосфату кальцію. Відбирали клітини, що перенесення 12мкл з колонки 12 до колонки 11, з експресують конструкт Ras У 2% сироватці у колонки 11 до 10 і так далі до колонки 2. ПереноDMEML Осередки, що видно неозброєним оком, сили 100мкл розведень сполуки і 100мкл середоможна зберігати після 2 тижнів. Збирали трансвища в колонку 1 на 100мкл середовища на кліформовані клітини для створення стабільно тини у відповідні лунки 96-коміркового планшету трансформованої клітинної лінії. із плоским дном. Загальний об'єм на комірку має Середовище для росту: бути 200мкл. 2% сироватки теляти/DMEM + 2мМ глутаміну, 4. Повертали планшет до інкубатора й інкуPen/Strep бували протягом 3 днів. Протокол: День 4: Проведення тесту День 0: Висадження клітин: Цю частину тесту виконували в лабораторних Ця частина тесту виконували у витяжній шафі умовах. з ламінарним потоком. 1. Видаляли рідину або зливали середовище. 1. Клітини піддавали трипсинізації. ПереноДодавали 200мкл охолодженого 10% ТСА до косили 200мкл суспензії клітин до 10мкл ізотонічножної комірки для фіксації клітин. Інкубували планго розчину. Підраховували клітини лічильником шет протягом принаймні 60хв. при 4°С. Coulter. 2. Видаляли ТСА і промивали лунки 5 разів 2. Розводили клітини в середовищі для росту водою з-під крана. Висушували планшети верхом до 60000клітин/мл. Переносили 100мкл клітин до донизу на паперових рушниках. кожної комірки у 96-комірковий планшет із плос3. Фарбували клітини 100мкл/комірку 0,4% ким дном для створення 6000клітини/комірку. SRB протягом 10хв. 3. Використання половини планшету (4 ряд4. Заливали SRB і промивали лунки 5 разів ки) для кожної сполуки й у чотири рази більше 1% оцтовою кислотою. Висушували планшети лунок для кожної концентрації сполуки й 4 лунки повністю верхнім боком донизу на паперових для контролювання середовища. рушниках. 4. Планшети помірно струшували для рівно5. Розчиняли барвник у 100мкл/комірку 10мМ мірного прилипання клітин. основи Трису протягом 5-10хв. на шейкері. 5. Інкубували планшети при 37°С у 10% СОг 6. Зчитували планшети з допомогою планшеінкубаторі. тного зчитувача Dynatech ELISA при 570нм стоДень 1: Додавання сполуки: совно 630нм. Цю частину тесту виконували у витяжній шаВідбирали сполуки, що уповільнювали швидфі з ламінарним потоком. кість росту клітин, що занадто експресують RAS, 1. У 96-комірковий планшет додавали 120мкл як проілюстровано в Таблиці 3. середовища для зростання, що містило подвійну азахіноксаліну на ріст клітин А549 Таблиця 3 Наступний тест вимірює швидкість росту для клітин А549. Метою тесту є визначення впливу сполуки на ріст клітин карциноми легень людини Сполука ІС50 (МКМ) RAS/NIH3T3 А549. Клітини А549 легко доступні від комерційА-1 1,04 них джерел, таких як АТСС (CCL185). А-2 7,6 Матеріали: А-6 13,5 96-коміркові стерильні планшети з плоским А-36 0,18 дном А-77 0,7 96-коміркові стерильні планшети з круглим дном Приклад 6: Тест на вплив сполук похідних 5 47 71555 48 стерильні 25мл або 100мл посудини сили 100мкл розведень сполуки і 100мкл середопіпетки, підставка для багатьох піпеток вища в колонку 1 на 100мкл середовища на клістерильні кінчики для піпетки тини у відповідні лунки 96-коміркового планшету стерильні 15мл і 50мл пробірки із плоским дном. Загальний об'єм на комірку має Реактиви: бути 200мкл. 0,4% SRB у 1% оцтовій кислоті 4. Повертали планшет до інкубатора й інку10мМ основи Трису бували протягом 3 днів. 10%ТСА День 5: Проведення тесту 1% оцтова кислота Цю частину тесту виконували в лабораторних стерильний DMSO (Sigma) умовах. сполука в DMSG (100мМ або менший вихід1. Видаляли рідину або зливали середовище. ний розчин) Додавали 200мкл охолодженого 10% ТСА до коТрипсин-EDTA (GIBCO BRL) жної комірки для фіксації клітин. Інкубували планКлітинна лінія та середовище для росту: шет протягом принаймні 60хв. при 4°С. Клітини карциноми легень людини А549 2. Видаляли ТСА і промивали лунки 5 разів (АТСС CCL185) водою з-під крана. Висушували планшети верхом 10% сироватки плоду великої рогатої худоби донизу на паперових рушниках. у середовищі Ham F12-K 3. Фарбували клітини 100мкл/комірку 0,4% Протокол: SRB протягом 10хв. День 0: Висадження клітин: 4. Заливали SRB і промивали лунки 5 разів Ця частина тесту виконували у витяжній шафі 1% оцтовою кислотою. Висушували планшети з ламінарним потоком. повністю верхнім боком донизу на паперових 1. Клітини піддавали трипсинізації. Перенорушниках. сили 200мкл суспензії клітин до 10мкл ізотонічно5. Розчиняли барвник у 100мкл/комірку 10мМ го розчину. Підраховували клітини лічильником основи Трису протягом 5-10хв. на шейкері. Coulter. 6. Зчитували планшети з допомогою планше2. Розводили клітини в середовищі для росту тного зчитувача Dynatech ELISA при 570нм стодо 20000клітин/мл. Переносили 100мкл клітин до совно 630нм. кожної комірки у 96-комірковий планшет із плосВідбирали сполуки, що уповільнювали швидким дном для створення 2000клітини/комірку. кість росту А549 клітин, як проілюстровано в Таб3. Використання половини планшету (4 рядлиці 4. ки) для кожної сполуки, у чотири рази більше лунок для кожної концентрації сполуки і 4 лунок для Таблиця 4 контролювання середовища. 4. Планшети помірно струшували для рівноСполука IC50 (мкМ) А549 мірного прилипання клітин. А-2 25,1>10 (2% FBS) 5. Інкубували планшети при 37°С у 10% СО2 А-6 23,8>10 (2% FBS) інкубаторі. День 1: Додавання сполуки: Приклад 7: Спосіб визначення біологічної акЦю частину тесту виконували у витяжній шативності модуляторів RAF in vi vo фі з ламінарним потоком. Дослідження з використанням ксенотрансп1. У 96-комірковий планшет додавали 120мкл лантатів можуть бути використані для визначення середовища для зростання, що містило подвійну впливу сполуки винаходу на інгібування клітин кінцеву концентрацію DMSO, яку використовувапухлин яєчників, меланоми, простати, легень й ли при найвищій концентрації сполуки під час молочних залоз. Протокол тесту описаний детаскринінгу, у колонки 1-11. Наприклад, якщо найльно в публікації РСТ W09640116, зареєстровавища концентрація становить 100мкМ, і яку ствоній 5 червня 1996 року на ім'я Tang et al., що має рювали зі 100мМ ви хідного розчину, то одинична назву "Сполуки індолінолу для лікування хвороконцентрація DMSO становить 0,1%, а подвійна би", включений сюди цілком шляхом посилання, з концентрація DMSO становить 0,2%. Цей планбудь-якими малюнками. шет використовували для титр ування сполуки - 4 Винахід, як приклад, описаний тут, може бути рядки на сполуку. здійснений за відсутності будь-якого елемента 2. У стерильній 15мл пробірці створювали або елементів, обмеження або обмежень, як не подвійні розчин найвищої концентрації для скриспецифічно описані в цьому винаході. Терміни й нінгу сполуки у середовищі для росту плюс повирази, які були використані, використовуються двійний DMSO. Необхідним є 1мл на клітинну як терміни опису, а не з метою обмеження, і не лінію. Початкова концентрація сполуки зазвичай існує такого винаходу, в якому би використання становить 100мкМ, але ця концентрація може таких термінів і виразів виключало будь-які еквізмінюватись залежно від розчинності сполуки. валенти властивостей, показаних і описаних, або 3. Переносили 240мкл подвійного початковойого частин, до того ж, треба зазначити, що різні го розчину сполуки до лунок, яких у чотири рази модифікації можливі в межах об'єму винаходу. більше, у колонку 12 з 96-коміркового планшету з Таким чином, треба зрозуміти, що хоча цей винакруглим дном. Проводили 1:2 послідовні розвехід був специфічно описаний кращими втіленнядення по планшету справа наліво за допомогою ми, властивості, модифікації та варіації концепції перенесення 12мкл з колонки 12 до колонки 11, з цього винаходу можуть бути зроблені фахівцями колонки 11 до 10 і так далі до колонки 2. Переноу галузі, і що такі модифікації і варіації вважають 49 71555 50 ся такими, що не виходять за межі цього винахонепатентні посилання, спеціально включені сюди ду, і визначаються доданою формулою. шляхом посилання з будь-якою метою. Інші втіТі посилання, попередньо не включені сюди лення знаходяться в межах наступної формули. шляхом посилання, включаючи як патентні, так і Комп’ютерна в ерстка О. Гапоненко Підписне Тираж 37 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюMethods for modulating function of serine/threonine protein kinases by 5-azaquinoline derivatives
Автори англійськоюGuenther Eckhard
Назва патенту російськоюСпособы модуляции функции сериновых/треониновых протеинкиназ соединениями на основе 5-азахиноксалина
Автори російськоюГюнтер Экхард
МПК / Мітки
МПК: A61K 31/4985, A61P 1/16, C07D 471/04, A61P 35/00, A61P 43/00
Мітки: модулювання, ідентифікації, 5-азахіноксаліну, функцію, функції, запобіган, спосіб, сполук, протеїнкінази, сполуками, модулюють, похідними
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/25-71555-sposib-modulyuvannya-funkci-serinovo-treoninovo-protenkinazi-spolukami-shho-eh-pokhidnimi-5-azakhinoksalinu-sposib-identifikaci-spoluk-shho-modulyuyut-funkciyu-serinovo-treoninovo.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб модулювання функції серинової/треонінової протеїнкінази сполуками, що є похідними 5-азахіноксаліну, спосіб ідентифікації сполук, що модулюють функцію серинової/треонінової протеїнкінази, спосіб запобіган</a>