Спосіб визначення вмісту фізіологічного пріона методом дот-блоту

Спосіб визначення вмісту фізіологічного пріона методом дот-блоту, що включає відбір зразків, їх лізис, нанесення на мембрану і імунологічну детекцію, який відрізняється тим, що використовують нітроцелюлозну мембрану для нанесення зразків без електрофоретичного розділення білків лізату тканин у ПААГ та без наступного перенесення їх на полівінілдифторидну мембрану (ПВДФ). (19) (21) u201009052 (22) 19.07.2010 (24) 25.01.2011 (46) 25.01.2011, Бюл.№ 2, 2011 р. (72) ВЛІЗЛО ВАСИЛЬ ВАСИЛЬОВИЧ, МАЙОР ХРИСТИНА ЯРОСЛАВІВНА, СТАДНИК ВІТАЛІЙ ВІТАЛІЙОВИЧ (73) ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН 3 Технічний результат досягається шляхом використання нітроцелюлозної мембрани для нанесення зразків без електрофоретичного розділення білків лізату тканин у ПААГ та без наступного перенесення їх на ПВДФ мембрану. При проведенні заявником патентноінформаційного пошуку знайдено технічні рішення, в яких є ряд суттєвих ознак спільних із заявленим [http://www.oie.int/vcda/eng/Registre/User%27s%20 manual_Prionics WB.pdf, Oprandy J.J. A rapid dot immunoassay for the detection of serum antibodies to Eastern equine encephalomyelitis and St. Louis encephalitis viruses in sentinel chickens / J.J. Oprandy, J.G. Olson, T.W. Scott // Am. J. Trop. Med. Hyg. - 1988. -V. 38 (1). - P. 181-186], а саме: відбір зразків і гомогенізація, нанесення зразків на мембрану, імунологічна детекція. Однак, даних суттєвих ознак не достатньо для одержання технічного результату заявленого рішення. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю співпадали з ознаками заявленого способу детекції вмісту фізіологічного пріона не знайдено. В джерелах патентної і науково-технічної інформації не знайдено відомостей про методи детекції вмісту фізіологічного пріона, а також відомостей щодо використання методу дот-блотингу для детекції вмісту фізіологічного пріона. Корисна модель може бути використана в діагностичних установах та референс-центрах обладнаних необхідною лабораторією. Для реалізації заявленої корисної моделі необхідно: 1. Розморожену чи щойно відібрану тканину злізувати у десятикратному об'ємі буферу для лізування, рН 7,4 (10% N-лаурилсаркозин, 10мкМ фенілметилсульфонілфторид, 10мкМ Nетилмалеїмід в 0,01М Na-фосфатному буфері, 0,001% коктейль інгібіторів протеїназ - Sigma, ФРН). Далі відцентрифугувати зразки при 5200g протягом 5хв. при 4°С. Виміряти концентрацію білка у лізатах методом Лоурі (набір для визначення Сімко, Україна). Для вирівнювання об'ємів та концентрацій загального білка розвести зразки буфером для розведення зразків, рН 7,4 (25 мМ Тріс-НСl, 150 мМ NaCl, 2,5 мМ КСl). 2. На нітроцелюлозну мембрану (Мilliроrе) нанести лізат об'ємом 2мкл із однаковим загальним вмістом білка. Для виявлення фонового свічення на мембрану нанести буфер для лізування та буфер для розведення зразків. 3. Блокувати мембрану протягом 1год. в 5% розчині альбуміну. Після нанесення контрольних та дослідних зразків інкубувати мембрану з моноклональними анти-PrP антитілами 6Н4 (Prionics, Швейцарія) - 1:2000 у ЗФРТ 90хв., та поліклональними козячими анти-мишачими антитілами, кон'ю 56820 4 гованими з лужною фосфатазою (Sigma, США) 1:5000 у забуферний фізіологічний розчин з твіном (ЗФРТ) 30 хв. Здійснити детекцію імунних комплексів з використанням комерційного розчину субстрату для лужної фосфатази - CDP-Star (Tropix, Велика Британія). Провести візуалізацію за допомогою рентгенівської плівки ECL HyperFilm (Amersham, США) та набору для проявки плівок (Kodak). Оцифрування вмісту фізіологічного пріона здійснюється за допомогою програми GelPro Ver. 1.5 та виражається в умовних одиницях (1 ум.од=1 піксель на кв. дюйм). Приклади конкретного виконання. Для тестування ефективності використання методу дот-блоту для визначення вмісту фізіологічного пріона нами було проведено дослідження вмісту цього білка у зразках відібраних із різних органів лабораторних щурів за дії пріонінгібуючого препарату пентосан полісульфат. (Фіг.) Дослідження проводили у 4-ох групах зразків селезінки, тонкого кишківника та скелетних м'язів: 1. Контрольній; 2. Першій дослідній - препарат вводили у дозі 0,1мг/кг/день; 3. Другій дослідній - препарат вводили у дозі 0,5мг/кг/день; 4. Третій дослідній - препарат вводили у дозі 1мг/кг/день. Проведені дослідження показали, що метод дот-блот аналізу дозволяє детектувати зміни у вмісті фізіологічного пріона за дії інгібуючого чинника (пентосан полісульфату). Так, було показано, що препарат застосований у дозах 0,1; 0,5 і 1мг/кг/день спричиняє різке зниження вмісту фізіологічного пріона у селезінці, тонкому кишківнику та скелетних м'язах щурів порівняно із контрольним вмістом. Як показав аналіз діаграм, що були зроблені на основі результатів дот-блоту найвищий інгібувальний ефект спостерігався у тонкому кишківнику. У той же час, в інших органах, попри значне зниження вмісту фізіологічного пріона, дозозалежний ефект не був настільки чітко виражений. Загалом, метод дозволив встановити, що у скелетних м'язах введення пентосан полісульфату знижувало вміст фізіологічного пріона до 60-80% (р