Спосіб одержання екстракту, збагаченого n-метилпіридинієм (nmp)

Реферат: Винахід належить до способу одержання збагаченого N-метилпіридинієм (NMP) екстракту депарафінованого тригонелінвмісного органічного матеріалу зі значно зниженим вмістом С5НТ. UA 108356 C2 (12) UA 108356 C2 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується збагаченого N-метилпіридинієм (NMP) екстракту депарафінованого тригонелін-вмісного органічного матеріалу зі значно зниженим вмістом C5HT, способу його отримання, використання зазначеного збагаченого NMP екстракту депарафінованого тригонелін-вмісного органічного матеріалу як харчової добавки і до харчового продукту, що містить зазначений екстракт. Екстракти тригонелін-вмісного органічного матеріалу, такі як, наприклад, кавові напої, являють собою cкладні розчини, що містять біологічно активні сполуки, які взаємодіють зі своїм мікрооточенням у шлунку людини. Припускається, що завдяки такій взаємодії підсилюється секреція кислоти шлункового соку. Тому кілька разів повідомлялося про шлункове подразнення після вживання кави. У складному процесі секреції кислоти шлункового соку ключовим гравцем є шлункова H+,K+-АТФаза. Завдяки активації паріетальних клітин гормонами і трансмітерами вона транспортує водень у порожнину шлунка в обмін на калій і підкисляє шлунок. Паралельно у порожнину шлунка секретується хлорид. Процес у цілому регулюється завдяки рецепторам клітинної поверхні. Стимуляція секреції кислоти шлункового соку медіюється H2-гістаміновим рецептором, M3-ацетилхоліновим рецептором і холецистокініновим бета-рецептором. Зворотна регуляція відбувається шляхом активації рецептора соматостатину. Таким чином, гормони гістамін, гастрин і соматостатин, а також ацетилхолін, відіграють критичну роль у регуляції секреції кислоти. Активація рецепторів клітинної поверхні прямо пов'язана з внутрішньоклітинною трансдукцією сигналу. Було показано, що MAPK-кінази і рецепторні тирозинкінази беруть участь у регуляції секреції кислоти шлункового соку. До цього моменту активація рецептора фактора росту епітелію (EGFr) пов'язана з підвищеним секреторним статусом паріетальних клітин. Наступна передача сигналів активує Akt1 і ERK1/2 MAPK-кінази. Передача сигналів Akt1 активує транскрипцію H+,K+-АТФази, а також підсилює секреторну активність паріетальних клітин. ERK1/2 проявляє гострий інгібувальний ефект на секреторну активність, але припускається, що його хронічна стимуляція є просекреторною. Однак, вважається, що ERK1/2 також активує експресію гена H+,K+- АТФази. Окрім цих сигнальних шляхів, після активації пов'язаного з GS-Білком H2-гістамінового рецептора утворюється циклічний АМФ. Циклічний АМФ може активувати протеїнкіназу A, яка, у свою чергу, може активувати фактор транскрипції в ядрі. Фактор транскрипції ATF-2 може брати участь у експресії H+,K+-АТФази і рецептора соматостатину 2, оскільки обидва гени містять циклічний АМФчутливий елемент. До обсмажування необроблені кавові зерна містять від приблизно 1000 до 1400 мкг/г Nалканоїл-5-гідрокситриптаміду (C5HT), а смажені кавові зерна містять від приблизно 500 до 800 мкг/г C5HT. Крім того, смажені кавові зерна, що піддані декофеїнізації, містять приблизно 50 мкг/л C5HT. Додатково, кава з кофеїном містить від приблизно 200 до 500 мкг/л C5HT, тоді як декофеїнована кава містить приблизно 50 мкг/л C5HT. Відповідно, часто повідомлялося, що вживання кави асоційоване з печією або подразненням шлунка, які обидва можуть бути індуковані підвищеною секрецією шлункової кислоти. Вплив кавових напоїв на шлункове подразнення і внутрішньошлунковий pН у людей вперше був досліджений Ehrlich et al. (Ehrlich A, Basse H, Henkel-Ernst J, Hey B, Menthe J and Lϋcker PW. Effect of differently processed coffee on gastric activity difference and intraastric p in healthy volunteers. ethods Find Exp Clin Pharmacol 20: 155-161, 2006). Після прийому перорально 150 мл кавового напою, приготованого зі звичайної або обробленої парою кави, остання індукувала значно менше подразнення слизової оболонки у здорових добровольців, ніж звичайний кавовий напій. На основі цих результатів було висунуте припущення, що продувка кави парою значно знижує у смажених кавових зернах вміст сполук, що подразнюють шлунок, і виробники кави почали маркувати продуту парою каву як "нешкідливу для шлунка" (“stomachfriendly”). Ця технологія була спочатку розроблена для видалення кофеїну і хлорогенових кислот як основних сполук, що дозволяють поліпшити сенсорні характеристики кавових напоїв. Таким чином, технічною проблемою, що лежить в основі даного винаходу, є забезпечення продукту або інших засобів запобігання або зменшення шлункових проблем, викликаних секрецією кислоти шлункового соку, який може бути використаний, наприклад, як харчова добавка. Вирішення вищевказаної технічної проблеми досягається за допомогою варіантів здійснення, охарактеризованих у формулі винаходу. Зокрема, даний винахід стосується способу отримання збагаченого N-метилпіридинієм (NMP) екстракту з тригонелін-вмісного органічного матеріалу, який включає стадії: (a) депарафінування тригонелін-вмісного органічного матеріалу; (b) обсмажування тригонелін-вмісного органічного матеріалу; (c) обробки обсмаженого тригонелін-вмісного органічного матеріалу гарячою водою для 1 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 отримання водного екстракту; і (d) додавання NMP до водного екстракту. Депарафінування тригонелін-вмісного органічного матеріалу, обсмажування тригонелінвмісного органічного матеріалу, а також екстракція гарячою водою можуть бути здійснені способами, добре відомими фахівцям. Наприклад, депарафінування на Стадії (a) може бути здійснене способами, описаними van der Stegen, 1979 (van der Stegen, The effect of dewaxing of green coffee on the coffee brew, Fd. Chem (4) 23-29, 1979). У тих випадках, коли тригонелін-вмісний органічний матеріал містить кофеїн, спосіб за даним винаходом може необов'язково додатково включати стадію декофеїнування тригонелінвмісного органічного матеріалу до і/або після стадії (a), наприклад, шляхом обробки тригонелінвмісного органічного матеріалу етилацетатом. Ця стадія може бути здійснена способами, добре відомими фахівцям. У переважному варіанті здійснення ступінь обсмажування тригонелін-вмісного органічного матеріалу після обсмажування на Стадії (b) становить щонайменше 50, більш переважно, щонайменше 80, більш переважно, щонайменше 100 поділів шкали. В іншому переважному варіанті здійснення ступінь обсмажування тригонелін-вмісного органічного матеріалу після обсмажування на Стадії (b) становить від 40 до 110 поділів шкали, більш переважно від 60 до 90 поділів шкали і ще більш переважно від 70 до 90 поділів шкали, і найбільш переважно від 70 до 80 поділів шкали. Що стосується забарвлення, то ступінь обсмажування менше 50 поділів шкали вважається темною, ступінь обсмажування приблизно 75 поділів шкали вважається середньою і ступінь обсмажування, яка рівна щонайменше 90 поділів шкали, вважається світлою. Ступінь обсмажування може бути легко визначена кваліфікованим фахівцем у даній області техніки, наприклад, за допомогою приладу для визначення забарвлення Dr. Lange-LFM 1, приладу для визначення забарвлення Dr. Lange-LK 100 або приладу для визначення забарвлення RSM 2, який виробляється фірмою Schaltex Gmb, згідно з відповідними протоколами, що надаються виробниками зазначеного пристрою. Після обсмажування на Стадії (b) вищевказаного способу, тригонелін-вмісний органічний матеріал, переважно, має вміст C5HT менше 50 мкг/г C5HT, більш переважно, менше 40 мкг/г C5HT, ще більш переважно, менше 30 мкг/г C5HT, ще більш переважно, менше 20 мкг/г C5HT, і найбільш переважно, менше 10 мкг/г C5HT. Спосіб за даним винаходом необов'язково додатково включає стадію помелу обсмаженого тригонелін-вмісного органічного матеріалу після стадії (b). У переважному варіанті здійснення даного винаходу тригонелін-вмісний органічний матеріал являє собою каву, яку розмелюють до марки, обраної з групи, що складається з тонкого, середнього і грубого помелу. Обробка гарячою водою на Стадії (c) не підлягає ніяким обмеженням. Наприклад, обробка гарячою водою на Стадії (c) може здійснюватися протягом щонайменше 30 секунд і/або вода може мати температуру щонайменше 80 °C. Спосіб за даним винаходом, необов'язково, додатково включає стадії фільтрації водного екстракту перед і/або після стадії (d). Переважно фільтрація здійснюється при кімнатній температурі з використанням комерційно доступних кавових фільтрів під дією сили тяжіння. У іншому переважному варіанті здійснення щонайменше 2,95 мг NMP/100 мл, більш переважно щонайменше 5 мг NMP/100 мл, більш переважно щонайменше 8 мг NMP/100 мл додають до водного екстракту на Стадії (d). Переважно збагачений NMP екстракт, отриманий способом за даним винаходом, містить щонайменше 23 мг/л NMP, більш переважно щонайменше 36 мг/л NMP, більш переважно щонайменше 48 мг/л NMP. Збагачений NMP екстракт, отриманий способом за даним винаходом, переважно має знижений вміст C5HT. Зокрема, збагачений NMP екстракт, отриманий способом за даним винаходом, переважно, має знижений вміст C5HT у порівнянні з тригонелін-вмісним органічним матеріалом, використовуваним як початковий матеріал у способі за даним винаходом. У переважному варіанті здійснення збагачений NMP екстракт, отриманий способом за даним винаходом, містить менше 50 мкг/лC5HT, більш переважно менше 40 мкг/л C5HT, ще більш переважно менше 30 мкг/л C5HT, ще більш переважно менше 20 мкг/л C5HT і найбільше переважно менше 10 мкг/л C5HT. У іншому переважному варіанті здійснення співвідношення NMP/C5HT×100 у збагаченому NMP екстракті, отриманому способом за даним винаходом, становить щонайменше 100, більш переважно щонайменше 120, більш переважно щонайменше 140 і найбільш переважно щонайменше 180. Термін "N-метилпіридиній", у використовуваному тут значенні, стосується N-метилпіридинію 2 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 в його йонній формі, а також у формі солі, наприклад, у вигляді його йодиду (NMPI), хлориду, гідроксиду або сульфату. Абревіатури N-MP і NMP використовуються тут синонімічно для позначення N-метилпіридинію. Термін "тригонелін-вмісний органічний матеріал", у використовуваному тут значенні, стосується будь-якого матеріалу, що зустрічається в природі і містить алкалоїд тригонелін. Загалом, тригонелін-вмісний органічний матеріал вибирають із групи, що складається з кави, зокрема, Coffea arabica, Coffea canephora, Coffea spp. і Psilanthus spp., членів Fabaceae, зокрема, Pisum sativum, Glycine max, Phaseolus vulgaris, Lens culinaris, Cicer arietinum і Trigonella foenum-graecum, членів Chenopodiaceae, зокрема Chenopodium quinoa, і членів Poaceae, зокрема, Avena sativa. У переважному варіанті здійснення тригонелін-вмісний органічний матеріал являє собою Coffea spp. У більш переважному варіанті здійснення тригонелін-вмісний органічний матеріал являє собою Coffea arabica, більш переважно Coffea arabica, provenience Columbia або Coffea arabica, provenience Brazil. У іншому переважному варіанті здійснення тригонелін-вмісний органічний матеріал являє собою Coffea canephora, також відомий як "кава робуста", більш переважно Coffea canephora, provenience Vietnam. Даний винахід додатково стосується збагаченого N-метилпіридинієм (NMP) екстракту, отриманого способом за даним винаходом. У іншому аспекті даний винахід також стосується використання зазначеного збагаченого Nметилпіридинієм (NMP) екстракту як харчової добавки. У іншому аспекті даний винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить, у терапевтично ефективній кількості, збагачений N-метилпіридинієм (NMP) екстракт за даним винаходом, необов'язково у комбінації з одним або кількома фармацевтично прийнятним ексципієнтом (ексципієнтами) і/або носієм (носіями) і/або розріджувачем (розріджувачами) і/або розчинником (розчинниками) і/або сіллю (солями) і/або буфером (буферами). Фармацевтична композиція згідно з даним винаходом може мати будь-яку придатну форму, відому фахівцям. Переважно вона являє собою тверду форму, рідку форму або форму аерозолю. Введення фармацевтичної композиції за даним винаходом може бути здійснене в будь-якій придатній формі, відомій фахівцям, наприклад, перорально, внутрішньовенно, інтрадермально, інтраперитонеально, внутрішньом'язово або шляхом інгаляції. Фармацевтична композиція за даним винаходом є придатною для запобігання або зниження секреції кислоти шлункового соку і для профілактики або ослаблення розладів і/або хвороб, пов'язаних із секрецією кислоти шлункового соку. У ще одному аспекті даний винахід стосується способу запобігання або зниження секреції кислоти шлункового соку і профілактики розладів і/або хвороб, пов'язаних із секрецією кислоти шлункового соку, причому зазначений спосіб включає введення суб'єктові збагаченого Nметилпіридинієм (NMP) екстракту за даним винаходом і/або медикаменту і/або фармацевтичної композиції за даним винаходом. Таке введення не підлягає яким-небудь особливим обмеженням і може здійснюватися в будь-якій формі, відомій фахівцям, наприклад, перорально, внутрішньовенно, інтрадермально, інтраперитонеально або внутрішньом'язово. У переважному варіанті здійснення суб'єкт є людиною. У переважному варіанті здійснення розлади і/або хвороби, пов'язані з секрецією кислоти шлункового соку, вибирають із групи, що включає гастроезофагеальну рефлюксну хворобу, раки і виразки. У більш переважних варіантах здійснення рак являє собою рак шлунка, і виразка являє собою виразку шлунка. У іншому аспекті даний винахід стосується харчового продукту, збагаченого Nметилпіридинієм (NMP) шляхом додавання зазначеного збагаченого NMP екстракту за даним винаходом. Термін "харчовий продукт", у використовуваному тут значенні, стосується будь-якої речовини, яка може бути з'їденою або випитою твариною або людиною, наприклад, як їжа і/або для задоволення. У особливо переважному варіанті здійснення харчовий продукт являє собою каву. Переважно, збагачений NMP екстракт тригонелін-вмісного органічного матеріалу, отриманий способом за даним винаходом, поєднує високий вміст NMP з низьким вмістом C5HT. Завдяки депарафінуванню тригонелін-вмісного органічного матеріалу вміст NMP в екстракті зберігається, а вміст C5HT знижується. Відповідно, збагачений NMP екстракт за даним винаходом має особливо переважне співвідношення NMP/C5HT. Внаслідок цього антисекреторний ефект NMP стосовно кислоти шлункового соку пролонгується в часі після вживання збагаченого NMP екстракту за даним винаходом шляхом мінімізації вмісту C5HT. На фігурах зображено: 3 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 1: Внутрішньоклітинний протонний індекс (IPX) клітин HGT-1, оброблених протягом 10 хвилин гістаміном (HIS, 1 ммоль/л) або однією з фракцій розчинника, приготованого з кавового напою, у концентраціях, що відповідають кількісному виходу: вода (H 2O: 2,14 мг/мл), етилацетат (EtAc: 0,16 мг/мл), дихлорметан (CH2CI2:0,18 мг/мл) і пентан: 0,005 мг/мл). Розподіл кількісно визначуваних сполук за фракціями розчинника наведено в таблиці нижче (Статистика: *** двосторонній t-критерій vs. контрольні клітини, = p.0.001, n=9). Фігура 2: Внутрішньоклітинний протонний індекс (IPX) клітин HGT-1, оброблених протягом 10 хвилин різними концентраціями N-метилпіридинію у вигляді окремої сполуки (N-MP) або в комбінації з ліофілізатом, отриманим зі звичайної кави (Кава + N-MP), при такій самій концентрації N-метилпіридинію в системі, як і при його використанні у вигляді окремої сполуки (Статистика: односторонній дисперсійний аналіз (ANOVA) з додатковим тестом Холма-Сідака * (Holm-Sidak), = p.0.05, n=9). Фігура 3: Внутрішньоклітинний протонний індекс (IPX, час впливу: 10 хв., A) і вміст циклічного АМФ (cAMP, час впливу: 0,5 хв, B) для клітин HGT-1, оброблених гістаміном (HIS: 1 ммоль/л) або ліофілізатами (2,5 мг/мл), приготованими з C. Arabica Brazil (Кава A), обробленої парою C. Arabica Brazil (Кава AT), C. Robusta Vietnam (кава R) або оброблена парою C. Robusta Vietnam (кава RT) з високою (кава A, AT), середньою (кава R) і низькою (кава RT) концентраціями N-метилпіридинію відповідно (Статистика: двосторонній t-критерій vs. ** *** контрольні клітини, = p.0.01, = p.0.001, n=9; або vs. кава RT ## = p.0.01, ### = p.0.001). Фігура 4: Індекси активації шляхів EGFr, ERK1/2, Akt1 і ATF-2 у клітинах HGT-1, оброблених протягом 10 хв гістаміном (HIS: 1 ммоль/л) або ліофілізатами (2,5 мг/мл) приготованими з C. Arabica Brazil (Кава A), обробленої парою C. Arabica Brazil (Кава AT), C. Robusta Vietnam (кава R) або оброблена парою C. Robusta Vietnam (кава RT) з високою (кава A, AT), середньою (кава R) і низькою (кава RT) концентраціями N-метилпіридинію відповідно. (Статистика: двосторонній ** *** t-критерій vs. контрольні клітини, = p.0.01, = p.0.001, n=9; або vs. кава RT ## = p.0.01, ### = p.0.001). Фігура 5: Залежні від часу індекси експресії генів H+,K+-АТФази (ATP4A), H2-гістамінового рецептора (HRH2), ацетилхолінового рецептора M3 (CHRM3) і рецептора соматостатину (SSTR2) у клітинах HGT-1 після впливу ліофілізатів (2,5 мг/л), приготованих із C. Robusta Vietnam (кава R) або обробленої парою C. Robusta Vietnam (кава RT) з середньою (кава R) і низькою (кава RT) концентраціями N-метилпіридинію відповідно (Статистика: односторонній * ** дисперсійний аналіз із додатковим тестом Холма-Сідака, = p.0.05, = p.0.01, n=6; p-значення для одностороннього дисперсійного аналізу зазначено на графіку, у таблицях нижче наводяться значимі зміни тимчасової залежності в порівнянні з найбільш вираженою зміною експресії, визначеною шляхом проведення додаткового аналізу). Фігура 6: Залежні від часу індекси експресії генів H+,K+-АТФази (ATP4A), H2-гістамінового рецептора (HRH2), ацетилхолінового рецептора M3 (CHRM3) і рецептора соматостатину (SSTR2) у клітинах HGT-1 після впливу ліофілізатів (2,5 мг/л), приготованих із C. Arabica Brazil (кава A) або обробленої парою C. Arabica Brazil (кава AT) з високими концентраціями Nметилпіридинію (Статистика: односторонній дисперсійний аналіз із додатковим тестом Холма* ** Сідака, = p.0.05, = p.0.01, n=6; p-значення для одностороннього дисперсійного аналізу зазначено на графіку, у таблицях нижче наводяться значимі зміни тимчасової залежності в порівнянні з найбільш вираженою зміною експресії, визначеною шляхом проведення додаткового аналізу). Фігура 7: Вплив окремо взятої сполуки і комбінації сполук на експресію гена H+,K+-АТФази (ATP4A) і H2-гістамінового рецептора (HRH2). A: Було визначено, що хлорогенова кислота (CA) і кофеїн (CAFF) через 20 хвилин здійснюють підвищувальну регуляцію експресії ATP4A. На відміну від цього, пірогалол (PYR) і N-метилпіридиній (N-MP) здійснюють понижувальну регуляцію експресії після 20 хвилин. (Статистика: односторонній дисперсійний аналіз із додатковим тестом). B: Комбінація CA, CAFF або обох із N-NMP призводила до значної компенсації підвищувальної регуляції CAFF або CA (Статистика: t-критерій для CS або CF vs. комбінація з N-MP або PYR). C: N-алканоїл-гідрокситриптаміди (C5HT) здійснюють надзвичайно сильну понижувальну регуляцію HRH2 після п'яти хвилин. Катехін (CAT) також викликає понижувальну регуляцію. CA підвищуючи регулює HRH2 після 20 хвилин. (Статистика: односторонній дисперсійний аналіз із додатковим тестом). D: Комбінація CA з C5HT призводить до значного збільшення експресії HRH2 (p.0.001) у порівнянні з контрольними клітинами. CA у комбінації з CAT не впливають на експресію HRH2 в порівнянні з окремо взятим CAT * ** *** (Статистика: t-критерій для оброблених клітин vs. контрольних клітин). ( = p.0.05, = p.0.01, = p.0.001, n=5-9;) Фігура 8: Вплив окремо взятої сполуки і комбінації сполук на експресію гена 4 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ацетилхолінового рецептора M3 (CHRM3) і рецептора соматостатину 2 (SSTR2). A: Експресія CHRM3 значно підсилюється пірогалолом (PYR) і, у меншій мірі, кофеїном (CAFF) і Nметилпіридинієм (N-MP). N-MP через 20 хвилин, а також PYR через 15 хвилин викликають наступну понижувальну регуляцію. (Статистика: односторонній дисперсійний аналіз із додатковим тестом). B: Рецептор соматостатину 2 піддається надзвичайно сильній понижувальній регуляції N-алканоїл-гідрокситриптамідами (C5HT) і незначній – катехіном (CAT). N-MP підвищуючи регулює цей антисекреторний рецептор більше, ніж удвічі, з наступною понижувальною регуляцією. (Статистика: односторонній дисперсійний аналіз із додатковим тестом). C: Комбінований ефект N-MP і C5HT після п'яти хвилин призводить до повної компенсації ефектів кожної сполуки окремо (Статистика: t-критерій для N-MP/C5HT vs.N-MP або * ** *** C5HT). ( = p.0.05, = p.0.01, = p.0.001, n=5-9;) Фігура 9: Вплив повної рекомбінації всіх сполук на експресію гена H2-гістамінового рецептора (HRH2), ацетилхолінового рецептора M3 (CHRM3), рецептора соматостатину 2 (SSTR2) і H+,K+-АТФази (ATP4A). Також представлена активація трансдукції сигналу кіназ і фактора транскрипції ATF-2, а також концентрації циклічного АМФ. A: HRH2 піддається сильній підвищувальній регуляції за допомогою суміші всіх сполук через 10 хвилин. CHRM3 і SSTR2 піддається понижувальній регуляції з мінімумом через 20 хвилин. ATP4A регулюється в меншій мірі, ніж рецептори, але все-таки значно через 5 і 10 хвилин. (Статистика: односторонній дисперсійний аналіз із додатковим тестом). B: EGFr у значній мірі активується сумішшю всіх сполук, а також Akt1 і фактора транскрипції ATF-2. На відміну від цього, було показано, що статус фосфорилювання ERK1/2 був нижчим за контрольні рівні (t-критерій для оброблених клітин vs. необроблені клітини (CTR)). C: Концентрації циклічного АМФ зростають удвічі після обробки сумішшю сполук протягом однієї хвилини (t-критерій для оброблених клітин vs. * ** *** необроблені клітини (CTR)). ( = p.0.05, = p.0.01, = p.0.001, n=3-9;) Фігура 10: Вплив окремо взятих сполук на концентрації циклічного АМФ, активацію кіназ і фактора транскрипції ATF-2. A: Гістамін (HIS), кофеїн (CAFF), катехін (CAT), пірогалол (PYR), Nалканоїл-гідрокситриптаміди (C5HT) і N-метилпіридиній (N-MP) значно підвищують концентрації циклічного АМФ у порівнянні з контрольними клітинами (CTR). Хлорогенова кислота (CA) викликає значне зниження концентрації циклічного АМФ. B: Рецептор епідермального фактора росту (EGFr) у значній мірі активується HIS, CA, CAFF і C5HT, але не PYR, CAT і N-MP. Тільки Akt1 кіназа значно активувалася шляхом обробки CAFF, PYR, CAT, C5HT і N-MP. Передача сигналів ERK1/2 підсилюється тільки внаслідок обробки N-MP. C: Сполучний білок чутливого елемента циклічного АМФ, відомий як фактор транскрипції ATF-2, у значній мірі активується HIS, CAT і N-MP. CAFF викликає стан активації нижче контрольних рівнів. (Статистика: t* ** *** критерій для оброблених клітин vs. необроблені клітини (CTR), = p.0.05, = p.0.01, = p.0.001, n=3-7) Фігура 11: Вимірювання секреторної активності за внутрішньоклітинним протонним індексом (IPX). A: Обробка клітин HGT-1 гістаміном (HIS), кофеїном (CAFF), пірогалолом (PYR), катехіном (CAT) або C5HT призводить до посилення секреції, на що вказує негативне значення IPX. На відміну від цього, хлорогенова кислота (CA), N-метилпіридиній (N-MP) і тригонелін (TRI) викликають зниження секреції протонів, на що вказує позитивне значення IPX. Статистика: односторонній дисперсійний аналіз, p=0,01.0,001; n=10-12). B: Обробка клітин HGT-1 хлорогеновою кислотою (CA) підсилює струм, у той час як рекомбінація всіх сполук (Mix) призводить до зниження IPX. (Статистика: t-критерій для оброблених клітин vs. необроблені ** *** клітини, = p=0.05, = p=0.001, n=3-7) Фігура 12: Вимірювання секреторної активності в камері Уссінга. A: Обробка гістаміном (HIS) підсилювала струм після апікального застосування. Підвищений струм потім зменшували шляхом апікального застосування омепразолу (OMP), специфічного інгібітора H+,K+-АТФази. B: Апікальне застосування хлорогенової кислоти (CA) викликає зниження струму, що вказує на знижену секреторну активність, як в (A). C: Апікальне застосування кофеїну (CAFF) збільшує струм. Після базального застосування N-метилпіридинію (N-MP) струм знову зменшувався, що вказує на інгібувальний ефект N-MP. D: Базальне застосування одного лише N-MP викликає незначне зниження струму. E: Апікальне додавання катехіну (CAT) підсилювало струм, але максимум піку не досягався в місці застосування, вказуючи на вповільнену відповідь паріетальних клітин на CAT. F: Апікальне додавання C5HT сильно збільшувало струм у місці застосування, однак величина IPX була недостатньою для значимості (p=0.07, див. A). G: Пірогалол (PYR) викликав падіння струму після апікального застосування, що вказує на зниження секреції. H: Базальне застосування тригонеліну (TRl) викликає сильне зниження струму, вказуючи на антисекреторний потенціал. Фігура 13: Рекомбінаційні ефекти досліджуваних сполук. З повної рекомбінації всіх 5 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 досліджуваних сполук (Mix) виключають N-метилпіридиній (N-MP), хлорогенову кислоту (CA), кофеїн (CAFF), катехін (CAT), C5HT або пірогалол (PYR) для виявлення синергічних ефектів кожної сполуки. (Статистика: односторонній або двосторонній t-критерій для суміші без сполуки ** *** vs. суміш, = p=0.01, = p=0.001, n=9) + Фігура 14: Аналіз методом ВЕРХ-МС/МС (ESI ) (з іонізацією електророзпилюванням) фільтрованих напоїв зі смаженої кави. Крім C5HT, N-метилпіридиній визначають у тому ж напої методом аналізу з розчиненням стабільного ізотопу, що був успішно використаний у попередніх дослідженнях. Дані наведені на Фіг. 15. Фігура 15: Узагальнення зібраних даних, що стосуються алканоїл-5-гідрокситриптамідів (нижня панель, мкг/л, сума похідних) і N-метилпіридинію (верхня панель, мг/л). 50, 80, 110 означають ступінь обсмажування в поділах шкали. 1) "необроблений Co 5", 2) "необроблений ** Co 2", 3) "декофеїнований 2+2", 4) "депарафінований Co 5", 5) " депарафінований Co 2 " Фігура 16: Порівняння проаналізованих зразків кави на основі співвідношення NMP/C5HT (фактор = NMP/C5HTx100). 50, 80, 110 означають ступінь обсмажування в поділах шкали. Зразки кави з попередніх досліджень наведені для порівняння. 1) "необроблений Co 5", 2) "необроблений Co 2", 3) "декофеїнований 2+2", 4) "депарафінований Co 5", 5) ** "депарафінований Co 2 " Фігура 17: Порівняння секреторного потенціалу зразків кави, збагачених N-MP. Зазначений внутрішньоклітинний протонний індекс (IPX). Найбільш ефективні концентрації Nметилпіридинію (у ресуспендованому ліофілізаті) зазначені над фігурою (статистика: *** двосторонній t-критерій, = p < 0.001, $ = p < 0.05, $$ = p < 0.01, $$$ = p < 0.001). Фігура 18: Вплив тригонеліну на секреторну активність (статистика: двосторонній t-критерій, *** = p < 0.001). Фігура 19: Залежність доза-ефект для тригонеліну (статистика: односторонній дисперсійний * аналіз; = p < 0.05, $ = p < 0.05, $$ = p < 0.01, $$$ = p 99 %). Наступні експерименти продемонстрували, що клітини HGT-1, що оброблені звичайною кавою з підвищеним вмістом N-MP у концентрації приблизно 20 мг/мл N-MP, показують значне зниження PSA у порівнянні з клітинами, які були піддані впливу ліофілізатами кавового напою, що містить більш високі (32-34 мг/л) або низькі (5 мг/л) концентрації N-MP. Ці результати були підтверджені шляхом проведення аналізів метаболічних шляхів факторів транскрипції (ATF-1, Akt1) і передачі сигналів (cAMP, EGFr), кінази (ERK1/2) і за допомогою експериментів з експресії гена про- (гістамін-HRH2, ацетилхолін-CHRM3) і анти- (соматостатинSSTR1) секреторних рецепторів і H+,K+-АТФази. Підготовка зразків. Для фракціонування розчинника зважують 54 г гомогенного матеріалу порошку меленої смаженої кави (звичайна ринкова кавова суміш, не оброблена парою і не декофеїнована) на паперовому фільтрі, зазвичай використовуваному для домашнього приготування кавового напою (Melitta Gold, Nr. 4, Aldi, Germany). Порції водопровідної води, яка щойно закипіла (T 90-95 °C, приблизно 100 мл кожна), виливають на порошок і гарячий фільтрат збирають у мірну колбу на 1000 мл. Точно 500 мл розчину кави переносять у кристалізатори, негайно заморожують (-20 °C) і нарешті висушують ліофілізацією (48 год., 0,77 6 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 мбар, 25 °C). Другу частину кавового напою (500 мл) переносять у ділильну лійку і водну фазу почергово екстрагують пентаном (4×500 мл), дихлорметаном (4×500 мл) і етилацетатом (4×500 мл), причому залишається залишок водної фази. Усі отримані фракції концентрують під вакуумом, розводять у воді, заморожують (-20 °C) і ліофілізують (48 год., 0,77 мбар, 25 °C). Вихід визначають гравіметрично. Фракції розчинника використовують потім для функціональних аналізів секреторної активності шлункових паріетальних клітин людини в концентраціях, що відповідають їхньому відповідному виходу. Дослідження клітинних механізмів регуляції кислоти шлункового соку проводили із двома зразками C. Arabica Brazil (кава A) і двома - C. Robusta Vietnam (кава R). Один зразок кожного сорту кави являв собою звичайну каву, не оброблену парою і не декофеїновану, а інший парний зразок був підданий обробці парою (кава AT, кава RT), відповідно до практики виробника, для видалення речовин, які, як припускається, подразнюють шлунок. Усі зразки кави були типовими торговими продуктами і були надані місцевим виробником кави. Якщо коротко, необсмажені кавові зерна піддають екстракції гарячою водяною парою під тиском від 19 до 22 psi (131-152 кПа) протягом 10-30 хвилин. Після цього залишкову вологу випаровують нагріванням зерен до 130-150 °C. Нарешті, водяну пару, що випарувалася, випускають із апарата, а вихідний вологовміст необсмажених кавових зерен відновлюють у розрідженій атмосфері. Із усіх цих чотирьох зразків кави (A, AT, R і RT) готують напої за стандартним рецептом, типово використовуваним для домашнього приготування. Клітинна культура. Паріетальні клітини карциноми людини (HGT-1) були надані Dr. C.Laboisse (Laboratory of Pathological Anatomy, Nantes France) і культивувалися при 37 °C і 5 % CO2. Модифіковане за Дульбекко середовище Ігла (DMEM, PAA, Coelbe, Germany) з глюкозою (4 %, PAA, Coelbe, Germany) використовують як культуральне середовище з добавками 20 % фетальної телячої сироватки (PAA, Coelbe, Germany), 2 % L-глутаміну (PAA, Coelbe, Germany), 2 % пеніциліну-стрептоміцину (PAA, Coelbe, Germany) і 2 % буферу HEPES (4-4-(2гідроксиетил)-1-піперазинетансульфонова кислота) (PAA, Coelbe, Germany). Перед кожним експериментом клітини культивують протягом 5 днів і синхронізують із DMEM без добавки фетальної телячої сироватки. Виділення РНК і синтез кДНК. Висівають 100000 клітин у шестилункові планшети. Після обробки зразка клітини збирають для аналізу повної РНК, що виділяють за допомогою набору RNeasy Midi Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Гідроліз ДНКази I проводять на колонці за допомогою набору RNase free DNase Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Перед кількісною ПЛР (qPCR), загальний вміст РНК кількісно визначають фотометрично при 260 нм. кДНК синтезують із використанням набору cDNA High Capacity Synthesis Kit (Applied Biosystems, Munich, Germany), як описано в інструкції виробника. Аналізи генної експресії. Аналізи генної експресії проводять після обробки клітин зразком протягом 5, 10, 15 або 20 хв. Праймери для альфа-субодиниці H+,K+-АТФази (ATP4A), H2гістамінового рецептора (HRH2), рецептора соматостатину (SSTR2) і ацетилхолінового рецептора M3 (CHRM3) були сконструйовані за допомогою Beacon Designer 7.0 (PremierBiosoft, Palo Alto, CA) та перевірені стандартними аналізами і за кривою плавлення, як описано в літературі. Точність послідовності продуктів ПЛР перевіряли методом секвенування (Medigenomics, Martinsried, Germany, дані не наведені). Аналізи методом ПЛР у реальному часі проводили за допомогою термоциклера Mx3000p cycler (Stratagene, Amsterdam, Netherlands) з використанням набору Brilliant SYBR Green Kit (Stratagene, Amsterdam, Netherlands). Умови термоциклування: 10:00 хв/95 °C (активація), 00:30 с/95 °C (денатурація), 00:30 с/60 °C (відпал із вимірюванням флуоресценції), 00:30 с/72 °C (подовження ланцюга). Кількісне визначення циклічного АМФ. У цілому 50000 клітин висівають на 24-лункові планшети і обробляють відповідним зразком протягом 0,5 хвилин. Для визначення циклічного АМФ у клітинних супернатантах ми використовували набір для конкурентного визначення циклічного АМФ ELISA parameter kit (R&D Systems, Minneapolis, MN), як описано в протоколі виробника. Супернатанти виділяють після 1 хвилини інкубації. Аналіз трансдукції сигналу. Стан фосфорилювання рецептора тирозинкінази і MAPK кінази детектують методом твердофазових імуноферментних аналізів. Виділяють загальний білок із клітин HGT-1 після інкубації з досліджуваними марками кави протягом 10 хв. відповідно до рекомендацій протоколу виробника. Загальний вміст білка кількісно визначають фотометрично за допомогою реагенту Бредфорда (Bradford) (Bio-Rad, Munich). Для визначення стану фосфорилювання використовують наступні набори ELISA: EGFr-ELISA, ERK1/2 ELISA (обидва Calbiochem/Merck, Nottingham, UK), Akt1 pathscan ELISA і ATF-2 pathscan ELISA (обидва Cell Signaling/New England Biolabs, Frankfurt a. M., Germany). Поглинання зчитують при 450 нм за допомогою планшет-рідера MRX (Dynex, Berlin, Germany) або планшет-рідера Varioscan Flash 7 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (Thermo Electron Cooperation, Walthman, Ml) з додатковим зчитуванням довжини хвилі еталона при 620 нм, якщо це зазначено в протоколі виробника. Секреторна активність. Для кожного біологічного незалежного експерименту використовують об'єм суспензії клітин, рівний 2 мл, що відповідає 2000000 клітин, і обробляють протягом 10 хвилин 2,5 мг ліофілізатом кавового напою (54 г/1,1 л гарячої води) на мл PBS, гістаміном (1 ммоль в PBS (фосфатно-сольовий буфер)) або різними фракціями розчинника при 37 °C. Секреторну активність вимірюють шляхом визначення внутрішньоклітинного протонного індексу (IPX). Для вимірювання внутрішньоклітинного pН використовують флуоресцентний барвник Carboxy-SNARF-AM (Invitrogen, Karlsruhe, Germany). Спосіб атестують, як описано в літературі, і гістамін (1 ммоль/л) використовують як добре вивчену еталонну сполуку, яка стимулює секрецію шлункової кислоти. Якщо коротко, клітини HGT-1 насичують 3 мкМ барвника протягом 30 хвилин на льоду. Внутрішньоклітинний pН розраховують за калібрувальною кривою для оброблених 2 мкМ нігерицину (PAA, Coelbe, Germany) клітин HGT-1 у буфері K+clamp, який містить 20 мМ NaCI, 110 мМ KCI, 1 мМ CaCI2, 1 мМ MgSO4, 18 мМ D-Глюкози і 20 мМ HEPES і який налаштовують на різні калібрувальні точки pН (6,8-8,2) шляхом титрування NaOH. Потім розраховують внутрішньоклітинний протонний індекс (IPX) шляхом log2-перетворення співвідношення концентрацій внутрішньоклітинних протонів для оброблених клітин і контрольних клітин. Чим вище значення IPX, тим більше протонів залишається в клітині, що вказує на більш низьку секреторну активність, у той час як більш низькі значення IPX указують на більш високу секрецію протонів. Статистичний аналіз. Статистичний аналіз проводять за допомогою Excel 2003 або SigmaStat (Systat Software Gmb, Erkrath, Germany). Набори даних, отримані при проведенні qPCR (кількісної ПЛР) і ELlSA, трансформують шляхом логарифмічного перетворення для отримання нормального розподілу і представляють на фігурах проіндексованими за log2 співвідношеннями. Окремі порівняння між обробленими і контрольними клітинами виконують за допомогою двостороннього t-критерію Стьюдента для однакових дисперсій. Для аналізу експресії генів у часі ми проводили односторонній дисперсійний аналіз із додатковим аналізом за Холмом-Сідаком для параметричних наборів даних і тест Крускала-Уолліса (Kruskal-Wallis) із додатковим аналізом за Данном для непараметричних наборів даних. Число повторів для кожного експерименту вказується в результатах, але становило не менше n=3. На кожному графіку планки похибок відповідають стандартній помилці (SE). Секреторна активність фракцій розчинника, приготованого зі звичайної кави. Використовують наступний підхід для оцінки секреторної активності кавових напоїв відносно кислоти шлункового соку в клітинах раку шлунка у людини (HGT-1). Клітини, оброблені ліофілізованими кавовими напоями, приготованими з декофеїнованої і/або обробленої парою кави, демонструють знижену секреторну активність у порівнянні з клітинами, обробленими ліофілізатами, приготованими зі звичайної кави. У цій моделі аналізують внутрішньоклітинний pН як індикатор секреції протонів методом проточної цитометрії з використанням pН-чутливого барвника SNARF-AM. Дані розраховують як показник внутрішньоклітинного pН (IPX) на основі гіпотези про те, що внутрішньоклітинна концентрація H+ знижується внаслідок секреції протонів. Чим вище значення IPX, тим більше протонів залишається в клітині, що вказує на більш низьку секреторну активність, у той час як більш низькі значення IPX указують на більш високу секрецію протонів. Нарешті, значення IPX піддають log2-перетворенню для стабілізації дисперсії. У представленій тут роботі обробка клітин HGT-1 фізіологічним стимулятором гістаміном призводить до стимуляції секреторної активності, на що вказує значне зниження IPX (-0,41±0,04; p.0.001) у порівнянні з необробленими контрольними клітинами (Фіг. 1). Клітини, оброблені такими фракціями, екстрагованими зі звичайної торгової кавової суміші, етилацетатом, дихлорметаном і пентаном, реагували аналогічно, зі значеннями IPX, рівними 0,43±0,6, -0,20±0.03 і -0,34±0.04 відповідно (двосторонній t-критерій, p.0.001 vs. необроблені контрольні клітини для кожної фракції; Фіг. 1). На відміну від цього, клітини, оброблені водним екстрактом, демонструють значно знижену секреторну активність у порівнянні з контрольними клітинами, на що вказують позитивні значення IPX+0.07±0.03 (двосторонній t-критерій, p.0.05; Фіг. 1). Беручи до уваги розподіл кількісно обумовлених сполук між фракціями розчинника, фракція пентану містила тільки одну з них: кофеїн, приблизно 1 % від загальної кількості, визначений у всіх фракціях. Несподівано, більша частина кількісно обумовлених сполук була розподілена між водною, етилацетатною і дихлорметановою фракціями, у той час як катехін і пірогалол переважно екстрагувалися етилацетатом, а кофеїн переважно збирався в дихлорметановому екстракті. Однак, водний екстракт, який продемонстрував антисекреторну активність у функціональному аналізі, містив більшу частину хлорогенової кислоти та βN-алканоїл-5-гідрокситриптамідів і був 8 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 єдиним екстрактом, що містить більше 99 % від загальної кількості обумовленого Nметилпіридинію (Фіг. 1). Секреторна активність ліофілізатов звичайної кави після додавання N-метилпіридинію. Оскільки результати експериментів із фракціями розчинника, виділеними зі звичайної торговельної кавової суміші з підвищеним вмістом водорозчинних сполук, і, зокрема, Nметилпіридинію, що кількісно визначався тільки у водному екстракті, дозволяють припустити, що кава спричиняє антисекреторний ефект, то остання була досліджена на секреторну активність у клітинах HGT-1 N-метилпіридинію як окремої сполуки, а також ліофілізату, приготованого зі звичайної кави, в яку був доданий N-метилпіридиній. Кількісне визначення Nметилпіридинію в каві A показало його концентрацію, рівну 6,32 мг/л (Фіг. 2). Збагачення ліофілізату напою проводять шляхом додавання різних кількостей для досягнення 2-кратного (12,64 мг/л), 3-кратного (18,96 мг/л), 5-кратного (31,60 мг/л) і 10-кратного (63,20 мг/л) збільшення в порівнянні з незбагаченим ліофілізатом. Як зображено на Фіг. 2, обробка клітин HGT-1 ліофілізатом незбагаченої кави чинила стимулюючий вплив на секреторну активність з величиною IPX, рівною -0,17±0.03 (двосторонній t-критерій, p.0.001 vs. необроблені контрольні клітини), у той час як у клітинах, оброблених ліофілізатами з подвоєним і потроєним вмістом Nметилпіридинію, аналізи показали значно більш низьку секреторну активність (-0,10±0.04 і -3.4617±0.01 відповідно, двосторонній t-критерій, p.0.01 vs. необроблені контрольні клітини для обох зразків). Ліофілізат, що містить збільшену в 3 рази концентрацію N-метилпіридинію в порівнянні з незбагаченим ліофілізатом, насправді практично не чинив ніякого впливу, оскільки клітини, оброблені цим зразком, демонстрували таку ж величину IPX, як і необроблені контрольні клітини. Однак, при збільшенні кількості N-метилпіридинію до 10-кратної (63,2 мг/л), секреторна активність кави A є практично такою ж, як визначена для незбагаченого ліофілізату (односторонній дисперсійний аналіз, p.0.05; Фіг. 2). У тих випадках, коли клітини HGT-1 були оброблені N-метилпіридинієм як окремо взятою сполукою, ніякого доза-залежного ефекту не спостерігалося (Фіг. 2). Ці результати чітко демонструють, що N-метилпіридиній у кавовому напої діє як антисекреторна сполука, але не як окремо взята речовина. Секреторна активність ліофілізатів, приготованих зі стандартизованих кавових напоїв з різним вмістом N-метилпіридинію, і їх вплив на утворення циклічного АМФ. Оскільки експерименти зі збагаченими N-метилпіридинієм ліофілізатами, приготованими з кави A, дозволяють припустити, що антисекреторний ефект кавових напоїв, які мають 3-кратну в порівнянні з незбагаченими ліофілізатами концентрацію N-метилпіридинію, були приготовані три додаткові зразки кави з визначеним вмістом N-метилпіридинію. По-перше, зразок, еквівалентний каві A, який складається з тієї ж кави, але слабко оброблений парою (кава AT) таким чином, щоб вміст N-метилпіридинію не змінювалася (Таблиця 1). Для другого набору зразків були приготовлені C. Robusta Vietnam(кава R) і C. Robusta Vietnam - оброблена парою (кава RT). Кількісне визначення N-метилпіридинію в цих двох зразках показало "середньовисоку" і "низьку" концентрації, 22,4 мг/л і 5,41 мг/л відповідно (Таблиця 1). Таким чином, кава R мала концентрацію N-метилпіридинію, порівняну з кавою A, збагаченою до 18,96 мг/л. Аналіз IPX у клітинах HGT-1 після обробки ліофілізатами, приготованими з кави A (0,43±0.05), AT (-0,49±0.02) і R (-0,35±0.07), продемонстрував їх значно більш низьку секреторну активність у порівнянні з кавою RT (-0,60±0.02) (Фіг. 3A). Таким чином, "висока" і "середньовисока" концентрації N-метилпіридинію, кількісно визначені в каві A/AT і R відповідно, очевидно, асоційовані з більш низьким секреторним потенціалом у порівнянні з кавою RT, що має найменшу концентрацію N-метилпіридинію, кількісно визначену для цих зразків кави. Стимуляція секреції кислоти шлункового соку пов'язана з підвищеними рівнями циклічного АМФ у паріетальних клітинах, оскільки передача сигналів гастринових і гістамінових рецепторів збільшує синтез циклічного АМФ аденілатциклазою внаслідок активації G-білка. У даних дослідженнях клітини HGT-1, оброблені гістаміном, стимулюють секреторну активність у значній мірі, до величини IPX, рівної -0,97±0,02, у порівнянні з необробленими контрольними клітинами. Відповідно до цього результату, концентрація циклічного АМФ також збільшувалася до 7,76±0,69 пмоль/мл від базового рівня, рівного 6,02±0,36 пмоль/мл, у необроблених контрольних клітинах (двосторонній t-критерій, p < 0.05; Фіг. 3A і B). Відповідно до результатів аналізу секреторної активності, концентрація циклічного АМФ після обробки HGT-1 (HGT-Vs) в каві RT (19,69±0,41 пмоль/мл) була значно вищою (двосторонній t-критерій, p < 0.05) у порівнянні з контрольними клітинами і з концентраціями циклічного АМФ після обробки кави A (8,83±0,69 пмоль/мл), кави AT (10,76±0,38 пмоль/мл) або кави R (14,98±0,89 пмоль/мл) (Фіг. 3B). Загалом, кава RT стимулює секрецію протонів у порівнянні з контрольними клітинами сильніше, ніж будь-який інший досліджений ліофілізат кави, призводячи до найвищих внутрішньоклітинних 9 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рівнів циклічного АМФ. Кава R, на відміну від цього, проявляла найменший стимулюючий ефект на протон-секреторну активність, але індукувала інші за величиною рівні циклічного АМФ у клітинах HGT-1. Ці результати дозволяють припустити, що досліджувані ліофілізати кави активують шлункову секрецію іншими шляхами, крім передачі сигналів циклічного АМФ. Вплив ліофілізатів кави на шляхи трансдукції сигналів і на генну експресію. Трансдукція сигналу є проміжною ланкою між активацією рецептора і регуляцією генної транскрипції функціональних білків, наприклад H+,K+-АТФази. Дотепер було показано, що передача сигналів EGFr, ERK1/2 і Akt1 бере участь у секреції кислоти шлункового соку. Регуляція генної транскрипції залежить від факторів транскрипції. Оскільки H+,K+-АТФаза і рецептор соматостатину містять сполучні мотиви для циклічно-АМФ-залежних факторів транскрипції, ми також досліджували роль ATF-2 у процесі генної регуляції і секреторної активності. У результаті обробка клітин HGT-1 гістаміном призводила до активації ATF-2 (індекс активації шляхів 1,17+0,25 vs. 0 для необроблених контрольних клітин; p ≤ 0.001, Фіг. 4). Для всіх досліджених ліофілізатів кави був продемонстрований індуктивний ефект активації ATF-2, що був найнижчим для кави R (кава R: 0,33±0,13; кава RT: 0,84±0,39; кава A: 0,97±0,15; кава AT: 0,85±0,20; всі p.0.05 vs. необроблені контрольні клітини; Фіг. 4). Однак, кава RT не впливала на експресію метаболічного шлях-асоційованого гена альфа-субодиниці H+,K+-АТФази (ATP4A), у той час як клітини обробленої кави R демонструють підвищену генну експресію антисекреторного соматостатинового рецептора (0,74±0,19, односторонній дисперсійний аналіз p < 0.01 vs. необроблені контрольні клітини (= 0), Фіг. 5A і B). При дослідженнях обробленої парою кави R (кава RT) не було виявлено ніяких ефектів для рецептора соматостатину, але також було продемонстроване збільшення генної експресії ATP4A (0,55±0.04, односторонній дисперсійний аналіз p ≤ 0.05 vs. необроблені контрольні клітини (= 0), Фіг. 5A і B). Клітини HGT-1 обробленої кави A показували збільшення генної експресії ATP4A (0,47±0.09, p ≤ 0.05 vs. Необроблені контрольні клітини (= 0)), у той час як генна експресія антисекреторного соматостатинового рецептора зменшувалася (-0,59±0,17, односторонній дисперсійний аналіз p < 0.01 vs. необроблені контрольні клітини (= 0), Фіг. 6A і B). Іншим фактором транскрипції, що, як повідомляється, підсилює секрецію кислоти шлункового соку і генну експресію H+,K+-АТФази, є Akt1. У даних дослідженнях передача сигналів Akt1 значно активувалася в клітинах HGT-1, підданих впливу кави AT, R або RT, з максимальними індексами активації шляхів, рівними 1,75±0,34, 0,60±0,22 і 0,75±0,30 відповідно (двосторонній t-критерій, p < 0.05-0.01 vs. необроблені контрольні клітини; Фіг. 4). Однак, ні кава AT, ні кава R не впливали на генну експресію ATP4A. На відміну від цього, обробка клітин HGT-1 кави A викликала невелике, але значне зниження активації Akt1 у порівнянні з необробленими контрольними клітинами (-0,22±0.05, двосторонній t-критерій p < 0.05, Фіг. 6). Оскільки кава A збільшувала експресію ATP4A, передача сигналів Akt1, очевидно, не є пусковим фактором експресії ATP4A після впливу кави. Проте, коли клітини HGT-1 піддавали впливу кави A, ERK1/2 активувався (1,30±0,58, двосторонній t-критерій vs. необробленого контролю p ≤ 0.05, Фіг. 4). На відміну від цього, передача сигналів ERK1/2 знижувалася після обробки кави RT (-0,58±0,49, двосторонній t-критерій, Фіг. 4). Активація рецептора EGFr була значною тільки після впливу на HGT-1 гістаміну (1,32+0,42) і кави RT (0,58±0,23) (двосторонній t-критерій, p ≤ 0.05-0.001, Фіг. 4). У цьому випадку це знову вказує на більш високу секреторну активність кави RT. Беручи до уваги експресію просекреторних рецепторів, функція H2-гістамінового рецептора не знижувалася в результаті інкубації клітин HGT-1 із кавою A або AT. Кава RT, на відміну від цього, значно збільшувала його експресію (0,41±0,10, односторонній дисперсійний аналіз p ≤ 0.01 vs. необроблені контрольні клітини, Фіг. 5C). Генна експресія просекреторного ацетилхолінового рецептора M3 знижувалася після обробки клітин HGT-1 кави A (-0,56±0.09, односторонній дисперсійний аналіз p ≤ 0.001, Фіг. 6B). Кава R і RT, на відміну від цього, проявляли посилюючий ефект на експресію гена ацетилхолінового рецептора M3 (0,43±0,12 і 0,71±0,23 відповідно, односторонній дисперсійний аналіз, p ≤ 0.01 vs. необроблені контрольні клітини, Фіг. 6B). Узагальнюючи, обробка паріетальних клітин кави RT призводила до найвищої секреторної активності, найбільш повної підвищувальної регуляції просекреторних генів і метаболічних шляхів, пов'язаних із активацією секреції кислоти шлункового соку. Клітини HGT-1, піддані впливу кави AT, не демонструють ніякого збільшення експресії просекреторних генів, а також не спостерігається зниження експресії антисекреторних генів. Із цим узгоджується спостереження, що секреторна активність паріетальних клітин після впливу кави AT була нижчою, ніж для кави RT (Фіг. 3). Найслабше виражений вплив на секреторну активність був продемонстрований для кави R (Фіг. 3), яка не проявляла посилюючого ефекту на експресію гена просекреторного ацетилхолінового рецептора M3, але також продемонструвала найвищий стимулюючий ефект 10 UA 108356 C2 5 на експресію гена антисекреторного соматостатинового рецептора серед усіх досліджених марок кави (Фіг. 5B). Таблиця 1: Концентрації основних передбачуваних біологічно активних сполук у кавових напоях (мг/л) і в ліофілізатах (мг/л), приготованих із C. Arabica Brazil (Кава A), C. Arabica Brazil, обробленої парою (Кава AT), C. Robusta Vietnam (кава R) або C. Robusta Vietnam, обробленої парою (кава RT). Крім того, наведені величини співвідношень для окремих сполук у ліофілізатах кави, де кава з найменшим вмістом певної сполуки приймається за 100 %. Кавовий напій [мг/л] a Вихід экстракції b Хлорогенова кислота b Кофеїн b N-метилпіридиній b Пірогалол b Катехін b C5HT Хлорогенова кислота c Кофеїн c N-метилпіридиній c Пірогалол c Катехін c C5HT Хлорогенова кислота Кофеїн N-метилпіридиній Пірогалол Катехін C5HT c Кава A Кава AT 12740 12580 1038 1083 618 594 32.21 34.70 4.05 3.99 5.73 5.29 0,21 0,21 Ефективна доза в ліофілізаті [мг/л] 203.66 215.22 121.27 118.04 6.32 6,90 0,79 0,79 1.12 1.05 0.04 0.04 Співвідношення 132 % 140 % 103 % 100 % 780 % 851 % 111 % 111 % 170 % 159 % 400 % 400 % Кава R 15800 975 1389 22.40 5.63 9.26 0,12 Кава RT 16750 1464 1326 5.41 4.79 4.43 0.08 154.27 219.78 3.54 0,89 1,47 0.02 218.51 197.91 0,81 0,71 0,66 0.01 100 % 186 % 437 % 125 % 221 % 200 % 142 % 167 % 100 % 100 % 100 % 100 % a вихід екстракції визначають за вагою після ліофілізації концентрацію визначають методом ВЕРХ-DAD (детектор на діодній матриці)/ ВЕРХ-МС/МС у щойно приготованому напої c концентрації розраховують за концентрацією в напої і виходом екстракції. b 10 15 20 25 30 Кава A: Arabica Brazil, необроблена; Кава AT: Arabica Brazil, оброблена парою; Кава R: Vietnam Robusta, необроблена; Кава RT: Vietnam Robusta, оброблена парою. Вищенаведений приклад стосується характеризації складу кавового напою, який ефективно знижуючи регулює обрані механізми секреції кислоти шлункового соку. Спочатку звичайний кавовий напій, не оброблений парою і не декофеїнований, піддають фракціонуванню розчинниками для визначення полярності сполук, що впливають на протон-секреторну активність у клітинах HGT-1. Крім того, кожну з цих фракцій розчинника, отриманих шляхом екстракції кавового напою водою, етилацетатом, дихлорметаном або пентаном, аналізують на вміст у ній сполук, які, як припускається, подразнюють шлунок, а саме, кофеїну, хлорогенової кислоти, βN-алканоїл-5-гідрокситриптамідів, пірогалолу, катехіну, а також N-метилпіридинію як ще однієї недавно ідентифікованої біологічно активної сполуки кавового напою. Функціональні аналізи продемонстрували стимулюючий ефект на протон-секреторну активність етилацетатного, дихлорметанового і пентанового екстрактів, у той час як водний екстракт не проявляв ніякого впливу на секрецію протонів. Цей результат був досить несподіваним, оскільки водний екстракт містив більшу частину хлорогенової кислоти (95 %) і βN-алканоїл-5гідрокситриптамідів (55 %) від загальної кількості, яка міститься в кавовому напої. Припускається, що обидві ці сполуки промотують секрецію шлункової кислоти. Однак, ми віднесли відсутність стимулюючого ефекту на секрецію протонів у клітинах HGT-1 до вмісту Nметилпіридинію у водній фракції, яка єдина містила цю сполуку. Хоча ми не змогли підтвердити цей ефект експериментами, в яких клітини HGT-1 обробляли окремо взятою сполукою Nметилпіридинію, додавання N-метилпіридинію до ліофілізату, приготованому зі звичайного кавового напою (не обробленого парою і не декофеїнованого), чітко продемонструвало антисекреторний ефект цієї сполуки при концентрації в напої приблизно 18 мг/л. Таке 11 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розходження між окремо взятою сполукою і складним напоєм здається обґрунтованим, оскільки кавовий напій містить різні компоненти, які можуть конкурувати за зв'язування з рецептором, діяти як інгібітори або енхансери функціональних білків, а також генної регуляції і, нарешті, можуть проявляти синергічні або анти-синергічні ефекти. Для додаткової оцінки ефекту кавових напоїв із різними концентраціями N-метилпіридинію на клітинні механізми секреції шлункової кислоти, ліофілізати, приготовані з кавових напоїв з високими (C. Arabica: 32 мг/л і C. Arabica Brazil, слабко оброблений паром: 34 мг/л), середніми (C. Robusta Vietnam: 22 мг/л) і низькими (C. Robusta Vietnam, оброблений паром: 5 мг/л) концентраціями, були отримані від місцевого виробника кави. Обробка парою застосовувалася у відповідності з процедурою, використовуваною для виробництва ринкових марок кави з маркуванням "нешкідлива для шлунка". Результати функціональних експериментів, що досліджують вплив ліофілізованого кавового напою на протон-секреторну активність, продемонстрували значно більш низьку секреторну активність для кавових напоїв із середньою або високою концентраціями N-метилпіридинію в порівнянні з напоєм, що має найнижчу концентрацію. Однак, найменша секреторна активність була продемонстрована для C. Robusta Vietnam з концентрацією N-метилпіридинію, що становить 22 мг/л напою. Цей результат узгоджується з результатами, отриманими в експериментах, у яких ліофілізат, приготований зі звичайної ринкової кави, був збагачений N-метилпіридинієм до кінцевої концентрації 18 мг/л напою. Також результати досліджень молекулярних механізмів секреції шлункової кислоти, таких як генна регуляція, шляхи трансдукції сигналу і споріднені фактори транскрипції, продемонстрували, що найменшим просекреторним ефектом серед досліджених кавових напоїв володіє C. Robusta Vietnam. Зокрема, був показаний індукувальний ефект на експресію гена антисекреторного рецептора соматостатину (SSTR2), у той час як вплив на експресію гена H+,K+-АТФази не спостерігався. Несподівано, найменша секреторна активність серед випробуваних зразків кави корелювала з підвищеною генною експресією ацетилхолінового рецептора (CHRM3). Цей результат указує, що шляхи регуляції секреції шлункової кислоти розрізняються за своєю ефективністю. Підвищувальна регуляція просекреторних генів або білків факторів транскрипції не обов'язково призводить до підвищеної секреції протонів і навпаки. Це також продемонстровано результатами для інших кавових напоїв, досліджених у даній роботі. Оброблений парою C. Robusta Vietnam, наприклад, демонстрував найбільший стимулюючий ефект на протон-секреторну активність, ефект підвищувальної регуляції експресії гена H+,K+АТФази, ключового учасника секреції кислоти шлункового соку, а також на експресію гена просекреторних гістамінового (HRH2) і ацетилхолінового (CHRM3) рецепторів. Незважаючи на такі просекреторні ефекти, клітини HGT-1, оброблені C. Robusta Vietnam, також демонстрували знижені концентрації циклічного АМФ і знижену активацію ERK1/2, які обидва беруть участь у просекреторних метаболічних шляхах. Наостанок вкажемо, що нами було вперше продемонстровано, що регуляція і функція протон-секреторної активності клітин шлунка людини, індукованої кавовими напоями, залежить від концентрації в них N-метилпіридинію. Вплив інших компонентв, таких як кофеїн, хлорогенова кислота або βN-алканоїл-5-гідрокситриптаміди, розглядаються в наступних багатопараметричних дослідженнях. Приклад 2: Багатопараметричний підхід до ідентифікації компонентів кави, які регулюють механізми секреції кислоти шлункового соку У даних дослідженнях шість різних сполук – хлорогенова кислота (CA), кофеїн (CAFF), пірогалол (PYR), катехін (CAT), N-алканоїл-гідрокситриптаміди (C5HT) і N-метилпіридиній (NMP), були проаналізовані на їхній вплив на гени, пов'язані з секреторною активністю, трансдукцією сигналу і експресією кислоти шлункового соку, а також активацією фактора транскрипції ATF-2, а також концентраціями cAMP. Ми встановили, які сполуки можуть діяти як захисні для шлунка сполуки в кавових напоях. Крім того, ми розробили статистичну модель для прогнозування синергічних і анти-синергічних ефектів розчинів, що містять велику кількість сполук, на шлункову секрецію. N-MP, CAFF, CAT, C5HT, PYR і CA використовують у концентраціях, що відповідають звичайному кавовому напою. Для in vitro досліджень використовують клітинну лінію раку шлунка людини HGT-1. Секреторну активність вимірюють за допомогою камери Уссінга і аналізу методом FACS (активований флуоресценцією аналіз клітин). Для детектування активації рівнів EGFr, Akt1, ERK1/2, ATF-1 і cAMP ми проводили аналізи ELISA, тоді як зміни залежної від часу експресії генів, пов'язаних із кислотою шлункового соку, таких як гістамінові, ацетилхолінові і соматостатинові рецептори, а також H+,K+-АТФаза, визначають методом ПЛР у реальному часі. Експериментальні дані були потім частково використані для статистичного моделювання з 12 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використанням програми "нейронних мереж". N-MP підвищує експресію антисекреторного соматостатинового рецептора на 114 %, у той час як C5HT знижує його експресію до 48 %. Крім того, N-MP знижуюче регулює просекреторний ацетилхоліновий рецептор M3 (-36 %) і H+,K+-АТФазу на -27 %. АТФаза піддається 2-кратній підвищувальній регуляції CA і CAFF. CAFF найбільш сильно стимулює секреторну активність у функціональних аналізах. N-MP діє як інгібітор індукованої CAFF секреторної активності. Несподівано, CA не збільшує секрецію, а скоріше призводить до зниження секреції. Аналіз метаболічних шляхів дозволив установити розходження між CAFF, CA, CAT, C5HT, PYR і гістаміном, які активують передачу сигналів EGFr, і N-MP, який активує передачу сигналів Akt1 і ERK1/2. Загалом, ці результати дозволяють припустити наявність захисного стосовно шлунка потенціалу у пірогалолу і N-метилпіридинію in vitro. Клітинна культура. Клітини HGT-1 (Dr. C. Laboisse, Nantes, France) культивують при 37 °C з 5 % CO2 у середовищі Ігла, модифікованому за Дульбекко, з 20 % фетальною телячою сироваткою, 5 % глутаміну і 5 % пеніциліну/стрептоміцину. Клітини синхронізують протягом 24 годин перед експериментами з середовищем Ігла, модифікованим за Дульбекко, як описано вище, але без вмісту фетальної телячої сироватки. Експерименти з окремо взятими сполуками. Клітини піддають впливу кофеїну (3 мм), хлорогенової кислоти (3 мм), катехіну (52 мкм), пірогалолу (32 мкм) (усі Sigma-Aldrich, Munich, Germany), βN-алканоїл-5-гідрокситриптамідів (1 мкм) і N-метилпіридинію (0,34 мкм) у концентраціях, що відповідають їхньому вмісту, визначеному для звичайного кавового напою. Іншими використаними сполуками були омепразол (1 мм), соматостатин (0,5 мм), гістамін (1 мм), ацетилхолін (1 мм) (усі Sigma-Aldrich, Munich, Germany). Усі сполуки розчиняли безпосередньо в фосфатно-сольовому буфері (PBS) або в розчині Рінгера, за винятком Nалканоїл-5-гідрокситриптамідів, які розчиняють у тетрагідрофурані (1 мг/мл ТГФ) і додають в об'ємі 2 мкл на 10 мл буферу для отримання кінцевої концентрації. Аналізи експресії. Після 5, 10, 15 і 20 хв. впливу клітини збирають для аналізу експресії генів. Праймери ATP4A, HRH2, SSTR2 і CHRM3 були сконструйовані за допомогою Beacon Designer 7.0 (PremierBiosoft, Palo Alto, CA) і перевірені на відповідність стандарту і проаналізовані за допомогою кривих плавлення. Точну послідовність продуктів ПЛР перевіряли шляхом секвенування (Medigenomics, Martinsried, Germany). Аналізи ПЛР у реальному часі проводять із використанням набору Brilliant SYBR Green Kit (Stratagene, Amsterdam, Netherlands) на термоциклері Mx3000p (Stratagene, Amsterdam, Netherlands). Умови термоциклування: 10:00 хв/95 °C (активація), 00:30 с/95 °C (денатурація), 00:30 с/60 °C (відпал із вимірюванням флуоресценції), 00:30 с/72 °C (подовження ланцюга). Кількісне визначення циклічного АМФ (cAMP). Для визначення cAMP у клітинних супернатантах ми використовували набір для конкурентного визначення cAMP ELISA parameter kit (R&D Systems, Minneapolis, MN), як описано в протоколі виробника. Супернатанти виділяють після однієї хвилини інкубації. Виділення РНК і синтез кДНК. Висівають 100000 клітин у шестилункові планшети і вирощують до злиття. Виділяють повну РНК за допомогою набору Rneasy Midi Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Гідроліз ДНКази I проводять за допомогою набору RNase free DNAse Kit (Qiagen, Hilden, Germany) на колонку. Перед qPCR (кількісна ПЛР) загальний вміст РНК кількісно визначають фотометрично при 260 нм. кДНК синтезують із використанням набору cDNA High Capacity Synthesis Kit (Applied Biosystems, Munich, Germany), як описано в інструкції виробника. Секреторна активність. Для кожного біологічного незалежного експерименту використовують об'єм суспензії клітин, рівний 2 мл, що відповідає 2000000 клітин, і інкубують протягом 10 хвилин із 2,5 мг ліофілізату кави на мл PBS, гістаміну, окремих сполук або різних комбінацій усіх сполук при 37 °C. Секреторну активність вимірюють шляхом визначення внутрішньоклітинного протонного індексу (IPX). Для вимірювання внутрішньоклітинного pН використовують флуоресцентний барвник Carboxy-SNARF-AM (Invitrogen, Karlsruhe, Germany). Спосіб був атестований. Клітини HGT-1 насичують 3 мкМ барвника протягом 30 хвилин на льоду. Внутрішньоклітинний pН розраховують за калібрувальною кривою для клітини HGT-1, обробленої 2 мкМ нігерицину (PAA, Coelbe, Germany) у буфері K+clamp, який містить 20 мМ NaCI, 110 мМ KCI, 1 мМ CaCI2, 1 мМ MgSO4, 18 мМ D-глюкози і 20 мМ HEPES і який встановлюють на різні калібрувальні точки pН (6,8-8,2) шляхом титрування NaOH. Потім внутрішньоклітинний протонний індекс (IPX) розраховують шляхом log2-перетворення співвідношення внутрішньоклітинних концентрацій протонів між обробленими клітинами і контрольними клітинами. Чим вище значення IPX, тим більше протонів залишається в клітині, що вказує на більш низьку секреторну активність. Більш негативне значення IPX, відповідно, 13 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 означає підвищену секреторну активність. Експерименти з камерою Уссінга. Для перевірки того, як окремі речовини впливають на йонний транспорт від базолатеральної до апікальної ділянки моношару HGT-1, ми провели експерименти з камерою Уссінга. Для цього клітини HGT-1 культивують на проникній підкладці з поліефірною мембраною SNAP-well з порами 0,4 мкМ (Sigma-Aldrich, Munich, Germany). 2 Поверхня ділянки, що культивується, становить приблизно 1,13 см . Клітини вирощують до злиття, що підтверджують мікроскопічним аналізом і вимірюваннями опору за допомогою камери Endohm (WPI, Berlin, Germany). Вкладки SNAP-well встановлюють у камеру Уссінга (Easy Mount Chambers, Harvard Апарат, March-Hugstetten, Germany), заливають розчином Рінгера (Sigma-Aldrich, Munich, Germany) при 37 °C і обережно барботують повітрям при контролі pН. Усі досліджувані речовини також розчиняють у розчині Рінгера. Різницю трансепітеліальних потенціалів вимірюють за допомогою пари Ag/AgCI електродів, підключених до апарата гальванічної напруги (KMSCI, Aachen, Germany). Електроди струму і напруги встановлюють по обидві сторони моношару. Електроди вставляють у наконечник для електрода і приєднують до розчину Рінгера за допомогою заповненого 3M KCI агар-агарового містка. 2 Секрецію вимірюють як струм у режимі короткого замикання і представляють у мкА/см (тривалість імпульсу 0,2 с; частота імпульсів 1 Гц; амплітуда імпульсів 25 мс). Сполуки вводять в апікальний компартмент, що імітує порожнину шлунка. Аналіз трансдукції сигналу. Стан фосфорилювання рецептора тирозинкінази і MAPK кінази детектують методом твердофазових імуноферментних аналізів (ELISA). Загальний білок виділяють із клітин HGT-1 після інкубації з досліджуваними речовинами протягом 10 хвилин відповідно до протоколу виробника і з використанням наданого буфера для лізису. Загальний вміст білка кількісно визначають фотометрично при 595 нм із використанням реагенту Бредфорда (Bradford) (Bio-Rad, Munich). Для визначення стану фосфорилювання використовують такі ELISA: набір EGFr-ELISA, набір ERK1/2 ELISA (обидва Calbiochem/Merck, Nottingham, UK), Akt1 pathscan ELISA і ATF-2 pathscan ELISA (обидва Cell Signaling/New England Biolabs, Frankfurt a. M., Germany). Поглинання зчитують при 450 нм за допомогою планшетрідера MRX (Dynex, Berlin, Germany). Аналіз даних методом нейронної мережі. Нейронні мережі для трьох рецепторів HRH2, CHRM3 і SSTR2 індивідуально підготовляють на основі набору рекомбінованих даних для кави. Використовують прикладну програму нейронної мережі NeuralWorks Predict (NeuralWare, Pittsburg, PA) із налаштуваннями за промовчанням, за виключенням використання каскадного вибору змінної і примусової обробки вхідного сигналу як неперервних змінних числових даних. Значимість індивідуальних компонентів кави для генної експресії в нейронних мережах характеризують за частотою, з якою конкретний компонент з'являється в кінцевій популяції генетичного алгоритму вибору змінних мережі. Максимальна частота 1,00 для вхідний змінної (компонент кави) вказує, що вона дуже важлива для нейронної мережі і завжди обрана. Статистичний аналіз. Статистичний аналіз проводять за допомогою Excel 2003 або SigmaStat (Systat Software Gmb, Erkrath, Germany). Набори даних, які генеруються qPCR (кількісною ПЛР) і ELISA, трансформують шляхом логарифмічного перетворення для досягнення нормальності і індексуються на фігурах як log2 співвідношення. Окремі порівняння між обробленими і контрольними клітинами проводять із використанням двостороннього tкритерію Стьюдента для однакових дисперсій, якщо не зазначено інше. Для аналізу експресії генів у часі ми проводили односторонній дисперсійний аналіз із додатковим аналізом за Холмом-Сідаком для параметричних наборів даних і тест Крускала-Уоллеса з додатковим аналізом за Даном для непараметричних наборів даних. Число повторів для кожного експерименту зазначене в розділі результатів і на фігурах. На кожному графіку наводяться середні значення для незалежних біологічних експериментів ± стандартна помилка (SE). Експерименти з камерою Уссінга проводять як окремі експерименти і початкові зареєстровані значення наведені на відповідному графіку. Регуляція генів, пов'язаних із секрецією кислоти шлункового соку. Регуляція генів, пов'язаних із секрецією кислоти шлункового соку, є важливим засобом визначення сприйнятливості паріетальних клітин до секреції паракринного і ендокринного гормонів. Крім того, індукований синтез функціональних білків може впливати на секреторну активність паріетальних клітин. У даних дослідженнях ми вивчили залежний від часу вплив шести різних сполук, виділених із кавових напоїв, на експресію H+,K+-АТФази (ATP4A), H2-гістамінового рецептора (HRH2), ацетилхолінового рецептора M3 {CHRM3) і рецептора соматостатину 2 (SSTR2). Залежну від часу експресію вимірюють доти, поки експресія не вертається на контрольний рівень. Одна контррегуляція після попередньої підвищувальної або понижувальної регуляції вважається фізіологічною регуляцією. 14 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 H+,K+-АТФаза. Експресія H+,K+-АТФази порушується переважно і у значній мірі хлорогеновою кислотою, кофеїном, пірогалолом і N-метилпіридинієм (односторонній дисперсійний аналіз, p < 0.01-0.001; n=5-6, Фіг. 7A), у той час як катехін і C5HT значно не змінюють експресію протягом усього часу вимірювань (графіки не наведені). Хлорогенова кислота і кофеїн підвищують експресію H+,K+-АТФази майже вдвічі (CA: 0,91±0,17, CAFF: 0,94±0,24; додатковий тест, p < 0.05, Фіг. 7A) після 20 хвилин. Зміна експресії залишалася значною протягом усього періоду вимірювань, рівного 30 хвилинам. На відміну від цього, Nметилпіридиній і пірогалол призводили до значного зниження експресії після 20 хвилин (N-MP: 0,64±0,11, PYR: -0,46±0.07, додатковий тест p ≤ 0.05, Фіг. 7A). Для виявлення синергічних або анти-синергічних ефектів цих сполук при їхніх максимумах/мінімумах пікової експресії був вивчений вплив їхніх комбінацій на генну експресію. Як пірогалол, так і N-метилпіридиній, були здатні в значній мірі компенсувати ефект підвищувальної регуляції хлорогенової кислоти і кофеїну (двосторонній t-критерій, p < 0.01-0.001, n=4-6, Фіг. 7B) до N-MP/CA: -0,76±0,24, NMP/CAFF: -0,46±0.05, N-MP/CA/CAFF: -0,21±0,22 і PYR/CA: -0,36±0,19, PYR/CAFF: -0,10±0,13, PYR/CA/CAFF: -0,27±0,15. Таким чином, було показано, що N-метилпіридиній і пірогалол домінують над ефектами хлорогенової кислоти і кофеїну в більш складному розчині. Обробка клітин HGT-1 фізіологічними індукторами секреції кислоти шлункового соку, такими як гістамін (0,74±0,16; додатковий тест, p < 0.05, графік не наведений) і ацетилхолін (0,62±0,19; додатковий тест, n=6, p < 0.05, графік не наведений), призводила до значного збільшення експресії після 20 і 15 хвилин відповідно. Цікаво, що обробка соматостатином також викликала значну підвищувальну регуляцію H+,K+-АТФази після 20 хвилин 0,83±0,20 (додатковий тест, n=6, p ≤ 0.05, графік не наведений). З урахуванням такого характеру регуляції при впливі фізіологічних сполук здається ймовірним, що підвищувальна регуляція H+,K+-АТФази відбувається як перша відповідь на обробку клітин HGT-1. Таким чином, наступна контррегуляція, продемонстрована для пірогалолу і N-метилпіридинію, імовірно, є більш істотною для регуляції секреції кислоти шлункового соку. H2-гістаміновий рецептор. Просекреторні рецептори беруть участь у активації паріетальних клітин внаслідок зв'язування гормонів і трансмітерів. Була вивчена залежна від часу експресія просекреторних H2-гістамінового рецептора і ацетилхолінового рецептора M3 у клітинах HGT-1. H2-рецептор у значній мірі регулювався протягом усього часу вимірювань хлорогеновою кислотою, катехіном і C5HT (односторонній дисперсійний аналіз, p ≤ 0.01-0.05, n=5-6, Фіг. 7C), у той час як кофеїн і N-метилпіридиній не впливали на експресію цього рецептора. Катехін (0,54±0,23, додатковий тест; p < 0.05) і C5HT (-1,35±0,21; додатковий тест, p < 0.05) викликали значну понижувальну регуляцію експресії. Хлорогенова кислота викликала значну підвищувальну регуляцію експресії H2-рецептора (0,55±0,21, додатковий тест, p < 0.05) після 20 хвилин. Комбінація C5HT з хлорогеновою кислотою призводить до значної підвищувальної регуляції H2-рецептора після п'яти хвилин (0,46±0.04, двосторонній t-критерій, p ≤ 0.001, n=4-6, Фіг. 7D) у порівнянні з контрольними клітинами і окремо взятим C5HT. Оскільки понижувальна регуляція H2-рецептора не збільшує сприйнятливість паріетальних клітин до гістаміну, C5HTкислота може підтримувати цей ефект у складному розчині. Однак, у комбінації з хлорогеновою кислотою він буде анульований. Комбінація катехіну і хлорогенової кислоти не змінює значно рівень експресії в порівнянні з окремо взятим катехіном (Фіг. 7D). Гістамін як фізіологічний ліганд не регулює в значній мірі H2-рецептор (результати не наведені). Ацетилхоліновий рецептор M3. Було показано, що холінергічний рецептор M3 у значній мірі регулюється тільки кофеїном, пірогалолом і N-метилпіридинієм (односторонній дисперсійний аналіз, p ≤ 0.01-0.001, n=4-9, Фіг. 8A). Хлорогенова кислота, C5HT і катехін значно не впливають на експресію M3-рецептора (графіки не наведені). Сполуки кофеїну, пірогалолу і Nметилпіридинію спочатку призводять до підвищувальної регуляції M3-рецептора після п'яти хвилин, CAFF: 0,55±0.08, N-MP: 0,53±0,25, PYR: 1,14±0,14 (додатковий тест, p < 0.05, Фіг. 8A), причому пірогалол демонстрував найбільш виражену підвищувальну регуляцію цього рецептора. Однак, наступна контррегуляція була значною для N-метилпіридинію (-0,76±0,26, додатковий тест, p < 0.05, Фіг. 8B) після 20 хвилин і для пірогалолу (-0,70±0,21, додатковий тест, p.0.05, Фіг. 8B) після 15 хвилин. Оскільки ми не виявили ніякої протидіючої підвищувальної або понижувальної регуляції певними сполуками, ми не проводили додаткових досліджень впливу комбінації сполук на цей рецептор. Експресія M3-рецептора не регулювалася в значній мірі шляхом обробки ацетилхоліном (результати не наведені). Соматостатиновий рецептор 2. Антисекреторний соматостатиновий рецептор 2 у значній мірі регулювався N-метилпіридинієм, C5HT і катехіном (односторонній дисперсійний аналіз, p ≤ 0.01-0.001, n=4-9, Фіг. 8B). Катехін знижував експресію рецептора соматостатину до -0,56±0,28 після 15 хвилин (додатковий тест, p ≤ 0.05, Фіг. 8B). Крім того, C5HT викликав гігантське 15 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зниження експресії рецептора до -2,12±0,25 після п'яти хвилин (додатковий тест, p ≤ 0.05, Фіг. 8B). На відміну від цього, N-метилпіридиній підвищував експресію антисекреторного соматостатинового рецептора більш, ніж удвічі, до 1,14±0,15 після п'яти хвилин (додатковий тест, p ≤ 0.05, Фіг. 8B). Обробка соматостатином регулювала цей рецептор у такому ж ступені, як N-метилпіридиній, але з піком максимуму після 20 хвилин (1,14±0,31; додатковий тест, p < 0.05, графік не наведений). Таким чином, ми об'єднали C5HT і N-метилпіридиній, що призводило до експресії рецептора соматостатину на контрольному рівні (1,14±0,31, Фіг. 8D). Рівень експресії в порівнянні з обробкою окремо взятими N-метилпіридинієм або C5HT при цьому значно змінювався (двосторонній t-критерій, p < 0.05-0.001, n=4-6, Фіг. 8D). Повна рекомбінація сполук. Після того, як ми охарактеризували ефект кожної окремо взятої сполуки та їхніх комбінацій у найбільш виражені моменти часу, ми протестували повну рекомбінацію всіх шести сполук разом. Наші результати для H+,K+-АТФази були підтверджені тим фактом, що експресія протонного насоса не збільшувалася і не зменшувалася після 20 хвилин. Весь період проведення вимірювань залишався значущим для регуляції (односторонній дисперсійний аналіз, p ≤ 0.05, n=5-6, Фіг. 9A), але був підтверджений компенсаційний ефект Nметилпіридинію і пірогалолу після 20 хвилин. Було показано, що просекреторний M3-рецептор піддається понижувальній регуляції N-метилпіридинієм після 20 хвилин. Рекомбінація всіх шести сполук також значно знижуючи регулює експресію цього рецептора після 20 хвилин до 1,43±0,31 (односторонній дисперсійний аналіз, p ≤ 0.001, n=6, Фіг. 9A; додатковий тест, p.0.05), що значно перевищує ефект окремо взятого N-метилпіридинію. Таким чином, було висунуте припущення про комбінований ефект N-метилпіридинію і пірогалолу. Крім того, обробка повною рекомбінацією не викликала підвищувальної регуляції M3-рецептора після п'яти хвилин, що дозволяє припустити наявність анти-синергічних ефектів усіх разом узятих сполук. Було показано, що антисекреторний соматостатиновий рецептор піддається підвищувальної регуляції N-метилпіридинієм і протилежно регулюється C5HT. Повна рекомбінація підтвердила наші результати, що стосуються протидії один одному C5HT/N-метилпіридинію після п'яти хвилин. Рівень експресії був ненабагато, але не значно, вищим за контрольні рівні. На відміну від цього, наступна понижувальна регуляція рецептора соматостатину однаково спостерігалася після 20 хвилин, як також було показано для окремо взятого N-метилпіридинію (односторонній дисперсійний аналіз, p ≤ 0.001, n=6, Фіг. 9A; додатковий тест, p < 0.05). H2-гістаміновий рецептор продемонстрував схему поведінки, яка повністю відрізняється від описаної для окремо взятих сполук. Сильний ефект понижувальної регуляції C5HT, імовірно, компенсується завдяки хлорогеновій кислоті, як показано раніше (Фіг. 7, C і D). Однак, після 10 хвилин експресія H2-рецептора по-гігантськи зростала до 1,36±0,37 (односторонній дисперсійний аналіз, p ≤ 0.001, n=6, Фіг. 9A; додатковий тест, p ≤ 0.05). Оскільки наші експерименти з окремо взятими сполуками не дають пояснення цьому ефекту, ми розробили підхід до визначення співвідношень між окремо взятими сполуками або їхніми комбінаціями і експресією H2-рецептора, а також трансдукцією сигналу і функціональних аспектів, шляхом статистичного моделювання, яке описане в наступному абзаці. Ідентифікація комбінаторних впливів на генну експресію рецептора методами обчислювального аналізу. Різні комбінації досліджуваних сполук використовують для оцінки ефектів, викликаних комбінацією окремо взятих сполук, шляхом розрахунку нейронної мережі (Таблиця 2). Як домінуючі сполуки в багатокомпонентному розчині були ідентифіковані Nметилпіридиній, кофеїн і хлорогенова кислота. N-метилпіридиній вважався важливим фактором в 94 % всіх розрахованих сценаріїв експресії H2-гістамінового рецептора. Найвищу значимість продемонстрував кофеїн – 100 %. Пірогалол і хлорогенова кислота мали значимість 71 % і 79 %, тоді як алканоїл-5-гідрокситриптамиди і катехін мали більш низьку, рівну 50 % і 29 %. Загалом, розраховані сценарії корелюють із експериментальними даними для експресії H2гістамінового рецептора з R=94 %. Експериментальні результати для експресії ацетилхолінового рецептора M3 також мають кореляцію 94 % з розрахованою моделлю. У цьому випадку, хлорогенова кислота має найвищу значимість, рівну 100 %. N-Метилпіридиній використовувався в 91 % всіх розрахованих сценаріїв як важливий фактор у комбінації з іншими компонентами. Кофеїн мав значимість 82 %. Катехін (59 %), алканоїл-5-гідрокситриптамид (68 %) і пірогалол (23 %) мали меншу важливість. Нейронна мережа, розрахована для антисекреторного соматостатинового рецептора, корелює з експериментальними даними з досить прийнятним значенням R, рівним 80 %. За винятком N-алканоїл-5-гідрокситриптамідів (25 %), усі сполуки продемонстрували значимість вище 83 % (пірогалол). Найбільший ваговий коефіцієнт, розрахований для хлорогенової кислоти і кофеїну, дорівнював 100 %. Nметилпіридиній показав значимість, рівну 96 %, так само як катехін. Концентрація циклічного АМФ у клітинних лізатах. Передача сигналів H2-гістамінового 16 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рецептора сильно пов'язана з підвищеними рівнями цАМФ внаслідок активації аденілатциклази. Обробка гістаміном значно підвищувала концентрацію цАМФ у клітинах HGT-1 до 71±17 фмоль/мл (двосторонній t-критерій; p < 0.05; n=4; Фіг. 10A). Аналогічно гістаміну, кофеїн (56±15 фмоль/мл), пірогалол (56±23 фмоль/мл), катехін (74±27 фмоль/мл), C5HT (40±1,0 фмоль/мл) і N-метилпіридиній також значно підвищували рівні циклічного АМФ у клітинах HGT-1 (двосторонній t-критерій; p < 0.05-0.01; n=4; Фіг. 10A). На відміну від цього, хлорогенова кислота (12±1,9 фмоль/мл) призводила до значного зниження концентрації циклічного АМФ у порівнянні з контрольними клітинами (двосторонній t-критерій; p < 0.05; n=4; Фіг. 10A). Повна рекомбінація всіх окремо взятих сполук також значно збільшувала концентрації циклічного АМФ до 46±7,1 фмоль/мл у порівнянні з контролями (23±3.4 фмоль/мл) (двосторонній t-критерій, p < 0.05; n=7; Фіг. 9, C). Трансдукція сигналу. Індукція секреції кислоти шлункового соку є багатопараметричною. Зміни на регуляторному і функціональному рівні медіюються внутрішньоклітинною передачею сигналів кіназ. Тому ми досліджували, чи будуть три різні кінази активуватися шляхом фосфорилювання після обробки компонентами обсмаженої кави або гістаміном. Спочатку ступінь фосфорилювання рецептора EGFr тирозинкінази після додавання гістаміну (1,32±0,42), хлорогенової кислоти (2,22±0,30), кофеїну (1,78±0,64) або C5HT (1,19±0,21) значно зростала (p < 0.001-0.05; n=3-7; Фіг. 10, B), у той час як N-метилпіридиній не впливав на активацію в порівнянні з контрольними клітинами. Оскільки передача сигналів EGFr і G-білка може згодом активувати Akt1 кіназу, цей шлях також був досліджений для визначення його стану фосфорилювання. Несподівано, Akt1 лише незначно активувався кофеїном (0,48±0,30), пірогалолом (0,66±0,38), катехіном (0,66±0,13) і C5HT (0,53±0,32) (двосторонній t-критерій, p < 0.05; n=7; Фіг. 10B), і більш значно - N-метилпіридинієм (1,39±0,25) (двосторонній t-критерій, p < 0.01; n=7; Фіг. 10, B). Індукована гістаміном шлункова секреція переважно розвивалася шляхом передачі сигналів циклічного АМФ. Однак, хлорогенова кислота не підвищувала рівні циклічного АМФ і не активувала Akt1, що дозволяє припустити її низький секреторний потенціал. У той же час, активація Akt1 N-метилпіридинієм повинна була викликатися індукцією рецептора, відмінного від EGFr. Крім цього, ми досліджували, чи продемонструють позаклітинно регульовані кінази 1/2 (ERK1/2) відмінні рівні фосфорилювання після обробки гістаміном або компонентами обсмаженої кави. N-метилпіридиній (0,52±0,14) був єдиною речовиною, що викликала значну активацію ERK1/2 (двосторонній t-критерій, p ≤ 0.01; n=3; Фіг. 10, B). На відміну від цього, обробка гістаміном (-0,37±0.09), хлорогеновою кислотою (-1,09±0,38), C5HT (0,81±0,22) і кофеїном (-0,30±0,13) призводить навіть до значно зниженої активації ERK1/2 у порівнянні з контрольними клітинами (двосторонній t-критерій, p < 0.01-0.05; n=7; Фіг. 10B). Повна рекомбінація всіх сполук, однак, активує EGFr (2,19±0,59) і Akt1 (0,88±0,28), але не ERK1/2 (-0,33±0,14). Цей результат указує на переважний ефект інших сполук, відмінних від Nметилпіридинію, на передачу сигналів ERK1/2, яка, як було визначено раніше, грає критичну інгібувальну роль у секреції кислоти шлункового соку. Активація фактора транскрипції. Фактори транскрипції відіграють критичну роль у транскрипції генів. Оскільки гени альфа-субодиниці H+,K+-АТФази (ATP4A) і рецептора соматостатину (SSTR2) містять елементи, чутливі до циклічного цАМФ, ми досліджували роль фактора транскрипції ATF-2 у стимуляції секреції кислоти шлункового соку під дією гістаміну, окремо взятих сполук і їхньої повної рекомбінації. Тільки гістамін (1,17±0,25), катехін (1,22±0.08) і N-метилпіридиній (0,84±0,23) значно активували ATF-2. Тільки кофеїн викликав дефосфорилювання, яке було значно нижчим, ніж у контрольних клітин (0,64±0.06) (двосторонній t-критерій, p ≤ 0.05-0.001; n=7; Фіг. 10, C). Повна рекомбінація всіх сполук призводила до значного збільшення активації ATF-2 у порівнянні з контролями (двосторонній tкритерій, p < 0.01; n=4; Фіг. 9, B). Пов'язана з вимірюваннями концентрацій циклічного АМФ у клітинах HGT-1, гістамінова активація паріетальних клітин, як вказується, сильно пов'язана з активацією під дією ATF-2, а також катехіну і N-метилпіридинію. Крім цього, дефосфорилювання ATF-2 хлорогеновою кислотою узгоджується зі зниженими рівнями циклічного АМФ у клітинах HGT-1. Імовірно, транскрипція генів, пов'язаних із секрецією кислоти шлункового соку, також активується іншими шляхами і факторами транскрипції, а не передачею сигналів циклічного АМФ, оскільки кофеїн і хлорогенова кислота викликають сильне збільшення експресії H+,K+АТФази. Однак, індукована N-метилпіридинієм експресія рецептора соматостатину може бути підтримана як циклічним АМФ, так і активацією ATF-2. Секреторний потенціал. Внутрішньоклітинний протонний індекс (IPX) спочатку вимірювали для оцінки стимулюючого потенціалу окремо взятих сполук, повної рекомбінації і різних рекомбінацій, що не містять жодної з шести сполук. IPX дозволяє одержати інформацію про внутрішньоклітинну концентрацію протонів у порівнянні з необробленими клітинами. Більш 17 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 негативне значення IPX, ніж у контрольних клітин, вказує на більш високу секреторну активність, якщо припустити, що внутрішньоклітинний pН тимчасово зростає внаслідок секреції протонів. Величина зміни pН, однак, знаходиться в діапазоні фізіологічних значень, але є вимірною. Гістамін викликав сильну стимуляцію секреторної функції, на що вказує значення IPX, рівне -1,15±0.04 (двосторонній t-критерій, p < 0.01; n=4; Фіг. 11A). Цей результат підтверджується результатами вимірювань у камері Уссінга, де гістамін підвищував секрецію до 2 39 мкА/см (Фіг. 11B), яка пізніше інгібувалась омепразолом, специфічним інгібітором H+,K+2 АТФази, і потім поверталася на контрольний рівень (77 мкА/см , Фіг. 11B). Ефект хлорогенової кислоти був сильно антисекреторним. Як виміряне істотно позитивне значення IPX (0,17±0.02; двосторонній t-критерій, p < 0.001; n=7; Фіг. 11A), так і знижений струм у камері Уссінга (-76 2 мкА/см , Фіг. 11C), дозволяють припустити наявність інгібувального ефекту хлорогенової кислоти на функціональному рівні in vitro. Рекомбінація всіх сполук, крім хлорогенової кислоти, також указує на анти-синергічний ефект хлорогенової кислоти при повній рекомбінації, оскільки величина IPX (0.02±0.01) значно зменшується (двосторонній t-критерій, p < 0.001; n=7; Фіг. 11, A). На відміну від цього, кофеїн стимулює секрецію з величиною IPX, рівною -0.09±0.04 (двосторонній t-критерій, p < 0.01; n=7; Фіг. 11, A). Секреторна активність була підтверджена 2 збільшенням струму до 16 мкА/см (Фіг. 11C). Окремо взятий N-метилпіридиній зовсім не впливає на IPX (Фіг. 11A) або струм (графік не наведений). Тому, при додаванні в базальний 2 2 компартмент камери Уссінга він призводить до зменшення струму з 16 мкА/см до -5 мкА/см (Фіг. 11C), якщо перед цим в апікальний компартмент був доданий кофеїн. Комбінація кофеїну з N-метилпіридинієм призводить до зниженого IPX, рівного 0,03±0.06, що несуттєво відрізнялося як від контрольного рівня, так і від ефекту окремо взятого кофеїну (результати не наведені). Найбільш сильний ефект рекомбінації був визначений для катехіну. Величина IPX для окремо взятого катехіну вказує на наявність стимулюючого ефекту на клітини HGT-1 (-0.04±0.02; двосторонній t-критерій, p.0.05; n=7; Фіг. 11, A). Рекомбінація всіх сполук, що не містять катехін, продемонструвала найвищою мірою значну зміну до позитивного значення IPX, рівного 0,12±0.02 (двосторонній t-критерій, p≤0.001; n=7; Фіг. 11, A). Як показує визначення IPX катехіну, який був значущим, але не настільки сильним, як для гістаміну або кофеїну, струм, викликаний апікальною обробкою клітин HGT-1 катехіном, був відносно гладким у порівнянні зі стимуляцією кофеїном або гістаміном (Фіг. 11 A, C, D). Таким чином, ефект катехіну, очевидно, більш синергічний, ніж вплив окремо взятої сполуки. Випробування не показали для C5HT значної зміни IPX у порівнянні з контрольними клітинами, однак окремо взятий C5HT демонстрував тенденцію до значимості з p-значенням, рівним 0.07. Це підтверджується вимірюваннями струму після апікальної обробки клітин HGT-1 за допомогою C5HT, що призводить до 2 збільшення струму до 70 мкА/см після додавання (Фіг. 11E). Нарешті, були проведені випробування пірогалолу, який продемонстрував антисекреторну активність зі значним позитивним значенням IPX, рівним 0.05±0.02, у порівнянні з контрольними клітинами (двосторонній t-критерій, p < 0.05; n=7; Фіг. 11, A). Вимірювання струму спричинило зниження до 2 -24 мкА/см після апікальної обробки клітин HGT-1. Повна рекомбінація, однак, не продемонструвала значної зміни IPX у порівнянні з контрольними клітинами, що підтверджує гіпотезу про синергічні і анти-синергічні ефекти в багатокомпонентних розчинах. Таблиця 2 Вхідні і вихідні змінні для розрахунку нейронної мережі для експресії рецепторів N-MP Контроль N-MP CA CAFF CAT C5HT PYR Всі CA 0 100 0 0 0 0 0 100 0 0 100 0 0 0 0 100 Окремі Сполуки CAFF CAT C5HT PYR 0 0 0 100 0 0 0 100 0 0 0 0 100 0 0 100 18 0 0 0 0 0 100 0 100 0 0 0 0 0 0 100 100 Рецептори HRH2 CHRM3 SSTR2 100 % 137 % 103 % 138 % 118 % 117 % 107 % 263 % 100 % 138 % 156 % 190 % 139 % 119 % 151 % 99 % 100 % 129 % 96 % Вхідні 103 % змінні 120 % 98 % 90 % 111 % UA 108356 C2 Продовження таблиці 2 N-MP 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 N-MP/CA N-MP/CAFF N-MP/CAT N-MP/C5HT N-MP/PYR N-MP/CA/CAFF N-MP/CAT/CA N-MP/C5HT/CA N-MP/PYR/CA N-MP/CA/CAFF/CAT N-MP/C5HT/CA/CAFF N-MP/PYR/CA/CAFF N100 MP/CA/CAFF/CAT/C5HT N-MP/PYR/CA/CAFF/CAT 100 CA/CAFF 0 CA/CAT 0 CA/C5HT 0 CA/PYR 0 CA/CAFF/CAT 0 CA/CAFF/C5HT 0 CA/CAFF/PYR 0 CA/CAFF/CAT/C5HT 0 CA/CAFF/CAT/PYR 0 CA/CAFF/CAT/PYR/C5HT 0 5 CA 100 0 0 0 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Окремі Сполуки Рецептори CAFF CAT C5HT PYR HRH2 CHRM3 SSTR2 0 0 0 0 107 % 129 % 113 % 100 0 0 0 186 % 223 % 134 % 0 100 0 0 181 % 235 % 134 % 0 0 100 0 135 % 142 % 93 % 0 0 0 100 165 % 155 % 80 % 100 0 0 0 107 % 148 % 115 % 0 100 0 0 147 % 241 % 164 % 0 0 100 0 154 % 175 % 97 % 0 0 0 100 157 % 148 % 92 % 100 100 0 0 101 % 156 % 125 % 100 0 100 0 137 % 166 % 84 % 100 0 0 100 142 % 149 % 105 % Вихідні змінні 100 100 100 0 90 % 133 % 121 % 100 100 0 0 0 100 100 100 100 100 100 100 0 100 0 0 100 0 0 100 100 100 0 0 0 100 0 0 100 0 100 0 100 100 0 0 0 100 0 0 100 0 0 0 179 % 162 % 89 % 62 % 69 % 36 % 72 % 79 % 35 % 54 % 59 % 29 % 66 % 78 % 31 % 74 % 90 % 59 % 91 % 90 % 51 % 57 % 73 % 111 % 79 % 84 % 223 % 89 % 106 % 266 % 86 % 101 % 193 % Аналіз методом нейронної мережі генної експресії рецепторів HRH2, CHRM3 і SSTR2 показав, що рецептор-специфічною сполукою, що чинить найменший вплив, був катехін, пірогалол і C5HT відповідно (Таблиця 3). Однак, дані вказують на сполука-специфічну регуляцію індивідуальних рецепторів, оскільки для генної експресії HRH2-рецептора кофеїн був найбільш значимим, у той час як на генну експресію рецептора CHRM3 найбільшою мірою впливала хлорогенова кислота. Для рецептора SSTR2 хлорогенова кислота і кофеїн були рівною мірою важливі і також досягали найвищої частоти. 10 Таблиця 3 Значимість індивідуальних компонентів кави в нейронних мережах для генної експресії рецепторів HRH2, CHRM3 і SST2. R позначає лінійну кореляцію між виміряним значенням і прогнозом нейронної мережі. NMP CS COFF CAT 5HT PYR 15 HRH2 0,94 0,79 1,00 0,29 0,50 0,71 R=0,94 CHRM3 0,91 1,00 0,82 0,59 0,68 0,23 R=0,94 SSTR2 0,96 1,00 1,00 0,96 0,25 0,83 R=0,80 Усі сполуки використовувалися в концентраціях, аналогічних тим, у яких вони присутні у звичайному кавовому напої. У нашому багатопараметричному підході ми досліджували ефект цих сполук на відомі дотепер гени, передавачі сигналів і функціональні аспекти секреції кислоти шлункового соку. Крім того, ми застосували моделювання нейронних мереж для ідентифікації сполук, які є найбільш важливими для генної експресії про- і антисекреторних рецепторів. 19 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Однак, наші результати для окремо взятих сполук на рівень генної регуляції відповідали, за одним виключенням, результатам вимірювань для повної рекомбінації. Вперше було показано, що N-метилпіридиній і пірогалол знижуюче регулюють ключового гравця секреції кислоти шлункового соку – H+,K+-АТФазу – і протидіють кофеїну і хлорогеновій кислоті, які підвищувально, майже в два рази, регулюють цей ген. У експериментах з рекомбінацією як Nметилпіридиній, так і пірогалол компенсували ефект підвищувальної регуляції кофеїну і хлорогенової кислоти, як і повна рекомбінація всіх сполук. Просекреторний ацетилхоліновий рецептор M3 піддавався підвищувальній регуляції пірогалолом, хлорогеновою кислотою і Nметилпіридинієм. N-метилпіридиній згодом знижувально регулював цей рецептор після 20 хвилин таким же чином, як повна рекомбінація всіх сполук впливала на експресію цього рецептора. Додатково, пірогалол також знижувально регулював цей рецептор у момент часу 15 хвилин після сильної підвищувальної регуляції в момент часу п'ять хвилин. Таким чином, після 20 хвилин імовірно спостерігається комбінований ефект. Додатково, антисекреторний соматостатиновий рецептор 2 піддавався сильній понижувальній регуляції C5HT, що може призводити до зниженої сприйнятливості паріетальних клітин до передачі антисекреторних сигналів in vivo. На відміну від цього, N-метилпіридиній збільшував експресію цього рецептора більше, ніж удвічі. Комбінація обох сполук давала рівні експресії, незначні в порівнянні з контролем. У такий же спосіб повна рекомбінація всіх сполук регулює антисекреторний соматостатиновий рецептор. Узагальнюючи ці результати, вкажемо, що N-метилпіридиній, очевидно, чинив на всі важливі гени, за винятком гістамінового рецептора, антисекреторний вплив. Пірогалол рівною мірою впливає на H+,K+-АТФазу і, разом із N-метилпіридинієм, імовірно, на ацетилхоліновий рецептор M3. Оскільки C5HT, сильно знижуючи, регулює антисекреторний соматостатиновий рецептор і компенсує ефект підвищувальної регуляції N-метилпіридинію, C5HT може підтримувати підвищену секрецію кислоти шлункового соку після вживання кави in vivo. На відміну від цього, C5HT знижуючи регулює експресію H2-гістамінового рецептора в гігантському ступені після п'яти хвилин, у той час як хлорогенова кислота викликала підвищувальну регуляцію після 15 хвилин. Рекомбінація всіх сполук, однак, продемонструвала нормальний рівень експресії після п'яти хвилин, але збільшення експресії до більше, ніж 2-кратного, після 10 хвилин. У цьому випадку залишається незрозумілим, чому комбінований ефект викликає підвищувальну регуляцію експресії H2-рецептора. Нейронна мережа припускає найвищу значимість при експресії H2-гістамінового рецептора для кофеїну, хлорогенової кислоти і N-метилпіридинію. Різні комбінації окремо взятих сполук продемонстрували, що збільшення складності розчинів призводить до показників значимості, відмінних від тих, на які вказують окремо взяті сполуки. Так, знижуючий ефект C5HT на експресію M3-ацетилхолінового рецептора навіть підсилювався при спільній інкубації з хлорогеновою кислотою. Ефект окремо взятої хлорогенової кислоти не був настільки сильним, щоб вказувати його домінуючий вплив у порівнянні з C5HT. Проте, нейронна мережа ідентифікувала хлорогенову кислоту як таку, що має найвищу значимість для зміни експресії ацетилхолінового рецептора M3 у багатокомпонентних розчинах, рівну 100 %. Nметилпіридиній був ідентифікований як сполука, що має другу за величиною значимість, рівну 91 %. Однак, N-метилпіридиній продемонстрував ефект понижувальної регуляції на експресію ацетилхолінового рецептора M3 як окремо взята сполука. Ці результати підтверджуються високими R-значеннями кореляції розрахованих сценаріїв і експериментальних даних. Оскільки жодна окремо взята сполука, а також повна рекомбінація всіх досліджених сполук не продемонстрували сильного впливу на експресію H2-гістамінового рецептора або на ацетилхоліновий рецептор M3 після 10 хв., нейронна мережа служить потужним інструментом ідентифікації синергічного і анти-синергічного ефектів. З точки зору трансдукції сигналу, активація EGFr, Akt1 і ERK1/2 продемонструвала диференційований характер. Дотепер вважалося, що EGFr підсилює секрецію кислоти шлункового соку і може також частково активуватися гістаміном. Наші результати підтримують цю гіпотезу. Таки самим чином діють кофеїн, хлорогенова кислота і C5HT, а також повна рекомбінація. Цікаво, що в попередніх дослідженнях кавовий напій із високим вмістом хлорогенової кислоти і кофеїну, але низьким N-метилпіридинію, також активували EGFr, але напої з високим отриманням N-метилпіридинію не активують цей рецептор. Наступна передача сигналів EGFr включає передачу сигналів Akt1 і ERK1/2. Припускається, що Akt1 підвищує експресію H+,K+-АТФази і збільшує секреторну активність. Усі сполуки, за винятком гістаміну і хлорогенової кислоти, активують передачу сигналів Akt1. Так само поводить себе повна рекомбінація всіх сполук. Навпаки, передача сигналів ERK1/2, яка ймовірно гостро інгібує шлункову секрецію, активувалася тільки N-метилпіридинієм. Крім того, повна рекомбінація зменшувала передачу сигналів ERK1/2 нижче контрольного рівня. Було показано, що на 20 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 циклічний АМФ і споріднений фактор транскрипції ATF-2, специфічно не впливає жодна з досліджуваних сполук, хоча гістамін підвищує клітинні концентрації циклічного АМФ і активацію ATF-2. N-метилпіридиній діє таким самим чином. Оскільки ефект N-метилпіридинію був скоріше антисекреторним, підвищені рівні цАМФ і активація ATF-2 можуть бути пов'язані з підвищеною експресією антисекреторного соматостатинового рецептора. Крім того, хлорогенова кислота знижувала рівні циклічного АМФ і не активувала ATF-2 і, крім того, була асоційована зі зниженою секреторною активністю клітин HGT-1. Секреторна активність характеризувалася вимірюваннями внутрішньоклітинного pН і експериментами з камерою Уссінга. Кофеїн, катехін і C5HT стимулювали секрецію, у той час як хлорогенова кислота і пірогалол призводили до зниження секреції. N-метилпіридиній зовсім не впливав на внутрішньоклітинний pН або секрецію в експериментах з камерою Уссінга. Таким чином, він продемонстрував контррегулюючий ефект на індуковану кофеїном секрецію. Узагальнюючи наші результати, вкажемо, що біологічний ефект окремо взятої сполуки завжди може відрізнятися від ефекту цієї ж сполуки в складних розчинах. Наші результати підтримують гіпотезу про синергічні і анти-синергічні взаємодії різних компонентів. Приклад 3: Кількісний аналіз NMP і 5CHT у зразках кави N-алканоїл-5-гідрокситриптаміди (C5HT) і N-метилпіридиній (NMP) були кількісно проаналізовані в ряді зразків кави з різними ступенями обсмажування і різною попередньою обробкою. Було відзначено, що концентрація NMP у кавовому напої зростала зі збільшенням ступеня обсмажування. Концентрація C5HT у кавовому напої зменшувалася зі збільшенням ступеня обсмажування. Декофеїновані і депарафіновані зразки кави демонстрували значно більш низький вміст C5HT у порівнянні з необробленими зразками. Кількісний аналіз. Були кількісно визначені N-алканоїл-5-гідрокситриптамід (C5HT) і Nметилпіридиній (NMP) у зразках кави. Коди зразків були замінені на легко зрозумілі скорочені найменування для кращого розуміння (Таблиця 4). Таблиця 4 Опис позначень проаналізованих зразків кави Позначення сирої кави необроблена декофеїнована депарафінована 30 35 40 45 Columbia 50006 Columbia 26902A 26902 A+26831 A Columbia 50006 Columbia 26902 A Ступінь обсмажування 50, 80, 110 Skt (поділів шкали) 50, 80, 110 Skt 50, 80, 110 Skt 50, 80, 110 Skt 50, 80 Skt Скорочене позначення "необроблена Co 5" "необроблена Co 2" "декофеїнована 2+2" "декофеїнована Co 5" "депарафінована Co 2" Для кількісного аналізу N-алканоїл-5-гідрокситриптамідів (C5HT) аліквоту щойно приготованого кавового напою змішують із міченими дейтерієм внутрішніми стандартами і розбавляють метанолом після урівноважування. Охолодження і центрифугування дає забарвлений у коричневий колір осад і жовтувату надосадову рідину, яку вводять у систему ВЕРХ-МС/МС без додаткової обробки. На Фіг. 16 наведені результати типового аналізу. Терміни "Skt" і "поділки шкали" використовуються тут синонімічно. Хоча проаналізовані кавові напої демонстрували по суті однакові тенденції для концентрацій NMP і C5HT залежно від ступеня обсмажування (у поділах шкали), у напої депарафінованого Columbia 2 (позначений на Фіг. 15) при середньому ступені обсмажування був визначений сильно збільшений вміст (+60 %) NMP у порівнянні з іншими зразками. Цю каву (депарафіновану Co 2, 80 Skt) та її необроблений аналог використовують для експериментів імпульсним уведенням NMP. За кількісними даними для кожного зразка кави розраховують безрозмірний показник, що являє собою частку від ділення концентрації NMP (мг/л) і концентрації C5HT (мкг/л) × 100. Цей запропонований показник, як припускається, візуально ілюструє відношення C5HT до NMP. Крім даних зразків, на Фіг. 16 для порівняння наведені дані для комерційно доступних марок кави, отримані в попередніх дослідженнях. Можна побачити на основі запропонованого показника, що депарафінована Columbia 2, обсмажена при 80 поділів шкали, надзвичайно сильно відрізняється від порівняльних зразків. При цьому було отримано надзвичайне значення відношення концентрацій NMP і C5HT без досягнення дуже темного забарвлення при обсмажуванні. 21 UA 108356 C2 5 Підмішування N-метилпіридинію до кавового напою. Стандартизовані кавові напої були приготовані зі зразків "необробленої Columbia 2, 80 Skt" і "депарафінованої Columbia 2, 80 Skt". Стандартний розчин N-метилпіридинію йодиду був підмішаний до напою, приготованому з депарафінованої обсмаженої кави, з отриманням вмісту NMP, рівного +100 %, +200 % і +300 % у порівнянні з власним вмістом NMP у суміші. Після ліофілізації, зразки піддають додатковій обробці. Таблиця 5 Концентрації NMP у кавових напоях із добавками Зразок необроблений Columbia 2 депарафінований Columbia 2 10 15 20 25 30 35 40 45 + Доданий NMP (мг/л) 29,5 (+100 %) 59,8 (+200 %) 89,3 (+300 %) Кінцева концентрація NMP (мг/л) 15,4 27,5 57,0 87,3 116,8 + Приклад 4: Секреція протонів у шлункових клітинах у відповідь на NMP і тригонелін Далі різні кількості N-метилпіридинію додавали до двох обраних марок кави. Додатково був охарактеризований тригонелін як речовина-прекурсор N-метилпіридинію, у вигляді окремо взятої речовини, за його впливом на секрецію протонів шлунковими клітинами людини in vitro. Клітинна культура. Для in vitro експериментів використовують пухлинну клітинну лінію HGT-1 (клітинна лінія пухлини шлунка людини). Клітини виділяють із первинної пухлини шлунка людини у віці 60 років. Клітинна лінія HGT-1 (клон 6) була отримана Dr. Laboisse (Laboratory of Pathological Anatomy, Nantes, France) в 1982 р. Клітинна лінія росла адгерентно і мікроскопічно проявляла ромбічну морфологію, характерну для епітеліальних клітин. Клітинну лінію культивують у інкубаторі при 37 °C і 5 % CO2. Як культуральне середовище використовується "середовище Ігла, модифіковане за Дульбекко", яке не містить глутаміну, з добавкою: 20 % фетальної телячої сироватки 2 % пеніциліну/стрептоміцину 2 % глутаміну Для мінімізації впливу фізіологічно активних компонентів фетальної телячої сироватки еквівалентне середовище використовується для культивації протягом 24 год. перед проведенням експерименту, але без додавання сироватки. Культивацію клітин HGT-1 2 проводять у колбах для клітинних культур (75 см ) або на планшетах для клітинних культур (6лункових, 24-лункових, 6-SNAP-well). Число клітин, використовуваних для індивідуальних експериментів, а також додаткові подробиці, що стосуються проведення індивідуальних експериментів, наведені більш детально у відповідному розділі. Вимірювання секреції шляхом визначення внутрішньоклітинного pН. Вимірювання внутрішньоклітинного pН проводиться методом проточної цитометрії. Внутрішньоклітинний pН жорстко регулюється в діапазоні значень pН від 6,8 до 7,4. Великі за величиною відхилення компенсуються внутрішньоклітинним протеїнатним буфером. Внутрішньоклітинний pН може + бути використаний як індикатор переносу йонів H через клітинну мембрану. Сумарний + транспорт йонів H із внутрішньоклітинного в позаклітинне середовище призводить до короткочасного підвищення внутрішньоклітинного pН і зниження внутрішньоклітинної + концентрації іонів H відповідно. Експерименти проводять наступним чином. Клітини HGT-1 промивають попередньо 6 підігрітим PBS і потім зіскоблюють в 5 мл PBS і ресуспендують. Суспензію доводять до 1×10 життєздатних клітин на мл і поміщають по 2 мл кожної суспензії клітин у пробірки для FACS. Після цього клітини центрифугують при 1000 об/хв. протягом 5 хв., надосадову рідину відкидають, осад ресуспендують у 2 мл кожного з попередньо підігрітих зразків розчину при 37 °C і інкубують при 37 °C протягом 10 хв. Після нового центрифугування відбирають зразок розчину, клітини ресуспендують у 2 мл попередньо приготованого розчину 3 мкМ SNARF-AM і поміщають на лід на 30 хв. Розчин барвника видаляють новим центрифугуванням і осад клітин ресуспендують в 1 мл холодного PBS. Під час проведення вимірювань FACS зразки тримають на льоду. Для побудови калібрувальної кривої 500 мкл кожного калібрувального буферного розчину з установленим значенням pН (20 ммоль/л NaCI, 110 ммоль/л KCI, 1 ммоль/л CaCI2, 1 22 UA 108356 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ммоль/л MgSO4, 18 ммоль/л D-Глюкози і 20 ммоль/л HEPES) поміщають у пробірки для FACS разом із 1 мкл нігерицину. Для каліброваної кривої три додаткові пробірки наповнюють відрегульованою суспензією клітин і інкубують у PBS. Після забарвлення SNARF-AM клітини ресуспендують у 20 мкл холодного PBS і по 5 мкл кожного зразка поміщають у підготовлені калібрувальні пробірки. Вимірювання виконують аналогічно до зразків. Результати вимірювань представляють у вигляді ратіометричного відношення медіани результатів підрахунку для двох максимумів випромінювання барвника при 580 нм і 640 нм і визначають внутрішньоклітинний pН за допомогою калібрувальної кривої. Для представлення результатів був розроблений внутрішньоклітинний протонний індекс. Він розраховується + шляхом log2-перетворення відносного показника внутрішньоклітинної концентрації іонів H для обробленого зразка і необробленого контролю. Чим нижча величина індексу, тим більше протонів переміщається. Вимірювання секреції за величиною трансепітеліального струму. Для вимірювання йонних струмів у моношарі клітин HGT-1 використовують камеру Усінга виробництва фірми HarvardApparatus. Для реєстрації струму і напруги використовують інтерфейс виробництва фірми KMSI. По суті, вона складається з двох компартментів - апікальної і базальної камер. Між двома камерами може бути закріплений затискачем зразок тканини або клітин, які культивуються на спеціальній мембрані. При проведенні експериментів камера може підтримуватися при 37 °C за допомогою термостата. Для підготовки експерименту клітини HGT-1 культивують на мембранних вкладках SNAP-well. Для проведення експерименту висівають 100000 клітин на лунку. Цілісність моношару клітин перевіряють шляхом визначення трансепітеліального опору за допомогою камери ENDOHM і мікроскопічним контролем. Вкладку SNAP-well розміщають між двома камерами за допомогою спеціальної рамки. При проведенні вимірювань можна прикладати певний струм або напругу за допомогою інтерфейсу з використанням двох електродів напруги і двох - струму (AgCI-Електроди), розміщених по обидва боки від вкладки SNAP-well. Для вимірювання йонних струмів вибирають режим короткого замикання (l SC). Для цього встановлюють напругу 0 вольт. Оскільки електричний потенціал на моношарі клітин виникає завдяки активному і дифузія-залежному переносу зарядів, то за допомогою електродів установлюється точне значення струму, що створює потенціал, рівний 0 мВ. Частоту прикладеного струму вибирають таким чином, щоб за короткий період часу могло відбуватися наростання потенціалу. Таким чином, вимірювані струми є мірою транспортних подій, що відбуваються. Для визначення специфічності транспортних подій використовуються певні інгібітори, для яких відомий інгібувальний переносник або канал. Таким чином, можуть бути визначені переносники або йонні канали, відповідальні за зміну кривої струму після застосування речовини, ефект якої потрібно визначити. У експериментах, поставлених у рамках даних досліджень, становила інтерес активність H+,K+-АТФази. Гістамін є фізіологічним + + подразником даного H /K -обмінника. Фармакологічним інгібітором, що селективно зв'язується з функціональною субодиницею цього протонного насоса, є омепразол. Підготовка зразків. Для підготовки експерименту були обрані Arabica Columbia 2, ** необроблена, 80 поділів шкали (Col2) і Arabica Columbia 2 , депарафінована, 80 поділів шкали ** ** (Col2 ). Каву заварювали стандартними способами. Arabica Columbia потім збагачували 2,95 мг/100 мл, 5,8 мл/100 мл або 8,93 мг/100 мл N-метилпіридинію. Кавові напої ліофілізували для експериментів із клітинними культурами. Для експериментів використовують каву з концентрацією фосфатного буфера, рівною 2,5 мг/мл. Для характеризації тригонеліну використовують концентрацію відповідно до "Lehrbuch der Lebensmittelchemie" (497 мкм). Гістамін використовують у всіх експериментах з концентрацією 1 мм. Усі речовини і ліофілізати кави готують у фосфатному буфері (PBS). Вплив збагаченої кави на секрецію. Клітини HGT-1 можуть у значній мірі стимулюватися гістаміном у порівнянні з контролем (-0,38±0.06; p ≤ 0.001). Досліджувана кава демонструвала повністю ослаблений секреторний потенціал у порівнянні з гістамін-стимульованими клітинами. ** Col2 (-0,21±0.02) стимулював секреторну активність значно сильніше, ніж Col2 (0.09±0.03) (p < ** 0.05). Кава Col2 , збагачена N-метилпіридинієм, демонструвала більш слабкий ефект, ніж Col2. ** 3-кратне збагачення N-метилпіридинієм (+8,93 мг/100мл) Col2 призводило до значно (p < ** 0.001) більш слабкої секреторної активності (0,19±0.03) у порівнянні з Col2 . Однак, збагачення ** Col2 з використанням 5,98/100 мл N-метилпіридинію вже призводить до значно більш слабкої ** секреції (0.03±0.01) у порівнянні з Co (p < 0.05) (Фіг. 17). Експерименти на клітинних культурах із кави, збагаченої N-метилпіридинієм, можуть підтвердити інгібувальний ефект N-метилпіридинію на секреторний потенціал кавових напоїв. Додатково можна показати, що обробка Col2 призводить до ослаблення секреторного 23 UA 108356 C2 ** 5 10 15 потенціалу отриманого продукту Col2 у порівнянні з початковим продуктом. Вплив тригонеліну на секрецію. N-метилпіридиній утворюється в результаті піролітичного декарбоксилювання тригонеліну. Внаслідок цього був продемонстрований вплив окремо взятої речовини тригонеліну на секреторну активність клітин HGT-1. Гістамін значно стимулює секрецію (-0,67±0.06; p ≤ 0.001). Інкубація з тригонеліном призводить до значного зниження секреторної активності в порівнянні з контролем (0,46±0.04; p < 0.001) (порівн. Фіг. 18). Експеримент із визначення концентрація-залежного ефекту тригонеліну показав наявність значимого взаємозв'язку. Може бути продемонстроване ступінчасте зниження інгібувального ефекту тригонеліну в діапазоні концентрацій 4970, 497, 49,7, 4,97 мкм. Величина IPX знижувалася з 0,7 після обробки клітин найвищою концентрацією, рівною 4870 мкм, до -0,4 після обробки концентрацією, рівною 4,97 мкм (Фіг. 19). Інгібувальний ефект тригонеліну на секрецію в порівнянні з контролем можна також підтвердити за допомогою експериментів із дифузійною камерою. Після застосування розчину 2 тригонеліну з концентрацією 497 мкМ, струм короткого замикання зменшувався з +2 мкА/см до 2 -25 мкА/см . На відміну від цього, N-метилпіридиній у вигляді окремо взятої речовини не проявляв детектованого ефекту на струм короткого замикання (Фіг. 20). ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 20 25 30 35 40 1. Спосіб одержання збагаченого N-метилпіридинієм (NMP) екстракту тригонелінвмісного органічного матеріалу, що включає стадії, на яких: (a) депарафінують тригонелінвмісний органічний матеріал; (b) обсмажують тригонелінвмісний органічний матеріал; (c) обробляють обсмажений тригонелінвмісний органічний матеріал гарячою водою для одержання водного екстракту; і (d) додають NMP до водного екстракту. 2. Спосіб за п. 1, у якому ступінь обсмажування тригонелінвмісного органічного матеріалу після обсмажування на стадії (b) становить щонайменше 50 поділів шкали. 3. Спосіб за п. 1 або 2, у якому на стадії (d) до водного екстракту додають щонайменше 2,95 мг NMP/100 мл. 4. Спосіб за будь-яким із пп. 1-3, у якому кінцевий NMP-збагачений екстракт містить щонайменше 23 мг/л NMP. 5. Спосіб за будь-яким із пп. 1-4, у якому співвідношення NМР/N-алканоїл-5-гідрокситриптамід (С5НТ) х 100 у кінцевому NMP-збагаченому екстракті становить щонайменше 100. 6. Спосіб за будь-яким із пп. 1-5, у якому тригонелінвмісний органічний матеріал вибирають із групи, що складається з кави, зокрема Coffea arabica, Coffea canephora, Coffea spp. і Psilanthus spp., членів Fabaceae, зокрема Pisum sativum, Glycine max, Phaseolus vulgaris, Lens culinaris, Cicer arietinum і Trigonella foenum-graecum, членів Chenopodiaceae, зокрема Chenopodium quinoa, і членів Роасеае, зокрема Avena sativa. 7. Спосіб за будь-яким із пп. 1-6, у якому тригонелінвмісний органічний матеріал являє собою Coffea arabica, provenience Columbia або Coffea arabica, provenience Brazil. 24 UA 108356 C2 25 UA 108356 C2 26 UA 108356 C2 27 UA 108356 C2 28