Спосіб визначення загального вмісту поліфенолів

Реферат: Спосіб визначення загального вмісту поліфенолів, що включає обробку об’єкту силікагелем, модифікованим реактивом Фоліна та функціоналізованим тетрадециламонію нітратом, в середовищі Nа2СО3 і наступне твердофазно-спектрофотометричне детектування у тонкому шарі. UA 101250 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Запропонований спосіб належить до аналітичної хімії, зокрема до комбінованих спектрофотометричних методів визначення поліфенолів і може бути використаний при аналізі біодобавок, напоїв та харчових продуктів. В цій галузі прийнято використовувати такі терміни і скорочення: ГПК - гетерополікислота. РФ - реактив Фоліна. ТДАН - тетрадециламонію нітрат. ТДАН-СГ - силікагель, модифікований ТДАН. РФ-ТДАН-СГ - силікагель, модифікований ТДАН та РФ. ТСФ - твердофазна спектрофотометрія. ГГ - градуювальний графік. Відомий спосіб спектрофотометричного визначення загального вмісту поліфенолів, який полягає в тому, що як окисно-відновний реагент застосовують реактив Фоліна-Чокальте [1, 2]. Основним недоліком вказаних способів визначення поліфенолів є незадовільна відтворюваність, що зумовлена псевдоколоїдним станом відновлених форм ГПК у розчині. Найбільш близьким до запропонованого способу є твердофазно-спектрофотометричний метод який заключається в тому, що закріплений на кремнеземі макроциклічний комплекс Купруму та тетрабензо [b, f, j, n] [1, 5, 9, 13] тетраазоциклогексадецину обробляють розчином поліфенолу в середовищі карбонатного буферного розчину (рН=10,5±0,1) [3, 4]. Градуювальний графік для визначення кверцетину запропонованим методом лінійний в межах 40-240 мг/л, а межа виявлення кверцетину розрахована за 3s критерієм становить 15 мг/л. Основним недоліком цього методу є те, що він передбачає попередній синтез модифікатора - комплексу купруму (II). В основу винаходу поставлена задача підвищити чутливість та вибірковість визначення поліфенолів, які проявляють антиоксидантні властивості у біодобавках та напоях. Поставлена задача вирішується за рахунок того, що спосіб визначення включає відновлення іммобілізованого на сорбенті РФ розчином поліфенолу у ≥0,35 моль/л розчині Na 2CO3 з наступним детектуванням світлопоглинання сорбенту у тонкому шарі (1=1 см) методом ТСФ. Як сорбент, використовують силікагель марки SG-60, модифікований тетрадециламонію нітратом (ТДАН-СГ). Градуювальний графік, що використовують для визначення загального вмісту поліфенолів, лінійний у діапазоні концентрацій 3-30 мг/л та 25-230 мг/л при використанні як речовинистандарту кверцетину та таніну відповідно. Рівняння градуювальних графіків (ГГ) мають вигляд: А=(0,048±0,002)+(5,4±0,1)Скверцетину (г/л), А=(0,47±0,01)+(2,1±0,2)Станіну (г/л). Використання способу, що заявляється, дає змогу підвищити чутливість визначення поліфенолів (MB кверцетину (таніну) становить 1 (14) мг/л) та покращити вибірковість визначення відносно аскорбінової кислоти. Застосування ТСФ методу на основі РФ іммобілізованого на модифікованому ТДАН силікагелі, для визначення суми поліфенолів у літературі не відомо, що дозволяє вважати запропонований спосіб таким, що відповідає критеріям „новизна" та „винахідницький рівень". Винахід ілюструється наступними прикладами, які не обмежують обсяг правової охорони: Приклад 1 Модифікація ТДАН-СГ реактивом Фоліна. До 1,000 г модифікованого ТДАН силікагелю додають 5 мл водного розчину реактиву Фоліна, перемішують магнітною мішалкою впродовж 10 хв, тричі промивають дистильованою водою та висушують на повітрі при кімнатній температурі. Ємність одержаного у такий спосіб сорбенту відносно РФ становить 8,3 мкмоль/г. Приклад 2 Вибір оптимальної довжини хвилі реєстрації аналітичного сигналу. Для вибору оптимальної довжини хвилі в стакан ємністю 25,0 мл вводять аліквоту стандартного (640 мг/л) водно-етанольного (2:1) розчину кверцетину, 2,5 мл 1 моль/л розчину Na2CO3 та водно-етанольну суміш (2:1) до загального об'єму 5 мл; додають 0,1 г модифікованого сорбенту та перемішують магнітною мішалкою протягом 15 хв. Сорбент відокремлюють, послідовно промивають трьома порціями дистильованої води, переносять у кювету та вимірюють світлопоглинання у тонкому шарі (1=0,1) в діапазоні довжин хвиль 400-996 нм. Максимум світлопоглинання РФ-ТДАН-СГ після обробки розчином кверцетину спостерігається при довжині хвилі 750 нм. Приклад 3 Вибір оптимального часу взаємодії РФ-ТДАН-СГ з розчином поліфенолу. 1 UA 101250 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В шість хімічних стаканів ємністю 25,0 мл вносять аліквотні частини стандартного розчину кверцетину (таніну), концентрацією 604,0 (640) мг/л, по 2,5 мл 1 моль/л розчину Na 2CO3 та доводять до загального об'єму 5 мл; додають по 0,1 г модифікованого сорбенту та перемішують магнітною мішалкою протягом 1, 2, 5, 10, 15 та 20 хв. Сорбенти відокремлюють, послідовно промивають трьома порціями дистильованої води, переносять у кювету та вимірюють світлопоглинання у тонкому шарі (1=0,1) при довжині хвилі 750 нм. Оптимальний час взаємодії РФ-ТДАН-СГ з таніном становить 1 хв, а з кверцетином - 10 хв. Приклад 4 Вибір оптимального співвідношення об'єму розчину поліфенолу до маси РФ-ТДАН-СГ. В п'ять хімічних стаканів ємністю 25,0 мл вносять по 1 мл стандартного водно-етанольного (2:1) розчину кверцетину, концентрацією 604,0 мг/л, по 2,5 мл 1 моль/л розчину Nа 2СО3 та водно-етанольну суміш до загального об'єму 2, 5, 10, 20 та 50 мл; додають по 0,1 г модифікованого сорбенту та перемішують магнітною мішалкою протягом 1, 2, 5, 10, 15 та 20 хв. Сорбенти відокремлюють, послідовно промивають трьома порціями дистильованої води, переносять у кювету та вимірюють світлопоглинання у тонкому шарі (1=0,1) при довжині хвилі 750 нм. Аналітичний сигнал залишається сталим при співвідношенні об'єму розчину і маси РФТДАН-СГ  70 мл/г. Приклад 5 Встановлення оптимальної концентрації розчину карбонату натрію. В п'ять хімічних стаканів ємністю 25,0 мл вносять по 0,25 мл стандартного водноетанольного (2:1) розчину кверцетину, концентрацією 604,0 мг/л, по 2,5 мл розчину Na 2CO3, концентрацією 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,7; 1 моль/л та водно-етанольну суміш до загального об'єму 5 мл; додають по 0,075 г модифікованого сорбенту та перемішують магнітною мішалкою протягом 10 хв. Сорбенти відокремлюють, послідовно промивають трьома порціями дистильованої води, переносять у кювету та вимірюють світлопоглинання у тонкому шарі (1=0,1) при довжині хвилі 750 нм. Аналітичний сигнал залишається сталим при концентрації Nа2СО3 ≥ 0,35 моль/л. Приклад 6 Побудова ГГ для визначення кверцетину. В хімічні стакани ємністю 25,0 мл вводять стандартний водно-етанольний розчин -2 кверцетину (604,0 мг/л) об'ємом 0,25; 0,60; 0,85; 1,00; 1,90 та 2,50 мл, по 0,1 мл 1·10 моль/л розчину флуориду натрію, 2,5 мл 0,7 моль/л розчину Nа 2СО3 і дистильовану воду до загального об'єму розчину 5 мл; додають 0,075 г модифікованого сорбенту та перемішують магнітною мішалкою протягом 10 хв. Сорбент відокремлюють, послідовно промивають трьома порціями дистильованої води, переносять у кювету для ТСФ вимірювань товщиною 0,1 см та вимірюють оптичну густину при 750 та 996 нм. Рівняння градуювального графіка, побудованого в координатах А=f(Скверцетину) і має вигляд: 2 А=(0,048±0,002)+(5,4±0,1)Скверцетину (г/л), R =0,999 Діапазон лінійності ГГ в межах 3-30 мг/л кверцетину. Приклад 7 Побудова ГГ для визначення таніну. В хімічні стакани ємністю 25,0 мл вводять всі розчини, як в прикладі б, крім розчину кверцетину, замість якого вводять 0,20; 0,30; 0,70; 1,00, 1,40 та 1,80 мл, 640 мг/л водного розчину таніну. Всі операції, як в прикладі 6. Рівняння градуювального графіка, побудованого в координатах А=f(Станіну), має вигляд: 2 А=(0,47±0,01)+(2,1±0,2)СтанінУ (г/л), R =0,992. Діапазон лінійності ГГ в межах 25-230 мг/л таніну. Приклад 8-15 Вплив сторонніх іонів на результати визначення поліфенолів на прикладі таніну. В 8 хімічних стаканів ємністю 25,0 мл вводять по 1,0 мл розчину таніну (0,38 ммоль/л), 2,50 мл 0,7 моль/л розчину Na2CO3, 1-1,5 мл стороннього іону, концентрація яких в межах 75 мкмоль/л - 2,5 ммоль/л (Табл. 1) та дистильовану воду до загального об'єму 5 мл. Сорбент (0,1 г) обробляють 0,1 мл отриманого розчину, висушують на повітрі при кімнатній температурі та вимірюють світлопоглинання в тонкому шарі 1=0,1 см при 750 та 996 нм. Концентрацію поліфенолу у розчині визначають за градуювальним графіком (приклад 7). Допустимим вважають такий вміст стороннього іону, при якому відносна похибка не перевищує 5 %. Результати дослідження заважаючого впливу сторонніх іонів наведено у таблиці 1. 2 UA 101250 C2 Таблиця 1 Допустимі кількості заважаючих іонів при визначення 75 мкмоль/л таніну Приклад № 8 9 10 11 12 13 14 15 5 10 15 20 25 Сторонні іони, X + + K , Na 2+ Са Лимонна кислоти 3+ Fe 2+ Cu 2Сl , СО3 , NO3 Аскорбінова кислота Винна кислота Допустиме співвідношення Танін: X Не заважають Не заважає 1:10 1:1 1:5 Не заважають 1:2 1:10 Приклади 16-17 Визначення поліфенолів у препаратах "Кверцетин. Гранули" та "Вин-Віта". Для визначення поліфенолів за способом, наведеним у прикладі 6, у фарфоровій ступці вміст упаковки (~2 г) препарату "Кверцетин. Гранули" розтирають в порошок, відбирають точну наважку 0,0312 г та розчиняють у 25 мл водно-етанольної суміші (2:1). В хімічні стакани ємністю 25,0 мл вводять 0,9 мл розчину препарату "Кверцетин. Гранули" (приклад 16), 2,50 мл 0,7 моль/л розчину Na2CO3 та водно-етанольну (2:1) суміш до загального об'єму 5 мл. Перемішують 10 хв з 0,075 г РФ-ТДАН-СГ, декантують, промивають сорбент 0,7 моль/л розчином Na2CO3 і вимірюють світлопоглинання в тонкому шарі 1=0,1 см при 750 та 996 нм. Концентрацію поліфенолів визначають за ГГ та перераховували на вміст кверцетину у пробі. Для визначення поліфенолів за способом, наведеним у прикладі 7, 1/5 частину препарату "Вин-Віта" центрифугують впродовж 5 хв. для седиментації осаду виноградної сировини, відбирають аліквоту (1 мл) і розбавляють дистильованою водою до загального об'єму 25,0 мл для приготування вихідного розчину препарату. В хімічні стакани ємністю 25,0 мл вводять 1,3 мл (приклад 17) вихідного розчину препарату "Вин-Віта", 2,50 мл 0,7 моль/л розчину Na2CO3 та дистильовану воду до загального об'єму 5 мл. Перемішують 10 хв з 0,075 г РФ-ТДАН-СГ, декантують, промивають сорбент 0,7 моль/л розчином Nа2СО3 і вимірювали світлопоглинання в тонкому шарі 1=0,1 см при 750 та 996 нм. Концентрацію поліфенолів визначають за ГГ та перераховували на вміст таніну у пробі. Результати визначення розробленим ТСФ методикою, співставлено з результатами отриманими при визначенні стандартними методиками, що базується на реакціях комплексоутворення АІ (ІІІ) з поліфенолом [5] та відновлення реактиву Фоліна у розчині [2]. Результати визначення поліфенолів у препаратах "Кверцетин. Гранули" та "Вин-Віта" наведено у таблиці 2. Таблиця 2 Результати визначення вмісту поліфенолів в 1,0 г або 1,0 мл препарату "Кверцетин. Гранули" (приклад 15) та "Вин-Віта" (приклад 16)за розробленою методикою (І) і СФ методиками з АІ (ІІІ) (II) та РФ (III) (P=0,95, n=3) Приклад № 16 17 30 35 I 36±2 1,0±0,2 II 38,9±0,7 III 37±1 1,0±0,1 З таблиці видно, що дана методика характеризується задовільною точністю та відтворюваністю (відносне стандартне відхилення не перевищує 10 %). Приклади 18-20 Визначення загального вмісту поліфенолів у соках ТМ "Sandora". Для визначення вмісту поліфенолів за способом, наведеним у прикладі 7, соки "Sandora" фільтрують крізь фільтрувальний папір „синя стрічка" для відокремлення осаду фруктової сировини. 3 UA 101250 C2 5 10 Визначення вмісту поліфенолів у соках проводять наступним чином: у хімічні стакани ємністю 25 мл вводять по 0,1 мл проби гранатового (приклад 18), виноградного (приклад 19) соку та соку з іспанського винограду (приклад 20), 2,5 мл 0,7 моль/л розчину Nа 2СО3 і дистильовану воду до загального об'єму розчину 5 мл. Сорбент (0,1 г) обробляють 0,1 мл отриманого розчину, висушують на повітрі при кімнатній температурі та вимірюють світлопоглинання в тонкому шарі. Концентрацію поліфенолу у розчині визначають за градуювальним графіком. Результати визначення загального вмісту поліфенолів у соках наведено у таблиці 3. Результати визначення розробленим ТСФ методикою співставлено з результатами отриманими при визначенні стандартною методикою, що базується на реакції відновлення реактиву Фоліна у розчині [2]. Таблиця 3 Результати визначення вмісту поліфенолів у соках за розробленою методикою (І) і СФ методиками з РФ у розчині (II) (Р=0,95, n=3) Приклад № 18 19 20 15 20 25 I, гтаніну/л 1,7±0,4 1,9±0,6 4,6±0,5 III, гтаніну/л 1,5±0,1 1,4±0,1 5,2±0,3 Дані таблиці 3 корелюють між собою, що свідчать про придатність заявленого способу для визначення загального вмісту поліфенолів у соках. Таким чином, запропонований спосіб характеризується задовільними точністю та відтворюваністю. Використання кремнезему модифікованого ТДАН та реактивом Фоліна у вигляді готової аналітичної форми дозволяє, порівняно з аналогом, підвищити чутливість визначення поліфенолів (MB кверцетину (таніну) становить 1 (14) мг/л) та вибірковість відносно аскорбінової кислоти (фактор селективності 2). Джерела інформації: 1. Leamsomrong К., Suttajit М., Chantiratikul P. // Asian J. Applied Sci.-2009. - Vol. 2. - P. 184190. 2. Alonso A., Dominguez C., Guillen D.A., Barroso C. // J. Agric. Food Chem.-2002. - V.50. - P. 3112-3115. 3. Запорожець О.А., Крушинська О.А., Ліпковська Н.А., Сухан В.В. // ЖАХ - 2001. - Т. 56, № 6. - С. 591-596. 4. Запорожець О.А., Крушинська О.А. // Магістеріум "Природничі науки". Вип.16. - Київ: видавничий дім "Києво-Могилянська академія", 2005. - С. 63-66. 5. Беліков В.В., Точкова Т.В. // Фарм. журн.-1973. - № 5. - С. 40-44. 30 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 35 Спосіб визначення загального вмісту поліфенолів, який включає обробку сорбенту модифікованого силікагелю розчином поліфенолу в середовищі Nа2СО3 з наступним детектуванням світлопоглинання сорбенту у тонкому шарі методом твердофазної спектрофотометрії, який відрізняється тим, що як сорбент використовують силікагель, функціоналізований тетрадециламонію нітратом, а як модифікатор - реактив Фоліна. Комп’ютерна верстка Л. Купенко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4