Похідні сироваткового амілоїду р і їх отримання, і застосування

Реферат: Винахід належить до глікозилованого поліпептиду рекомбінантного сироваткового амілоїду Р SAP людини, що містить N-зв'язаний олігосахаридний ланцюг, де щонайменше одна гілка цього UA 110323 C2 (12) UA 110323 C2 олігосахаридного ланцюга закінчується α2,3-зв'язаною частиною сіалової кислоти. Крім того, винахід належить до фармацевтичного препарату, що підходить для застосування у ссавця, що містить заявлений поліпептид SAP, а також способу одержання заявленого людського поліпептиду SAP. Також описано спосіб одержання модифікованого глікозилованого поліпептиду SAP людини та його застосування. UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНІ ЗАЯВКИ Це посилання заявляє пріоритет за попередньою заявкою США з порядковим номером заявки 61/217931, поданою 4 червня 2009 року. Всі ідеї вищезгаданої заявки включені в даний опис за допомогою посилання. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Сироватковий амілоїд Р (SAP) є членом сімейства білків пентраксинів. SAP секретується печінкою і циркулює в крові у вигляді стабільного пентамеру. Попереднє дослідження демонструє, що SAP відіграє важливу роль в фазах як ініціації, так і розрішення імунної реакції. SAP може зв'язуватися із залишками цукру на поверхні бактерій і за допомогою цього стимулювати їх опсонізацію і поглинання антигенпрезентуючими клітинами. SAP зв'язується також з вільною ДНК і хроматином, що генеруються апоптотичними клітинами при розрішенні імунної реакції, запобігаючи за допомогою цього повторній запальній реакції проти цих антигенів. Молекули, зв'язані SAP, видаляються з позаклітинних зон внаслідок здатності SAP зв'язуватися з всіма трьома класичними рецепторами Fcγ, рецепторами (FcγR), що мають конкретну афінність у відношенні FcγRII (CD32) і FcγRIII (CD16). Після зв'язування рецептора, SAP і будь-який прикріплений комплекс звичайно інтерналізуються і процесуються цією клітиною. Нещодавно, було висунене припущення, що SAP може бути використаний як терапевтичний агент для лікування різних порушень, в тому числі пов'язаних з фіброзом порушень, алергічних порушень, аутоімунних порушень, запалення слизової оболонки і запальних порушень, таких як порушення, що викликаються мікробною інфекцією. Див., наприклад, заявки на патенти США з порядковими номерами 11/707333, 12/217617, 12/720845 і 12/720847. Білкові терапевтичні речовини для лікування захворювань людини революціонізували медичну промисловість. Однак є численні труднощі в отриманні білкового терапевтичного засобу, що має необхідну ефективність, і/або отримання його в достатній кількості для використання як терапевтичного агента. Багато які потенційні терапевтичні агенти модифіковані для збільшення їх біологічної активності, такої як період напіввиведення з плазми, відносно білка, що природно отримується. Для отримання поліпептиду в достатній кількості звичайно виконується технологія рекомбінантної експресії. На жаль, багато які рекомбінантні системи продукують поліпептиди, що мають інші біологічні властивості, ніж природні форми, які можуть діяти на фармакокінетику, безпеку і ефективність терапевтичного продукту. Таким чином, залишається потреба в розвитку поліпептидів SAP і способів їх приготування, придатних для терапевтичного лікування людей. СУТЬ ВИНАХОДУ Частково, цей опис винаходу забезпечує варіантні поліпептиди сироваткового амілоїду Р (SAP) і способи їх отримання. Даний винахід включає в себе способи і композиції для in vitro і in vivo додавання, делеції або модифікації цукрових залишків для отримання варіантних поліпептидів, що мають бажаний характер глікозилування. У деяких аспектах, цей опис винаходу забезпечує поліпептид SAP людини, що містить Nзв'язаний або О-зв'язаний олігосахаридний ланцюг, який має щонайменше одну гілку, що закінчується 2,3-зв'язаною частиною сіалової кислоти. У деяких аспектах, цей опис винаходу забезпечує глікозилований поліпептид SAP людини, що містить N-зв'язаний або О-зв'язаний олігосахаридний ланцюг, який має щонайменше на 50 % менше 2,6-зв'язаних частин сіалової кислоти, ніж SAP дикого типу, виділений з сироватки людини. У деяких аспектах, цей опис забезпечує способи отримання глікозилованого поліпептиду SAP людини, що передбачають експресію поліпептиду SAP в клітині і виділення цього поліпептиду SAP з цієї клітини. В одному переважному варіанті здійснення, цією клітиною є клітина СНО. У деяких аспектах, цією клітиною є клітина CHO-S. У деяких аспектах, цей опис забезпечує способи отримання поліпептиду SAP людини, що передбачають експресію поліпептиду SAP людини в клітині CHO і виділення цього поліпептиду SAP людини з цієї клітини. У деяких аспектах, цей опис забезпечує способи отримання поліпептиду SAP людини, що передбачають забезпечення глікозилованого поліпептиду SAP людини, що містить N-зв'язаний або О-зв'язаний олігосахаридний ланцюг, і ферментативну або хімічну зміну N-зв'язаного або Озв'язаного олігосахаридного ланцюга поліпептиду SAP для отримання модифікованого глікозилованого поліпептиду SAP. У деяких аспектах, цей опис винаходу забезпечує способи отримання поліпептиду SAP людини, що передбачають забезпечення поліпептиду SAP людини і ферментативну або хімічну 1 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зміну цього поліпептиду SAP для отримання глікозилованого поліпептиду SAP, що містить Nзв'язаний або О-зв'язаний олігосахарид. У деяких аспектах, цей опис забезпечує поліпептид SAP людини, отриманий способом, що передбачає експресію поліпептиду SAP способом, що передбачає експресію поліпептиду SAP в клітині СНО і виділення цього поліпептиду SAP з цієї клітини. У деяких аспектах, цей опис забезпечує клітину СНО, яка містить поліпептид SAP людини з N-зв'язаним олігосахаридним ланцюгом, що має щонайменше одну гілку цього олігосахаридного ланцюга, що закінчується 2,3-зв'язаною частиною сіалової кислоти. У деяких аспектах, цей опис забезпечує клітину СНО, що містить полінуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид SAP людини. У деяких аспектах, цей опис забезпечує поліпептид SAP людини, що має IC50 для інгібування диференціювання моноцитів в фіброцити in vitro, яка менше половини, менше однієї третини, менше однієї четвертої, менше однієї десятої або менше однієї сотої частини IC 50 відповідної проби SAP дикого типу, виділеного з сироватки людини. У переважних варіантах здійснення, поліпептиди SAP людини цього винаходу мають Nзв'язаний олігосахаридний ланцюг. У деяких варіантах здійснення, щонайменше одна гілка Nзв'язаного олігосахаридного ланцюга закінчується 2,3-зв'язаною частиною сіалової кислоти. У деяких варіантах здійснення, цей N-зв'язаний олігосахаридний ланцюг має щонайменше на 50 % менше 2,6-зв'язаних частин сіалової кислоти, ніж SAP дикого типу, виділений з сироватки людини. У деяких варіантах здійснення, всі гілки цього N-зв'язаного олігосахаридного ланцюга закінчуються 2,3-зв'язаними частинами сіалової кислоти. У деяких варіантах здійснення, цей N-зв'язаний олігосахаридний ланцюг по суті не містить 2,6-зв'язаних частин сіалової кислоти. Гліковаріантні поліпептиди SAP цього винаходу можуть містити одну або декілька гілок, наприклад, N-зв'язаний олігосахаридний ланцюг може характеризуватися як такий, що має біантенарну, три-антенарну, тетра-антенарну або пента-антенарну структуру. У деяких варіантах здійснення, цей N-зв'язаний олігосахаридний ланцюг містить пентасахаридну серцевину Man[(1,6-)-(Man(1,3)]-Man(1,4)-GlcNAc(1,4)-GlcNAc(1,N)-Asn. У деяких варіантах здійснення, цей N-зв'язаний олігосахаридний ланцюг містить щонайменше одну гілку, що має структуру NeuNAc23Gal4GlcNAc2Man6. В деяких варіантах здійснення, щонайменше одна гілка N-зв'язаного олігосахаридного ланцюга не містить галактози і N-ацетилглюкозаміну. У деяких варіантах здійснення, всі гілки N-зв'язаного олігосахаридного ланцюга по суті не містять галактози і N-ацетилглюкозаміну. У деяких варіантах здійснення, щонайменше одна гілка Nзв'язаного олігосахаридного ланцюга містить один або декілька манозних залишків. У деяких варіантах здійснення, цей N-зв'язаний олігосахаридний ланцюг містить щонайменше один фукозний залишок. Будь-який з гліковаріантних поліпептидів SAP цього винаходу може містити щонайменше один модифікований глікозильний залишок. Модифікований глікозильний залишок може бути кон'югований з одним або декількома модифікуючими групами, вибраними з водорозчинних і нерозчинних полімерів, терапевтичних частин молекул, діагностичних агентів і біомолекул. У деяких аспектах, поліпептид SAP цього винаходу може бути рекомбінантним поліпептидом. Поліпептид SAP цього винаходу може містити амінокислотну послідовність, щонайменше на 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичну SEQ ID NО:1, 2, 3 або 4. Переважно, поліпептид SAP є білком SAP людини. Поліпептид SAP людини цього винаходу може містити амінокислотну послідовність щонайменше на 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичну SEQ ID NO:1. У деяких аспектах, поліпептид SAP людини цього винаходу є злитим білком, що містить домен SAP людини і один або декілька гетерологічних доменів. Цей гетерологічний домен може посилювати одну або декілька з таких властивостей, як стабільність in vivo, період напіввиведення in vivo, поглинання/введення, локалізація або розподіл в тканині, утворення білкових комплексів і/або очищення. У деяких аспектах, поліпептид SAP людини цього винаходу містить один або декілька модифікованих амінокислотних залишків, наприклад, ПЕГильовану амінокислоту, глікозиловану (наприклад, О-зв'язаним глікозилуванням) амінокислоту, пренільовану амінокислоту, ацетиловану амінокислоту, біотинільовану амінокислоту і/або амінокислоту, кон'юговану з органічним дериватизуючим агентом. Ці модифіковані амінокислотні залишки можуть посилювати одну або декілька з таких властивостей, як стабільність in vivo, період напіввиведення in vivo, поглинання/введення, локалізація або розподіл в тканині, утворення білкових комплексів і/або очищення. У переважних варіантах здійснення, поліпептиди SAP людини цього винаходу мають збільшену біологічну активність відносно відповідної проби SAP дикого типу, виділеного з 2 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 сироватки людини. У деяких аспектах, поліпептиди SAP цього винаходу мають IC 50 для інгібування диференціювання моноцитів в фіброцити in vitro, яка менше половини, менше однієї третини, менше однієї четвертої, менше однієї десятої або менше однієї сотої частини IC50 відповідної проби SAP дикого типу, виділеного з сироватки людини. У деяких аспектах, способи отримання будь-якого з поліпептидів SAP людини цього винаходу передбачають додаткову стадію ферментативної або хімічної зміни поліпептиду SAP для приєднання N-зв'язаного або О-зв'язаного олігосахаридного ланцюга до поліпептиду SAP або для модифікації існуючого N-зв'язаного або О-зв'язаного олігосахаридного ланцюга поліпептиду SAP. У деяких варіантах здійснення, зміна ферментативна або хімічна зміна поліпептиду SAP передбачає обробку поліпептиду SAP одним або декількома ферментативними білками, вибраними з глікозилтрансфераз, глікозидаз і фосфатаз. У деяких варіантах здійснення, спосіб ферментативної або хімічної зміни поліпептиду SAP здійснюється в присутності одного або декількох попередників цукру. Відповідні попередники цукру включають в себе, але не обмежуються ними, УДФ-N-ацетилглюкозамін, УДФ-Nацетилгалактозамін ЦМФ-N-гліколілнейрамінової кислоти, ЦМФ-N-ацетилнейрамінову кислоту, УДФ-галактозу і ГДФ-фукозу. У деяких варіантах здійснення, спосіб ферментативної або хімічної зміни поліпептиду SAP видаляє одну або декілька кінцевих 2,6-зв'язаних частин сіалової кислоти з N-зв'язаного або О-зв'язаного олігосахаридного ланцюга. У деяких варіантах здійснення, спосіб ферментативної або хімічної зміни виділеного поліпептиду SAP замінює одну або декілька кінцевих 2,6-зв'язаних частин сіалової кислоти на цьому олігосахаридному ланцюгу однією або декількома 2,3-зв'язаними частинами сіалової кислоти. Цей опис додатково забезпечує фармацевтичні препарати поліпептидів SAP людини цього винаходу для застосування ссавцем. Фармацевтичні препарати цього винаходу, включають в себе щонайменше один з описаних тут поліпептидів SAP і фармацевтично прийнятний носій. У деяких варіантах здійснення, цей фармацевтичний препарат додатково містить додатковий активний агент. У деяких варіантах здійснення цей фармацевтичний препарат готують у вигляді композиції пролонгованого вивільнення. У деяких варіантах здійснення, фармацевтичні препарати цього опису придатні для введення в пацієнта місцево, ін'єкцією, внутрішньовенною ін'єкцією, інгаляцією, з використанням безперервного депо-препарату пролонгованої дії або за допомогою насоса. Цей опис винаходу забезпечує способи лікування або попередження чутливих до SAP порушень або станів введенням пацієнту, що потребує цього, терапевтично ефективної кількості одного або декількох поліпептидів SAP цього винаходу. Чутливі до SAP порушення або стани включають в себе, але не обмежуються ними, фіброзні або фібропроліферативні порушення або стани, алергічні порушення або стани, аутоімунні порушення або стани, запальні захворювання або стани і запалення слизової оболонки. Поліпептид SAP цього винаходу може вводитися пацієнту місцево, ін'єкцією, внутрішньовенною ін'єкцією, інгаляцією, з використанням безперервного депо-препарату пролонгованої дії або за допомогою насоса або комбінацією цих способів. У деяких варіантах здійснення, поліпептид SAP цього винаходу вводять з одним або декількома додатковими активними агентами. КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР Фігура 1. Аналіз диференціювання фіброцитів. Аналіз на основі ELISA використовували для вимірювання продукування MDC після інкубування моноцитів з поліпептидами SAP. Y-вісь показує середню ефективність (тобто середнє з 7 незалежних експериментів) отриманої з сироватки SAP людини (hSAP) в порівнянні з рекомбінантним SAP людини (rhSAP), виділеним з клітин CHO-S. Відносна активність hSAP встановлена при 1,0. Фігура 2. Структурний аналіз глікану варіантних поліпептидів SAP. Аналіз (А) масспектрометрією, зв'язаною з рідинною хроматографією (LCMS), і аналіз (В) аніонообмінною високоефективною рідинною хроматографією (AEX-HPLC) використовували для визначення зв'язків сіалової кислоти на глікоремодельованому SAP людини, виділеному з клітин CHO-S. Аналіз (С) мас-спектрометрією, зв'язаною з рідинною хроматографією (LCMS), і аналіз (D) аніонообмінною високоефективною хроматографією (AEX-HPLC) використовували для визначення зв'язків сіалової кислоти на глікоремодельованому hSAP (отриманому з сироватки людини SAP). Аналіз (Е) мас-спектрометрією, зв'язаною з рідинною хроматографією (LCMS), і аналіз (F) аніонообмінною високоефективною хроматографією (AEX-HPLC) використовували для визначення зв'язків сіалової кислоти на rhSAP, який обробляли 2,3-сіалілтрансферазою для збільшення кількості кінцевих 2,3-зв'язаних сіалових кислот на гліканах SAP. Для фігур LCMS, X-вісь представляє масу в Дальтонах, а Y-вісь представляє відносну інтенсивність. Для кривих HPLC, X-вісь є часом в хвилинах, а Y-вісь є одиницями абсорбції (mAU). 3 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фігура 3. Аналіз диференціювання фіброцитів. Аналіз на основі ELISA використовували для вимірювання продукування MDC після інкубування моноцитів з варіантними поліпептидами SAP. Y-вісь показує середню відносну активність кожного варіанту SAP в порівнянні з посилальним стандартом hSAP, для якого ця активність встановлена при 1,0 (див. самий лівий стовпець). Фігура 4. Аналіз диференціювання фіброцитів. Моноцити обробляли hMCSF і потім згодом визначали кількісно у відношенні диференціювання фіброцитів. X-вісь представляє концентрацію hMCSF, інкубованого з донорними моноцитами. Y-вісь показує величину 4 проліферації фіброцитів в день 5, виміряну підрахунком фіброцитів на 5,0×10 клітин. Фігури 5. Аналіз диференціювання фіброцитів. Моноцити обробляли hSAP і потім згодом визначали кількісно у відношенні диференціювання фіброцитів. X-вісь представляє концентрацію hSAP, інкубованого з донорними моноцитами. Y-вісь показує кількість 4 проліферації фіброцитів в день 5, виміряну підрахунком фіброцитів на 5,0×10 клітин. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Огляд Пептиди, що найчастіше зустрічаються в природі мають вуглеводні частини (тобто глікани), приєднані до цього пептиду через специфічні зв'язки з певними амінокислотами вздовж довжини первинного пептидного ланцюга, з утворенням таким чином "глікопептидів". Характер глікозилування на будь-якому конкретному пептиді може чинити величезні впливи на функцію цього пептиду. Наприклад, структура цих N-зв'язаних гліканів на пептиді може впливати на різні характеристики цього пептиду, що включають в себе чутливість до протеаз, внутрішньоклітинну направлену міграцію, секрецію, тканинне націлювання, біологічний період напіввиведення і антигенність. Зміна однієї або декількох з цих характеристик в сильній мірі впливає на ефективність пептиду в його природному оточенні. Структури гліканів, виявлених в тих глікопептидах, що зустрічаються в природі, звичайно поділяються на два класи, N-зв'язані і О-зв'язані глікани. Пептиды, що експресуються в еукаріотичних клітинах, є звичайно N-глікозилованими на залишках аспарагіну в сайтах в первинній структурі пептиду, що містять послідовність аспарагін-Х-серин/треонін, де X може бути будь-якою амінокислотою, за винятком проліну і аспарагінової кислоти. Вуглеводна частина таких пептидів відома як N-зв'язаний глікан або N-зв'язаний олігосахарид. Ці ранні події N-глікозилування зустрічаються в ендоплазматичному ретикулумі (ER) і є консервативними у ссавців, рослин, комах і інших вищих еукаріотів. Спочатку, олігосахаридний ланцюг, що містить чотирнадцять цукрових залишків, конструюється на молекулі ліпідного носія. Коли пептид, що виникає, транслюється і транслокується в ER, весь цей олігосахаридний ланцюг переноситься до амідної групи залишку аспарагіну в реакції, що каталізується мембранозв'язаним ферментом глікозилтрансферазою. Цей N-зв'язаний глікан додатково процесується як в ER, так і в апараті Гольджі. Цей додатковий процесинг звичайно спричиняє за собою видалення деяких з цукрових залишків і додавання інших цукрових залишків в реакціях, що каталізуються глікозилазами і глікотрансферазами, специфічними відносно і цукрових залишків, що додаються, що видаляються. Звичайно, кінцеві структури N-зв'язаних гліканів залежать від організму, в якому продукується цей пептид. Наприклад, пептиди, що продукуються в бактеріях, звичайно є неглікозилованими. Пептиди, що експресуються в клітинах комах, звичайно містять високу кількість манозних або малу кількість манозних N-зв'язаних олігосахаридних ланцюгів. Пептиди, що продукуються в культурі клітин ссавців, звичайно є диференціально глікозилованими в залежності від виду і умов культури клітин. Навіть в одному і тому ж виді і при одних і тих же умовах іноді зустрічається деяка кількість гетерогенності в глікозильного ланцюгу. Звичайно, пептиди, що продукуються в клітинах рослин, містять структури гліканів, які значно відрізняються від структур, що продукуються в клітинах тварин. У цій галузі були запропоновані множина способів для отримання конкретного характеру глікозилування пептиду, в тому числі способи, описані в опублікованих міжнародних заявках з номерами WO 99/22764, WO 98/58964 і WO 99/54342, а також в патенті США № 5047335. По суті, були клоновані і секвеновані багато які з ферментів, необхідних для глікозилування in vitro пептидів. У деяких випадках, ці ферменти використовували in vitro для додавання конкретного цукру до глікану на пептиді. В інших випадках, клітини конструювали генетично для експресії комбінації ферментів і бажаних білків таким чином, що додавання бажаної цукрової частини до пептиду, що експресується, відбувається в цій клітині. У синтезі вуглеводів, використовують два основних класи ферментів: глікозилтрансферази і глікозидази. Глікозилтрансферази додають або модифікують існуючі олігосахаридні структури 4 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 на пептиді. Глікозилтрансферази є ефективними для отримання специфічних продуктів з хорошим стереохімічним і регіохімічним контролем. Глікозилтрансферази використовували для отримання олігосахаридів і для модифікації кінцевих N- і О-зв'язаних вуглеводних структур, зокрема, на пептидах, що продукуються в клітинах ссавців. Наприклад, ці кінцеві олігосахариди глікопептидів можуть бути повністю сіаліловані і/або фукозильовані для забезпечення більш стійких цукрових структур з використанням глікозилтрансфераз, які можуть поліпшувати фармакодинаміку глікопептидів і безліч інших біологічних властивостей. Глікозидази додатково класифікуються як екзоглікозидази (наприклад, -манозидаза, глюкозидаза) і ендоглікозидази (наприклад, Endo-A, Endo-M). Глікозидази в нормі каталізують гідроліз глікозидного зв'язку. Однак, при відповідних умовах, вони можуть бути використані для утворення цього зв'язку. Більшість глікозидаз, що використовуються для синтезу вуглеводів, є екзоглікозидазами; перенесення глікозилу відбувається при невідновлювальному кінці цього субстрату. Глікозидаза зв'язує донор глікозилу в проміжному продукті глікозил-фермент, який перехоплюється або водою з утворенням продукту гідролізу, або акцептором для генерування нового глікозиду або олігосахариду. Одним зразковим шляхом, що використовує екзоглікозидазу, є синтез серцевинного трисахариду всіх N-зв'язаних глікопептидів, в тому числі -манозидного зв'язку, який утворюється дією -манозидази (Singh et al., Chem. Commun. 993994 (1996)). Хоч їх застосування є менш звичайним, ніж застосування екзоглікозидаз, ендоглікозидази також можуть використовуватися для утворення вуглеводів. Ендоглікозидази можуть бути використані для перенесення всього олігосахаридного ланцюга, а не моносахариду, на поліпептид. Фрагменти олігосахаридів додавали до субстрату з використанням ендо--N-ацетилглюкозамінів, таких як ендо-F і ендо-M (Wang et al, Tetrahedron Lett. 37: 1975-1978; і Haneda et al., Carbohydr. Res. 292: 61-70 (1996). Кожний з цих класів ферментів успішно використовували для отримання глікозилованих пептидів. Відносно загального огляду, див. Crout et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 98-111 (1998). Сироватковий амілоїд Р (SAP) є сироватковим білком, що зустрічається в природі у ссавців, що складається з п'яти ідентичних субодиниць, або "стимуляторів", які нековалентно асоційовані в подібному до диску комплексі. SAP належить до суперсімейства білків пентраксинів, які характеризуються цією циклічною пентамерною структурою. Класичні короткі пентраксини включають в себе SAP, а також С-реактивний білок (Osmand, A.P., et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 74: 739-743, 1997). SAP звичайно синтезується в печінці і має фізіологічний період напіввиведення двадцять чотири години. Нижче описана послідовність субодиниці SAP людини, яка відповідає амінокислотам 20-223 Gene bank Accession NO. NP_001630 (сигнальна послідовність не зображена). HTDLSGKVFVFPRESVTDHVNLITPLEKPLQNFTLCFRAYSDLSRAYSLFSYNTQGRDNELLVYKERV GEYSLYIGRHKVTSKVIEKFPAPVHICVSWESSSGIAEFWINGTPLVKKGLRQGYFVEAQPKIVLGQEQ DSYGGKFDRSQSFVGEIGDLYMWDSVLPPENILSAYQGTPLPANILDWQALNYEIRGYVIIKPLVWV (SEQ ID NO:1) Нижче описана послідовність субодиниці SAP Gallus gallus. QEDLYRKVFVFREDPSDAYVLLQVQLERPLLNFTVCLRSYTDLTRPHSLFSYATKAQDNEILLFKP KPGEYRFYVGGKYVTFRVPENRGEWEHVCASWESGSGIAEFWLNGRPWPRKGLQKGYEVGNEAV VMLGQEQDAYGGGFDVYNSFTGEMADVHLWDAGLSPDKMRSAYLALRLPPAPLAWGRLRYEAKGD VVVKPRLREALGA (SEQ ID NO:2) Нижче описана послідовність субодиниці SAP Bos taurus. QTDLRGKVFVFPRESSTDHVTLITKLEKPLKNLTLCLRAYSDLSRGYSLFSYNIHSKDNELLVFKNG IGEYSLYIGKTKVTVRATEKFPSPVHICTSWESSTGIAEFWINGKPLVKRGLKQGYAVGAHPKIVLGQE QDSYGGGFDKNQSFMGEIGDLYMWDSVLSPEEILLVYQGSSSISPTILDWQALKYEIKGYVIVKPMVW G (SEQ ID NO:3). Нижче описана послідовність субодиниці SAP Cricetulus migratorius. QTDLTGKVFVFPRESESDYVKLIPRLEKPLENFTLCFRTYTDLSRPHSLFSYNTKNKDNELLIYKER MGEYGLYIENVGAIVRGVEEFASPVHFCTSWESSSGIADFWVNGIPWVKKGLKKGYTVKTQPSIILGQ EQDNYGGGFDKSQSFVGEMGDLNMWDSVLTPEEIKSVYEGSWLEPNILDWRALNYEMSGYAVIRPR VWH (SEQ ID NO:4). Один аспект даного винаходу стосується несподіваного відкриття, що модифікація структури глікану на поліпептиді SAP людини може збільшувати біологічну активність поліпептиду SAP відносно відповідної проби SAP дикого типу, виділеного з сироватки людини. Як показано прикладами цього опису винаходу, виділений SAP з сироватки людини містить тільки 2,6зв'язані залишки сіалової кислоти. На відміну від цього, рекомбінантний SAP людини, що продукується в клітинах СНО, містить тільки 2,3-зв'язані залишки сіалової кислоти. З 5 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 використанням біоаналізів на основі клітин in vitro, було продемонстровано, що поліпептиди SAP з 2,3-зв'язаною сіаловою кислотою мають постійно більш високу активність, ніж SAP дикого типу (тобто SAP, що містить 2,6-зв'язані частини сіалової кислоти), виділений з сироватки людини. Ці варіантні поліпептиди SAP даного винаходу могли б бути більш ефективними як терапевтичні агенти, внаслідок їх збільшеної біологічної ефективності. Наприклад, більш ефективні варіанти SAP можуть вимагати меншої дози і/або менш частого введення доз відносно SAP дикого типу, виділеного з сироватки людини. Даний опис винаходу забезпечує як варіантні поліпептиди SAP людини, так і способи їх отримання. Зокрема, цей опис включає в себе способи і композиції для in vitro і in vivo додавання, делеції або модифікації цукрових залишків для отримання поліпептиду SAP людини, що має бажаний характер глікозилування. Визначення Якщо немає іншого визначення, всі технічні і наукові терміни, що використовуються тут, мають те ж саме значення, що і значення, що звичайно розуміється середнім фахівцем в даній галузі. Загалом, номенклатура, що використовується в даному описі і в лабораторних процедурах в культурі клітин, молекулярній генетиці, органічній хімії і хімії і гібридизації нуклеїнових кислот, добре відома і звичайно використовується в даній галузі. Для синтезу нуклеїнових кислот і пептидів використовуються стандартні способи. Ці способи і процедури звичайно виконують відповідно до загальноприйнятих способів в даній галузі і численних загальних посилань (наприклад, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: А Laboratory Manual, 2d ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, які наводяться по всьому цьому документу. Іменники в однині використовуються тут для посилання на один або декілька (тобто щонайменше один) з граматичних об'єктів. Наприклад, "елемент" означає один елемент або більше, ніж один елемент. Як використовується в даному описі, терміни "лікування" і "обробка" стосуються отримання бажаного фармакологічного і/або фізіологічного ефекту. Цей ефект може бути профілактичним в тому значенні, що він повністю або частково запобігає порушенню або його симптому, або може бути терапевтичним в тому значенні, що він частково або повністю виліковує порушення і/або шкідливий вплив, що приписується цьому порушенню. "Лікування", в даному контексті, охоплює будь-яке лікування захворювання у ссавця, зокрема, у людини, і включає в себе: (a) збільшення часу виживання; (b) зменшення ризику смерті внаслідок цього захворювання; (с) інгібування цього захворювання, тобто, зупинку його розвитку або зменшення швидкості прогресування захворювання; і (d) ослаблення цього захворювання, тобто викликання регресії цього захворювання. У даному контексті, терапевтичний засіб, який "інгібує" або "запобігає" порушенню або стану, є сполукою, яка, в статистичній пробі, зменшує появу цього порушення або стану в обробленій пробі відносно необробленої контрольної проби, або затримує появу або зменшує тяжкість одного або декількох симптомів цього порушення або стану відносно необробленої контрольної проби. У цьому контексті, терміни "суб'єкт" і "пацієнт" стосуються тварин, в тому числі ссавців, таких як люди. Термін "ссавець" включає в себе приматів, домашніх тварин, що включають в себе собак, кішок, овець, велику рогату худобу, коней, кіз, свиней, мишей, щурів, кроликів, морських свинок, тварин, що знаходяться в неволі, таких як тварини зоопарку, і диких тварин. У цьому контексті, термін "тканина" стосується органу або групи спеціалізованих клітин, таких як шкіряна тканина, легенева тканина, тканина нирки і інші типи клітин. Термін "терапевтична дія" є загальновизнаним і стосується локальної або системної дії на тваринах, зокрема, ссавцях, і більш конкретно на людях, що викликається фармакологічно активною речовиною. Фраза "терапевтично ефективна кількість" означає кількість такої речовини, яка виконує деяку бажану локальну або системну дію при розумному співвідношенні користі/ризику, застосовну до будь-якої обробки. Терапевтично ефективна кількість такої речовини буде варіюватися в залежності від суб'єкта і патологічного стану, що піддається лікуванню, маси і віку цього суб'єкта, тяжкості цього патологічного стану, способу введення, які можуть бути легко визначені середнім фахівцем в даній галузі. Наприклад, деякі описані тут композиції можуть вводитися в достатній кількості для отримання бажаної дії в розумному співвідношенні користі/ризику, застосовному до такого лікування. У цьому контексті, термін "нуклеїнова кислота" стосується полінуклеотиду, такого як дезоксирибонуклеїнова кислота (ДНК), і, у разі необхідності, рибонуклеїнова кислота (РНК). Повинно бути зрозуміло, що цей термін включає в себе також, як еквіваленти, аналоги РНК або 6 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ДНК, отримані з аналогів нуклеотидів, і, застосовно до варіанту, що описується, одноланцюговий (наприклад, смисловий або антисмисловий) і дволанцюговий полінуклеотид. Терміни "пептиди", "білки" і "поліпептиди" використовуються тут взаємозамінно. Термін "очищений білок" стосується препарату білка або білків, які виділені або іншим чином по суті звільнені від інших білків, звичайно асоційованих з цим білком (з цими білками) в клітині або клітинному лізаті. Термін "по суті вільні від інших клітинних білків" або "по суті вільні від інших забруднювальних білків" визначається як термін, що включає в себе окремі препарати кожного з цих білків, що містять менше 20 % (з розрахунку на суху масу) забруднювального білка, і переважно менше за 5 % забруднювального білка. Функціональні форми кожного з цих білків можуть бути отримані у вигляді очищених препаратів з використанням клонованого гену, як також відомо в даній галузі. Під терміном "очищена" мається на увазі, що вказана молекула присутня по суті у відсутності інших біологічних макромолекул, таких як інші білки (зокрема, інші білки, які можуть істотно маскувати, зменшувати, створювати плутанину або змінювати характеристики цих білків-компонентів або в очищених білках, або в їх функції у відтвореній суміші, що розглядається). Термін "очищені" в даному контексті означає переважно, щонайменше 80 % з розрахунку на суху масу, більш переважно, в діапазоні 85 % з розрахунку на масу, більш переважно, 95-99 % з розрахунку на масу і, найбільш переважно, щонайменше 99,8 % з розрахунку на масу, присутніх біологічних макромолекул того ж самого типу (але можуть бути присутніми вода, буфери і інші малі молекули, особливо молекули, що мають молекулярну масу менше за 5000). Термін "чисті" в даному контексті має ті ж самі числові межі, що і "очищені", наведені безпосередньо вище. "N-зв'язані" олігосахариди є олігосахаридами, які пов'язані з пептидним скелетом через аспарагін за допомогою зв'язку аспарагін-N-ацетилглюкозамін. N-зв'язані олігосахариди називають також "N-гліканами." N-зв'язані олігосахариди, що зустрічаються в природі, мають загальну пентасахаридну серцевину Man[(1,6-)-(Man(1,3)]-Man(1,4)-GlcNAc(1,4)GlcNAc(1,N). Вони відрізняються присутністю і кількістю гілок (також званих антенами) периферичного цукру, таких як N-ацетилглюкозамін, галактоза, N-ацетилгалактозамін, фукоза і сіалова кислота. Необов'язково, ця структура може також містити молекулу фукози і/або молекулу ксилози як серцевину (кора). Термін "сіалова кислота" стосується будь-якого члена сімейства 9-вуглецевих карбоксильованих цукрів. Найбільш звичайним членом сімейства сіалових кислот є Nацетилнейрамінова кислота (що часто скорочується як Neu5Ac, NeuAc або NANA). Другим членом цього сімейства є N-гліколілнейрамінова кислота (Neu5Gc або NeuGc), в якій Nацетильна група NeuAc є гідроксильованою. Третім членом сімейства сіалових кислот є 2-кето3-дезоксинонулозонова кислота (KDN) (Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)). Включені також 9-заміщені сіалові кислоти, такі як 9-O-С1С6-ацил-Neu5Ac, такі як 9-O-лактил-Neu5Ac або 9-O-ацетил-Neu5Ac, 9дезокси-9-фтор-Neu5Ac і 9-азидо-9-дезокси-Neu5Ac. Відносно огляду сімейства сіалових кислот, див., наприклад, Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992)). "Генетично сконструйована" або "рекомбінантна клітина" є клітиною, що має одну або декілька модифікацій відносно генетичного матеріалу цієї клітини. Такі модифікації включають в себе, але не обмежуються ними, інсерції генетичного матеріалу, делеції генетичного матеріалу і інсерцію генетичного матеріалу, який є позахромосомним, незалежно від того, є або не є такий матеріал таким, що стабільно зберігається. У даному контексті, термін "модифікований цукор" стосується вуглеводу, що зустрічається в природі або вуглеводу, що не зустрічається природі, який ферментативно доданий на амінокислотний або глікозильний залишок пептиду в способі цього винаходу. Цей модифікований цукор вибраний з ряду субстратів ферментів, в тому числі, але не тільки, цукрових нуклеотидів (моно-, ди- і трифосфатів), активованих цукрів (наприклад, глікозилгалогенідів, глікозилмезилатів) і цукрів, які не є активованими і не є нуклеотидами. "Модифікований цукор" може бути ковалентно функціоналізований "модифікуючою групою". Застосовні модифікуючі групи включають в себе, але не обмежуються ними, водорозчинні і нерозчинні у воді полімери, терапевтичні частини молекул, діагностичні частини молекул, біомолекули. Локус функціоналізації модифікуючою групою вибирають таким чином, що він не перешкоджає ферментативному додаванню цього "модифікованого цукру" до пептиду або глікозильного залишку цього пептиду. Варіантні поліпептиди SAP Частково, даний опис винаходу забезпечує варіантні поліпептиди Сироваткового Амілоїду Р (SAP). Зокрема, варіанти SAP цього винаходу включають в себе глікозиловані поліпептиди SAP 7 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 людини, які містять один або декілька N-зв'язаних або О-зв'язаних олігосахаридних ланцюгів, кожний з яких має одну, дві, три, чотири або п'ять або більше гілок, що закінчуються 2,3зв'язаною частиною сіалової кислоти. У деяких варіантах здійснення, всі гілки цих N-зв'язаних або О-зв'язаних олігосахаридних ланцюгів закінчуються в 2,3-зв'язаних частинах. Інші варіанти SAP цього винаходу включають в себе глікозиловані поліпептиди SAP людини, які містять Nзв'язані або О-зв'язані олігосахаридні ланцюги, що мають щонайменше на 20 %, 25 %, 30 %, 35 % 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 % 75 %, 80 %, 85 % або навіть щонайменше на 95 % менше 2,6-зв'язаних частин сіалової кислоти, ніж поліпептид SAP дикого типу, отриманий з сироватки людини. У деяких варіантах здійснення, N-зв'язані або О-зв'язані олігосахаридні ланцюги по суті не містять 2,6-зв'язаних частин сіалової кислоти, наприклад, маючи менше за 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % або навіть менше за 99 % 2,6-зв'язаних частин сіалової кислоти відносно поліпептиду SAP дикого типу, отриманого з сироватки людини. Гліковаріантні поліпептиди SAP цього винаходу можуть містити N-зв'язаний олігосахаридний або О-зв'язаний ланцюг, що має одну або декілька гілок (наприклад, що має бі-антенарну, три-антенарну, тетраантенарну, пента-антенарну і т.д. структуру). У деяких варіантах здійснення, поліпептиди SAP цього винаходу містять N-зв'язаний або О-зв'язаний олігосахаридний ланцюг, в якому одна, дві, три, чотири або п'ять гілок цього олігосахаридного ланцюга по суті вільні від галактози і Nацетилглюкозаміну (наприклад, маючи менше за 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % або навіть менше за 99 % N-ацетилглюкозаміну відносно поліпептиду SAP дикого типу, отриманого з сироватки людини). Деякі поліпептиди SAP цього винаходу мають N-зв'язані або О-зв'язані олігосахаридні ланцюги, які по суті вільні від галактози і N-ацетилглюкозаміну (наприклад, маючи менше за 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % або навіть менше за 99 % галактози і/або N-ацетилглюкозаміну відносно поліпептиду SAP дикого виду, отриманого з сироватки людини). У деяких варіантах здійснення, поліпептиди SAP цього винаходу містять N-зв'язаний або Озв'язаний олігосахаридний ланцюг, в якому одна, дві, три, чотири або п'ять гілок цього олігосахаридного ланцюга містять один або декілька манозних залишків. У деяких варіантах здійснення, поліпептид SAP цього винаходу містить N-зв'язаний олігосахарид, що має пентасахаридну серцевину Man[(1,6-)-(Man(1,3)]-Man(1,4)-GlcNAc(1,4)-GlcNAc(1,N)-Asn. Ця пентасахаридна серцевина може також містити один або декілька фукозних або ксилозних залишків. У деяких варіантах здійснення, поліпептиди SAP цього винаходу містять N-зв'язаний олігосахаридний ланцюг, в якому одна, дві, три, чотири або п'ять гілок цього олігосахаридного ланцюга мають структуру NeuNAc23Gal4GlcNAc2Man6. Поліпептиди SAP цього винаходу можуть також містити N-зв'язаний олігосахаридний ланцюг, в якому всі гілки мають структуру NeuNAc23Gal4GlcNAc2Man6. Варіантні поліпептиди SAP цього винаходу можуть містити один або декілька "модифікованих" цукрових залишків. Модифікований цукор заміщений в будь-якому положенні, яке дозволяє приєднання цієї модифікуючої частини або групи. У переважних аспектах, модифікований цукор заміщений в положенні, яке все ще дозволяє цукру функціонувати як субстрат для ферменту, що використовується для зв'язування цього модифікованого цукру з пептидом SAP. Модифікуюча група може бути приєднана до цукрової частини ферментативним способом, хімічним способом або їх комбінацією, з утворенням за допомогою цього модифікованого цукру, наприклад, модифікованої галактози, фукози або сіалової кислоти. Модифікуючі групи, що підходять для використання в даному винаході, а також способи кон'югації цих модифікуючих груп з цукровими залишками описані в наступному розділі. У переважних аспектах, варіантні поліпептиди SAP цього винаходу мають IC50 для інгібування диференціювання моноцитів в фібропласти in vitro, яка менше половини IC 50 відповідної проби SAP дикого типу, виділеного з сироватки людини. У деяких варіантах здійснення, варіантні поліпептиди SAP цього винаходу мають IC50 для інгібування диференціювання моноцитів в фіброцити in vitro, яка менше 1/3, менше 1/4, менше 1/10 або менше 1/100 IC50 відповідної проби SAP дикого типу, виділеного з сироватки людини. Варіантні поліпептиди SAP цього винаходу можуть бути щонайменше на 60 %, щонайменше на 70 %, щонайменше на 80 %, щонайменше на 85 %, щонайменше на 90 %, щонайменше на 95 %, щонайменше на 96 %, щонайменше на 97 %, щонайменше на 98 %, щонайменше на 99 % або 100 % ідентичні амінокислотній послідовності SEQ ID NO:1, як визначено з використанням комп'ютерної програми FASTDB на основі алгоритму Brutlag et al. (Comp. App. Biosci., 6:237-245 (1990)). В одному конкретному варіанті здійснення, параметри, що використовуються для розрахунку процентної ідентичності і схожості співставлення амінокислот включає в себе: Matrix=PAM 150, k-tuple=2, Mismatch Penalty (штраф за помилкове спаровування)=1, Joining Penalty (об'єднаний штраф)=20, Randomization Group Length (довжина групи рандомізації)=0, 8 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Cutoff Score (бальна оцінка відсікання)=1, Gap Penalty (штраф гепу)=5 і Gap Size Penalty (штраф розміру гепу)=0,05. Термін "поліпептид SAP" включає в себе функціональні фрагменти і злиті білки, що містять будь-які з попередніх. Звичайно, поліпептид SAP конструюють таким чином, що він є розчинним у водних розчинах при біологічно релевантних температурах, рівнях рН і осмолярності. Протомери SAP, які нековалентно асоціюються разом з утворенням пентамерного комплексу SAP, можуть мати ідентичні амінокислотні послідовності і/або посттрансляційні модифікації, або, альтернативно, окремі протомери SAP в єдиному комплексі можуть мати різні послідовності і/або модифікації. Термін поліпептид SAP включає в себе поліпептиди, що містять будь-який поліпептид SAP, що зустрічається в природі, а також його будь-який варіант (в тому числі мутанти, фрагменти і злиття). Поліпептид SAP цього винаходу може бути рекомбінантним поліпептидом. У переважних варіантах здійснення, поліпептид SAP цього винаходу є поліпептидом SAP людини. У деяких варіантах здійснення, забезпечені фармацевтичні композиції, що містять варіантний поліпептид SAP цього винаходу, або його функціональний фрагмент. У деяких аспектах, амінокислотна послідовність варіанту SAP може відрізнятися від SEQ ID NO:1 однією або декількома консервативними або неконсервативними замінами. У даному контексті, "консервативними замінами" є залишки, які є фізично або функціонально схожими з відповідними референсними залишками, тобто, консервативна заміна і її референсний залишок мають схожі розмір, форму, електричний заряд і/або хімічні властивості (наприклад, здатність утворення ковалентних або водневих зв'язків). Переважними консервативними замінами є заміни, що задовольняють критеріям, що визначаються відносно акцептованої точкової мутації в Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 (1978 & Supp.). Прикладами консервативних замін є заміни в наступних групах: (a) валін, гліцин; (b) гліцин, аланін; (с) валін, ізолейцин, лейцин; (d) аспарагінова кислота, глутамінова кислота; (е) аспарагін, глутамін; (f) серин, треонін; (g) лізин, аргінін, метіонін і (h) фенілаланін, тирозин. Додаткове керівництво, що стосується того, які амінокислотні зміни мають імовірність бути фенотипічно мовчазними, можуть бути знайдені в Bowie et al., Science 247:1306-1310 (1990). Варіантні поліпептиди SAP і їх фрагменти, які зберігають біологічну функцію, застосовні в фармацевтичних композиціях і способах, описаних в даному документі. У деяких варіантах здійснення, варіантний поліпептид SAP або його фрагмент зв'язує FcγRI, FcγRIIA і/або FcγRIIIB. У деяких варіантах здійснення, варіантний поліпептид SAP або його фрагмент інгібує диференціювання одного або декількох з групи, що складається з фіброцита, попередника фіброцита, попередника міофібробласта і/або попередника гемопоетичного моноцита. Варіанти SAP можуть бути генеровані модифікацією структури поліпептиду SAP для таких цілей, як посилення терапевтичної ефективності або стабільності (наприклад, час зберігання ex vivo і стійкість до протеолітичної деградації in vivo). У деяких аспектах, варіантні поліпептиди SAP цього опису можуть додатково містити посттрансляційні модифікації, нарівні з будь-якими модифікаціями, які природно присутні в поліпептиді SAP. Такі модифікації включають в себе, але не обмежуються ними, ацетилювання, карбоксилювання, глікозилування (наприклад, О-зв'язані олігосахариди, N-зв'язані олігосахариди і т.д.), фосфорилювання і ліпідування. У результаті, цей модифікований поліпептид SAP може містити елементи, що не є амінокислотами, такі як поліетиленгліколі, ліпіди, полі- або моносахариди і фосфати. У деяких аспектах, одна або декілька модифікацій у відношенні поліпептиду SAP, описані тут, можуть посилювати стабільність поліпептиду SAP. Наприклад, такі модифікації можуть збільшувати in vivo період напіввиведення поліпептиду SAP або зменшувати протеолітичну деградацію поліпептиду SAP. У деяких аспектах, варіантні поліпептиди SAP цього винаходу включають в себе злиті білки, що мають щонайменше частину поліпептиду SAP людини і один або декілька злитих доменів або гетерологічних частин. Добре відомі приклади таких злитих доменів включають в себе, але не обмежуються ними, полігістидин, Glu-Glu, глутатіон-S-трансферазу (GST), тіоредоксин, білок А, білок G і константну область важкого ланцюга імуноглобуліну (Fc), мальтозузв'язувальний білок (MBP) або сироватковий альбумін людини. Злитий домен може бути вибраний таким чином, щоб він надавав бажану властивість. Наприклад, такі злиті домени особливо застосовні для виділення злитих білків афінною хроматографією. Для мети афінного очищення, використовують релевантні матрикси для афінної хроматографії, такі як глутатіон-, амілаза- і нікель- або кобальт-кон'юговані смоли. Як інший приклад, злитий домен може бути вибраний таким чином, щоб полегшувати детектування поліпептидів SAP. Приклади таких доменів детектування включають в себе різні флуоресцентні білки (наприклад, GFP), а також "епітопні 9 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 мітки", які є звичайно короткими пептидними послідовностями, для яких доступне специфічне антитіло. Добре відомі епітопні мітки, для яких легко доступні специфічні моноклональні антитіла, включають в себе FLAG, гемаглютинін вірусу грипу (HA) і c-myc-мітки. У деяких випадках, ці злиті домени мають сайт розщеплення протеазою, який дозволяє релевантній протеазі частково розщеплювати ці злиті білки і за допомогою цього вивільняти з них рекомбінантний білок. Потім вивільнені білки можуть бути виділені із злитого домену подальшим хроматографічним розділенням. У деяких випадках, поліпептид SAP може бути злитий з гетерологічним доменом, який стабілізує поліпептид SAP in vivo. Під стабілізацією мається на увазі все, що збільшує період напіввиведення з сироватки, незалежно від того, чи є це зменшенням деструкції, зменшенням кліренсу ниркою або іншою фармакокінетичною дією. Відомо, що злиття з Fc-частиною імуноглобуліну і сироватковим альбуміном надає збільшеної стабільності. Зрозуміло, що різні елементи цих злитих білків можуть бути розташовані будь-яким чином, що узгоджується з бажаною функціональністю. Наприклад, поліпептид SAP може бути вміщений С-термінально відносно гетерологічного домену, або, альтернативно, гетерологічний домен може бути вміщений С-термінально відносно поліпептиду SAP. Поліпептид SAP і гетерологічний домен не повинні бути обов'язково поряд в злитому білку, і додаткові домени або амінокислотні послідовності (наприклад, лінкерні послідовності) можуть бути включені С- або N-термінально відносно будь-якого домену або між доменами. Способи отримання змінених N-глікозилованих молекул Тут описані способи отримання варіантних поліпептидів SAP людини. Ці способи звичайно включають в себе стадію приведення в контакт поліпептиду SAP з одним або декількома хімічними або ферментативними агентами для отримання або модифікації структури глікозилування на цьому поліпептиді SAP. Ці способи можуть бути засновані на клітинах або не бути засновані на клітинах. Ферменти, застосовні для отримання або модифікації структури гліканів, добре відомі в даній галузі. Більшість ферментів/білків, застосовних в способах цього опису, можуть бути класифіковані в один з двох функціональних класів: глікозилтрансферази і глікозидази. Глікозилтрансферазами (наприклад, N-ацетилглюкозамінілтрансферазами, галактозилтрансферазами, фукозилтрансферазами, сіалілтрансферазами, глюкозилтрансферазами, манозилтрансферазами і т.д.), в цьому контексті називають будь-який фермент/білок, який здатний перенести донорний цукор на акцепторну частину молекули. Глікозидазами (наприклад, глюкозидазами, манозидазами, N-ацетилглюкозамінідазами, сіалідазами, фукозидазами і т.д.), в даному контексті називають будь-який фермент/білок, який здатний каталізувати гідроліз глікозидного зв'язку між цукровими молекулами. Способи на основі клітин для отримання змінених глікоформ поліпептиду SAP використовують або клітини дикого типу (наприклад, клітини СНО), або генетично сконструйовані клітини, які мають щонайменше одну активність глікозилування відносно клітини людини. Клітини, що підходять для способів цього винаходу, включають в себе, наприклад, клітини грибів, прокаріотичні клітини (тобто бактерії, архебактерії), клітини рослин або клітини тварин (наприклад, нематоди, комахи, рослини, птахи, плазуна або ссавця (наприклад, миші, щура, кролика, хом'яка, піщанки, собаки, кішки, кози, свині, корови, коня, кита, мавпи або людини)). Ці клітини можуть бути первинними клітинами, іморталізованими клітинами або трансформованими клітинами. Такі клітини можуть бути отримані з різних комерційних джерел і ресурсів масового обслуговування досліджень, наприклад, Американської Колекції Типових Культур (Rockville, Md.). У деяких аспектах, клітиною, що використовується для отримання варіантного поліпептиду SAP, є клітина СНО. Термін "активність глікозилування" стосується будь-якої активності, яка (i) здатна додавати N-зв'язані або О-зв'язані глікани до молекули-мішені (тобто, олігосахарилтрансферазної активності); (ii) видаляти N-зв'язані або О-зв'язані глікани з молекули-мішені; (iii) модифікувати один або декілька N-зв'язаних або О-зв'язаних гліканів на молекулі-мішені; (iv) модифікувати доліхол-зв'язані олігосахариди; (v) здатна сприяти активності однієї або декількох активностей пунктів i-iv. Таким чином, активність глікозилування включає в себе наприклад, глікозидазну активність, глікозилтрансферазну активність, синтез, модифікацію або транспортерну активність нуклеотидних похідних цукру. Модифікація одного або декількох N-зв'язаних або О-зв'язаних гліканів на молекулі-мішені включає в себе дію манозилфосфорилтрансферазної активності, кіназної активності або фосфатазної активності, наприклад, манозилфосфорилтрансферазної, кіназної або фосфатазної активності, яка змінює стан фосфорилювання гліканів на молекулахмішенях. 10 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Сконструйовані клітини, що використовуються в способах цього опису винаходу, можуть мати одну або декілька генетичних модифікацій, що включають в себе, але що не обмежуються ними: (i) делецію ендогенного гену, що кодує білок, що має активність глікозилування; (ii) введення рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує мутантну форму білка (наприклад, ендогенного або екзогенного білка), що має активність глікозилування; (iii) введення або експресію молекули РНК, яка інтерферує з функціональною експресією білка, що має активність глікозилування; (iv) введення рекомбінантної нуклеїнової кислоти, що кодує білок дикого типу (наприклад, ендогенний або екзогенний), що має активність глікозилування; або (v) зміна елементів промоторів або енхансерів одного або декількох ендогенних генів, що кодують білки, що мають активність глікозилування, для зміни за допомогою цього експресії білків, що кодуються. Молекули РНК, описані вище, включають в себе, наприклад, малу інтерферуючу РНК (siRNA), коротку шпилькову РНК (shRNA), антисмислову РНК або мікро-РНК (miRNA). Зрозуміло, що пункт (ii) включає в себе, наприклад, заміну ендогенного гену (наприклад, гомологічною рекомбінацією) геном, що кодує білок, що має більш високу активність глікозилування відносно заміненого таким чином ендогенного гену. Описані тут генетично сконструйовані клітини мають одну або декілька змінених активностей глікозилування, таких як: (i) збільшення в одній або декількох активностях глікозилування в генетично модифікованій клітині, (ii) зменшення в одній або декількох активностях глікозилування в генетично модифікованій клітині, (iii) зміна в локалізації або внутрішньоклітинному розподілі однієї або декількох активностей глікозилування або (iv) зміна відносно однієї або декількох активностей глікозилування в генетично модифікованій клітині відносно немодифікованої клітини того ж походження. Зрозуміло, що збільшення у величині активності глікозилування може бути зумовлене надекспресією одного або декількох білків, що мають активність глікозилування, збільшенням копійності ендогенного гену (наприклад, дуплікацією гену) або зміною в промоторі, енхансері або супресорі ендогенного гену, який стимулює збільшення в експресії білка, що кодується цим геном. Зменшення в одній або декількох активностях може бути зумовлене надекспресією мутантної форми (наприклад, домінантно-негативної форми) одного або декількох білків, що мають змінену глікозилуванням активність, введенням одного або декількох білків, що мають змінену глікозилуванням активність, введенням або експресією однієї або декількох інтерферуючих РНК-молекул, які зменшують експресію одного або декількох білків, що мають активність глікозилування, або делецією одного або декількох генів, які кодують білок, що має активність глікозилування. Генетично сконструйовані клітини, що використовуються способами цього опису, можуть експресувати (наприклад, надекспресувати) гени дикого типу або мутантні гени, що кодують білки, що мають активність глікозилування. Такі гени включають в себе, але не обмежуються ними, ALG7, ALG13, ALG14, ALG1, ALG2, ALG11, RFT1, ALG3, ALG9, ALG12, ALG6, ALG8, ANL1, ALG10, ALG5, OST3, OST4, OST6, STT3, OST1, OST5, WBP1, SWP1, OST2, DPM1, SEC59, OCH1, MNN9, VAN1, MNN8, MNN10, MNN11, HOC1, MNN2, MNN5, MNN6, KTR1, YUR1, MNN4, KRE2, KTR2, KTR3, MNN1, MNS1, MNN4, PNO1, MNN9, глюкозидази I, глюкозидази II або ендоманозидази. Гени, що кодують білки, що мають активність глікозилування, можуть бути генами будь-якого виду (наприклад, нижчих еукаріот (наприклад, гриба (в тому числі дріжджів) або трипаносом), прокаріот (тобто, бактерій або архебактерій), рослини або тварини (наприклад, комахи, рослини, птаха, плазуна або ссавця (наприклад, миші або щура, собаки, кішки, коня, кози, корови, свині, примата не людини або людини). Зрозуміло, що генетично сконструйовані клітини, що використовуються для способів цього опису, можуть експресувати будь-яку кількість генів (наприклад, генів, що кодують білки, що мають активність глікозилування) і/або будь-яку комбінацію одного або декількох (наприклад, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 15 або 20 або більше) будь-якого з вищезазначених тут генів. Крім того, будь-які генетично сконструйовані клітини, що використовуються способами цього опису, можуть містити будь-яку кількість мутацій, які змінюють або анулюють одну або декілька активностей глікозилування. У деяких варіантах здійснення, термін "експресія генів" або "експресія" стосується клітинних процесів, за допомогою яких біологічно активний поліпептид продукується з ДНК-послідовності і проявляє біологічну активність в клітині. Така експресія генів включає в себе процеси транскрипції і трансляції, але також включає в себе посттранскрипційні і посттрансляційні процеси, які можуть впливати на біологічну активність гену або продукту гену. Ці процеси включають в себе, але не обмежуються ними, синтези, процесинг і транспорт РНК, а також синтез, транспорт і посттрансляційну модифікацію поліпептидів. Наприклад, цей опис забезпечує способи отримання поліпептиду SAP цього винаходу експресією гену SAP в клітині. У деяких варіантах здійснення, клітина може містити ендогенний 11 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ген SAP або його фрагмент. В інших варіантах здійснення, полінуклеотид, що кодує екзогенний поліпептид SAP або його фрагмент, може бути введений (наприклад, трансформований, трансфікований і т.д.) в клітину. Прийнятні полінуклеотиди SAP, які можуть бути введені в клітину, включають в себе фрагменти нуклеїнових кислот, а також конструкції нуклеїнових кислот або експресуючі вектори. У переважних варіантах здійснення, цей ендогенний або екзогенний ген кодує поліпептид SAP людини. У деяких варіантах здійснення, фрагмент нуклеїнової кислоти, наприклад, кодуючий поліпептид SAP людини, що використовується для трансформації клітини-хазяїна, може включати в себе сайт Шайна-Дальгарно (наприклад, сайт зв'язування рибосом) і стартовий сайт (наприклад, кодон ATG) для ініціації трансляції мессенджер-РНК, що транскрибується, з отриманням цього ферменту. Він може також включати в себе послідовність термінації послідовності для закінчення трансляції. Послідовність термінації звичайно є кодоном, для якого не існує відповідної аміноацетил-тРНК, що закінчує за допомогою цього синтез поліпептиду. У деяких варіантах здійснення, конструкція нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид SAP, може доставлятися, наприклад, у вигляді експресійної плазміди, яка при транскрипції в клітині, продукує поліпептид SAP. У деяких варіантах здійснення, прийнятний експресуючий вектор містить нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид SAP цього винаходу, функціонально зв'язану щонайменше з однією регуляторною послідовністю. Регуляторні послідовності є видопізнаваними і вибираються для управління експресією будь-якого з поліпептидів цього опису. Таким чином, термін регуляторна послідовність включає в себе промотори, енхансери і інші елементи, що регулюють експресію. Зразкові регуляторні послідовності описані в Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Наприклад, будь-яка регуляторна послідовність експресії, яка регулює експресію ДНК-послідовності, коли вона функціонально зв'язана з нею, може бути використана в цих векторах для експресії будь-якого з поліпептидів цього опису. Такі застосовні регуляторні послідовності експресії включають в себе, наприклад, ранній і пізній промотори SV40, промотор tet, негайно ранній промотор аденовіруса або цитомегаловіруса, систему lac, систему trp, систему TAC або TRC, промотор T7, експресія якого управляється РНК-полімеразою T7, основні райони оператора і промотора фага лямбда, регуляторні райони оболонки білка fd, промотор для 3-фосфогліцераткінази або інших гліколітичних ферментів, промотори кислої фосфатази, наприклад, Pho5, промотори факторів -спаровування дріжджів, поліедроновий промотор бакуловірусної системи і інші послідовності, про які відомо, що вони регулюють експресію генів прокаріотичних або еукаріотичних клітин або їх вірусів, і різні їх комбінації. Повинно бути зрозуміло, що конструювання експресуючого вектора може залежати від таких чинників, як вибір клітини-хазяїна для трансформації і/або тип білка, який бажано експресувати. Крім того, повинні розглядатися також копійність вектора, здатність регулювати цю копійність і експресувати будь-який інший білок, що кодується цим вектором, наприклад, антибіотичні маркери. У деяких варіантах здійснення, фрагмент нуклеїнової кислоти або система експресії, що використовується для трансформації клітини-хазяїна, можуть необов'язково включати в себе одну або декілька маркерних послідовностей. Кажучи загалом, прийнятні маркерні послідовності звичайно кодують продукт гену, звичайно фермент, який інактивує або іншим чином детектує сполуку або детектується сполукою в середовищі росту. Наприклад, включення маркерної послідовності може робити клітину, що трансформується, стійкою до антибіотика або вона може надавати сполука-специфічний метаболізм клітині, що трансформується. Приклади прийнятних маркерних послідовностей, які надають стійкості, включають в себе канаміцин, ампіцилін, хлорамфенікол і тетрациклін. Альтернативно, може бути використаний не тиск відбору, а маркерний ген, що дозволяє детектувати конкретні колонії, що містять цей ген, наприклад, -галактозидази, де використовується субстрат, який забезпечує забарвлений продукт. Багато які способи є прийнятними для трансформації клітини даного винаходу фрагментом нуклеїнової кислоти або експресуючим вектором. Звичайні способи трансформації включають в себе електропорацію, опосередковану ліпосомами трансформацію, кальцій-опосередковану трансформацію і опосередковану вірусом трансфекцію. У деяких аспектах, коли клітина-хазяїн трансформована фрагментом нуклеїнової кислоти або системою експресії даного винаходу, ген (наприклад, SAP людини) у вказаній системі може бути інтегрований в хромосомну ДНК клітин-хазяїнів так званою гомологічною рекомбінацією, і ця система експресії буде стабільно знаходитися в цьому хазяїні. 12 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Для інтегрування цієї системи експресії у векторі в хромосомну ДНК клітин-хазяїнів може бути використаний прийнятний маркерний ген відбору, причому вказаний маркерний ген має послідовність, гомологічну гену на хромосомній ДНК конкретної клітини-хазяїна. Маркери відбору для такої мети можуть бути легко відібрані кваліфікованим фахівцем. Як приклад, переважний маркер є геном, який існує на хромосомі і пов'язаний з метаболізмом цієї клітинихазяїна. А саме, переважним є використання хазяїна, який був модифікований таким чином, що вищезгаданий ген на цій хромосомі буде інактивований прийнятними засобами, такими як мутація. Потім цього хазяїна піддають гомологічній рекомбінації з експресуючим вектором, що містить інтактний ген, після чого можуть рости і бути відібрані тільки трансформанти, які містять нормальний ген метаболізму. Таким чином, якщо такий маркерний ген був введений в цей експресуючий вектор, буде мати місце гомологічна рекомбінація між цим маркерним геном у вказаному експресуючому векторі і відповідною частиною хромосомної ДНК, за допомогою чого ця експресійна касета гетерологічного гену буде одночасно інтегруватися в цю хромосомну ДНК. У деяких варіантах здійснення, термін "експресія" білка в клітині включає в себе також введення самого білка в ці клітини. Таким чином, в деяких аспектах, цей опис винаходу забезпечує способи отримання поліпептиду SAP цього винаходу введенням поліпептиду SAP в клітину. Способи введення поліпептидів безпосередньо в клітину відомі в даній галузі і звичайно включають в себе процес проникнення через мембрану клітини. Такі способи включають в себе, але не обмежуються ними, мікроін'єкцію поліпептидів SAP; інкапсулювання поліпептиду SAP в мембранних пухирцях (наприклад, ліпосомах, капсульних тілах, "тінях" еритроцитів, протопластах і т.д.) і контактування їх з мембраною клітини для викликання тим самим внутрішньоклітинного введення поліпептиду SAP злиттям; використання фізичних способів (наприклад, механічних, хімічних, електричних і т.д.), які засновані на проникненні макромолекул в клітини дифузією через отвори, що транзиторно вводяться в їх плазматичні мембрани (наприклад, навантаження з використанням соскобу, навантаження з використанням гранул і т.д.); і за допомогою поглинання через природний ендоцитоз внаслідок клітинного фагоцитозу. Спосіб внутрішньоклітинного введення може використати рецепторопосередкований шлях, в якому один з різних рецепторів, що експресуються на поверхні клітини, встановлюється як мішень, і поліпептид SAP приєднується (ковалентно або нековалентно) до спорідненого ліганду, який діє як частина-носій. Були описані декілька способів для введення білків в живі клітини з використанням електростатичної адсорбції, в яких цей білок спочатку катіонізували і потім контактували з негативно зарядженою поверхнею клітини (див. публікацію патенту Японії № 2004/049214). У деяких варіантах здійснення, цей опис забезпечує клітини СНО, які експресують поліпептид SAP. У деяких варіантах здійснення, ця клітина СНО експресує екзогенний поліпептид SAP. У переважних варіантах здійснення, ця клітина СНО експресує поліпептид SAP людини. У деяких варіантах здійснення, цей опис забезпечує клітини СНО, що містять полінуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид SAP. У переважних варіантах здійснення, ця полінуклеотидна послідовність кодує поліпептид SAP людини. Будь-який з вищезазначених способів може бути використаний для "експресії" поліпептиду SAP цього винаходу в клітині СНО або будь-якій іншій описаній тут прийнятній клітині. Коли будь-яка з описаної активності глікозилування клітини дикого типу або генетично сконструйованої клітини є такими, що індукуються або зумовленими присутністю індукуючого сигналу (наприклад, хімічного або фізичного сигналу), ця клітина дикого типу або генетично сконструйована клітина може, необов'язково, культивуватися в присутності індукуючого агента до, під час або після введення нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид SAP, або поліпептиду SAP. Наприклад, після введення поліпептиду SAP в клітину, вона може бути піддана дії хімічного індукуючого агента, який здатний посилювати експресію одного або декількох білків, що мають активність N-глікозилування дикого типу або змінену активність N-глікозилування. Коли множинні індукуючі сигнали індукують зумовлену ними експресію одного або декількох білків, що мають активність N-глікозилування дикого типу або змінену активність Nглікозилування, клітина може бути контактована із множинними індукуючими агентами. У деяких варіантах здійснення, культуральне середовище може бути модифіковане для отримання бажаної структури глікану на поліпептиді SAP. Наприклад, концентрація сироватки, глюкози і/або ліпіду (наприклад, доліхолу) цього середовища може бути модифікована для оптимального отримання бажаного гліковаріанту SAP. У деяких варіантах здійснення, температура, рН і/або осмолярність культурального середовища можуть бути змінені для оптимального отримання бажаного гліковаріанту SAP. 13 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Варіантний поліпептид SAP цього винаходу може бути додатково процесований in vivo або може бути процесований in vitro до або після виділення з клітини або середовища клітин. Цей додатковий процесинг може включати в себе модифікацію одного або декількох залишків глікану поліпептиду SAP або модифікацію у відношенні поліпептиду SAP, іншу, ніж модифікація структури (структур) гліканів. У деяких варіантах здійснення, цей додатковий процесинг поліпептиду SAP може включати в себе додавання (ковалентне або нековалентне приєднання) однієї або декількох гетерологічних частин молекули. У деяких варіантах здійснення, цей додатковий процесинг включає в себе ферментативну або хімічну обробку поліпептиду SAP. Ферментативна обробка може включати в себе приведення в контакт поліпептиду SAP з однією або декількома з глікозидази, фосфодіестерази, фосфоліпази, глікозилтрансферази або протеази протягом часу, достатнього для індукції модифікації, додавання або делеції гліканових залишків (наприклад, галактози, манози, фукози, сіалової кислоти, ксилози, Nацетилглюкозаміну і т.д.) на поліпептиді SAP. Виготовлення на замовлення N-зв'язаного олігосахаридного ланцюга може здійснюватися послідовною модифікацією, додаванням або делецією бажаних цукрових частин з використанням способів, добре відомих в даній галузі. Ферментативне розщеплення вуглеводних частин на пептидних варіантах може досягатися з використанням різних ендо- і екзоглікозидаз, як описано Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138: 350. Зразкові способи додавання цукрових частин описані в патентах США з номерами 5876980, 6030815, 5728554 і 5922577. У деяких варіантах здійснення, модифікація гліканової структури SAP вимагає присутності однієї або декількох нуклеотидних похідних цукру (сахаронуклеотидів). Зразкові сахаронуклеотиди, які використовуються в даному винаході, включають в себе моно-, ди- або трифосфати або їх аналоги. У переважному варіанті здійснення, цей модифікований сахаронуклеотид вибраний з УДФ-глікозиду, ЦМФ-глікозиду або ГДФ-глікозиду. Навіть більш переважно, цей сахаронуклеотид вибраний з УДФ-галактози, УДФ-галактозаміну, УДФ-глюкози, УДФ-глюкозаміну, ГДФ-манози, ГДФ-фукози, ЦМФ-сіалової кислоти, ЦМФ-Nгліколілнейрамінової кислоти або ЦМФ-NeuAc. У деяких варіантах здійснення, модифікований сахаронуклеотид використовують для додавання модифікованого цукрового залишку до поліпептиду SAP. N-ацетиламінпохідні цих сахаронуклеотидів також застосовні в цьому способі винаходу. Хімічне додавання або видалення глікозильних частин молекул може проводитися будьяким прийнятним способом. Наприклад, хімічне деглікозилування може включати в себе вплив трифторметансульфонової кислоти або іншої сильної кислоти на поліпептид SAP. Ця обробка приводить до відщеплення більшості або всього цукру, за винятком зв'язувального цукру (Nацетилглюкозаміну або N-ацетилгалактозаміну), із залишенням інтактного пептиду. Способи хімічного деглікозилування описані Haldmuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 і Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118: 131. Хімічна обробка може, наприклад, включати в себе приведення в контакт зміненого поліпептиду SAP з кислотою, такою як фтористоводнева кислота, протягом часу, достатнього для індукції модифікації поліпептиду SAP. Обробка фтористоводневою кислотою, при певних умовах, специфічно видаляє манозні залишки, які зв'язані фосфодіефірним зв'язком з гліканами, залишаючи фосфат на цьому глікані. Змінений поліпептид SAP може бути додатково процесований додаванням або видаленням фосфатної групи з одного або декількох N-гліканів. Наприклад, змінений поліпептид SAP може бути приведений в контакт з манозилкіназою або манозилфосфатазою. У деяких аспектах, бажано модифікувати тільки кінцеві цукрові частини на структурі глікану поліпептиду SAP (N-зв'язаного або О-зв'язаного олігосахариду). У деяких варіантах здійснення, одну або декілька гілок структури глікану SAP модифікують додаванням, видаленням, заміною або модифікацією щонайменше одного кінцевого залишку сіалової кислоти. Прийнятні способи модифікації гліканів, описані тут, можуть бути використані для зміни тільки кінцевої цукрової частини на структурі глікану SAP. У деяких варіантах здійснення, кінцевий залишок сіалової кислоти, що має 2,6-зв'язок, 2,8-зв'язок або 2,9-зв'язок, замінюють одним або декількома кінцевим 2,3-зв'язаними залишками сіалової кислоти. В одному конкретному аспекті, SAP людини, що містить кінцеві 2,6-зв'язані залишки сіалової кислоти, модифікують відповідно до одного зі способів даного опису для заміни одного або декількох кінцевих 2,6-зв'язаних залишків сіалової кислоти одним або декількома 2,3-зв'язаними залишками сіалової кислоти. У деяких варіантах здійснення, кінцевий 2,3-зв'язаний залишок сіалової кислоти модифікований для додавання одного або декількох 2,6-зв'язаних, 2,8-зв'язаних і/або 2,9 зв'язаних залишків сіалової кислоти. У деяких аспектах, спосіб отримання поліпептиду SAP цього винаходу включає в себе першу стадію деглікозилування поліпептиду SAP. Поліпептид SAP може бути частково або 14 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 повністю деглікозилований. У деяких варіантах здійснення, ця перша стадія деглікозилування включає в себе видалення тільки кінцевих цукрових частин щонайменше з однієї гілки структури глікану на поліпептиді SAP. У деяких варіантах здійснення, ця перша стадія деглікозилування видаляє щонайменше один 2,6-зв'язаний залишок сіалової кислоти. У деяких варіантах здійснення, ця перша стадія деглікозилування видаляє щонайменше один О-зв'язаний глікан. У деяких варіантах здійснення, ця перша стадія деглікозилування видаляє щонайменше один Nзв'язаний глікан. У деяких варіантах здійснення, ця перша стадія деглікозилування видаляє всі О-зв'язані і N-зв'язані глікани. У деяких варіантах здійснення, деглікозилований (частково або повністю) поліпептид SAP додатково процесується у відповідності зі способами цього опису, які включають в себе, але не обмежуються ними, ферментативну або хімічну модифікацію частково або повністю деглікозилованого поліпептиду SAP, введення цього частково або повністю деглікозилованого поліпептиду SAP в клітину, або їх комбінацію, де цей спосіб (ці способи) виробляють варіантний поліпептид SAP цього винаходу. У деяких варіантах здійснення, після введення частково або повністю деглікозилованого поліпептиду SAP в клітину, він може бути додатково модифікований, in vivo або in vitro, у відповідності зі способами цього опису для отримання варіантного поліпептиду SAP цього винаходу. Подібним чином, частково або повністю деглікозилований поліпептид SAP, який модифікований in vitro, з використанням ферментативних або хімічних способів, описаних тут, може бути введений в клітину для продукування варіантного поліпептиду SAP цього винаходу. Повинно бути зрозуміло, що поліпептид SAP цього винаходу може бути процесований, але необов'язково, в клітині. Наприклад, цей опис забезпечує також безклітинні способи отримання варіантного поліпептиду SAP цього винаходу. У деяких аспектах ці безклітинні способи включають в себе стадію приведення в контакт поліпептиду SAP, в умовах глікозилування, з клітинним лізатом, приготованим з клітини дикого типу (наприклад, клітини грибів, клітини рослини або клітини тварини) або генетично сконструйованої клітини, що має щонайменше одну модифіковану активність глікозилування, в якій контактування поліпептиду SAP з клітинним лізатом приєднує N-зв'язаний або О-зв'язаний олігосахарид до поліпептиду SAP або модифікує існуючий N-зв'язаний або О-зв'язаний олігосахарид на поліпептиді SAP. Під "умовами N-глікозилування" мається на увазі, що суміш (наприклад, поліпептиду SAP і клітинного лізату) інкубують при умовах, які роблять можливим бажане змінене Nглікозилування. Прийнятні способи для отримання клітинних лізатів, які зберігають активність або цілісність однієї або декількох активностей глікозилування в цьому лізаті, можуть включати в себе застосування прийнятних буферів і/або інгібіторів, що включають в себе інгібітори нуклеази, протеази і фосфатази, які зберігають або мінімізують зміни в активності N-глікозилування в цьому клітинному лізаті. Такі інгібітори включають в себе, наприклад, комплексоутворювачі, такі як етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕДТК), етиленгліколь-біс(Р-аміноетиловий ефір)N,N,N1,N1-тетраоцтова кислота (ЕГТА), інгібітори протеаз, такі як фенілметилсульфонілфторид (ФМСФ), апротинін, лейпептин, антипаїн, і інгібітори фосфатаз, такі як фосфат, фторид натрію і ванадат. Інгібітори можуть бути вибрані таким чином, що вони не перешкоджають активності, що представляє інтерес, або активності N-глікозилування або тільки мінімально впливають на активність, що представляє інтерес, або активності Nглікозилування. Прийнятні буфери і умови для отримання лізатів, що містять ферментативні активності, описані, наприклад, в Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999); Harlow and Lane, Antibodies: А Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Harlow and Lane, Using Antibodies: А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1999); Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd ed. Burtis and Ashwood, eds. W.B. Saunders, Philadelphia, (1999). Клітинний лізат може бути додатково процесований для елімінування або мінімізації присутності інтерферуючих речовин у разі необхідності. Якщо бажано, клітинний лізат може бути фракціонований будь-яким з безлічі способів, добре відомих кваліфікованим в даній галузі фахівцям, що включають в себе субклітинне фракціонування і хроматографічні способи, такі як іонообмінна, гідрофобна хроматографія і хроматографія із зверненою фазою, ексклюзивна хроматографія по розміру (гель-фільтрація), афінна хроматографія і гідрофобна хроматографія з індукцією заряду (див., наприклад, Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, third edition, Springer-Verlag, New York (1993); Burton and Harding, J. Chromatogr. А 814:71-81 (1998)) або будь-які інші прийнятні способи очищення. Може бути отриманий клітинний лізат, в якому всі клітинні органели залишаються інтактними і/або функціональними. Наприклад, лізат може містити один або декілька з інтактного зернистого ендоплазматичного ретикулуму, інтактного гладенького 15 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ендоплазматичного ретикулуму або інтактного апарату Гольджі. Прийнятні способи приготування лізатів, що містять інтактні клітинні органели, і випробування на функціональність цих органел описані, наприклад, в Moreau et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(7):4329-4333; Moreau et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(7):4322-4328; Rexach et al. (1991) J. Cell Biol. 114(2):219-229 і Paulik et al. (1999) Arch. Biochem. Biophys. 367(2):265-273; описи кожного з яких включені в даний опис за допомогою посилання в повному об'ємі. Поліпептид SAP може бути контактований усього лише з одним очищеним білком, що має активність глікозилування. У деяких варіантах здійснення, поліпептид SAP може бути контактований з більш ніж одним очищеним білком, що має активність глікозилування. Один або декілька білків, що мають активність глікозилування, можуть бути очищені з використанням стандартних способів виділення білків. Поліпептид SAP може бути контактований з одним або декількома білками у прийнятному буфері протягом часу, достатнього для індукції модифікації поліпептидів SAP, як описано вище. Поліпептид SAP може бути контактований з більш ніж одним білком одночасно або послідовно. Якщо поліпептид SAP контактують послідовно з більш ніж одним білком, що має активність глікозилування, поліпептид SAP може бути (необов'язково) очищений після однієї або декількох стадій. Тобто, поліпептид SAP може бути контактований з активністю "А" білка і потім очищений перед контактуванням цієї молекули з активністю "В" білка. Способи модифікації пептидів як таких, відомі в даній галузі, наприклад, Lee and Park (2002) 30(6):716-720 і Fujita and Takegawa (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 282(3):678682, описи яких включені в даний опис за допомогою посилання в повному об'ємі. У деяких аспектах, способи цього опису включають в себе стадію виділення поліпептиду SAP, наприклад, з клітин або з компонентів клітинного лізату. Багато які стандартні способи виділення білка відомі в даній галузі. Наприклад, способи виділення поліпептидів включають в себе, але не обмежуються ними, витіснювальну хроматографію (гель-фільтрацію), хроматографію із зверненою фазою, рідинну хроматографію (наприклад, HPLC), афінну хроматографію (наприклад, хроматографію з використанням хелатування металів або імуноафінну хроматографію), іонообмінну хроматографію, гідрофобну хроматографію, осадження, диференціальну солюбілізацію, імунопреципітацію, центрифугування (наприклад, ультрацентрифугування, центрифугування з сахарозним градієнтом і т.д.) або їх будь-які комбінації. У деяких варіантах здійснення, поліпептид SAP може бути кон'югований з афінною міткою для полегшення очищення цього поліпептиду. Прийнятні афінні мітки для очищення SAP включають в себе, але не обмежуються ними, хітинзв'язувальний білок (CBP), мальтозузв'язувальний білок (MBP), глутатіон-S-трансферазу (GST), стрептавідин, біотин і полі(His)-мітки. Афінні мітки можуть бути отримані у вигляді частини рекомбінантного білка (тобто у вигляді злитого білка, що містить гетерологічний домен афінної мітки і домен поліпептиду SAP) або приєднані (ковалентно або нековалентно) in vivo або in vitro до поліпептиду SAP. У деяких варіантах здійснення, можуть бути використані множинні стадії очищення для виділення поліпептиду SAP. Наприклад, поліпептид SAP, що містить мітку для очищення, може бути афінно очищений з клітинного лізату або багатокомпонентної суміші з використанням афінного очищення. Потім цей афінно очищений поліпептид SAP може бути додатково очищений для видалення мінорних небажаних забруднювачів додатковою стадією очищення, наприклад, витіснювальною хроматографією або ОФ-ВРХ. Якщо поліпептид цього винаходу продукується в клітині, цей поліпептид SAP може бути виділений з самої клітини або з середовища, в якому культивуються ці клітини. У деяких варіантах здійснення, поліпептиди SAP цього винаходу продукуються і секретуються з клітини в культуральне середовище. У цих варіантах здійснення, виділення може включати в себе відділення клітинної фракції від розчинної, SAP-вмісної фракції (наприклад, центрифугуванням). У деяких аспектах, може бути вигідним зв'язування поліпептиду SAP з твердофазним носієм перед контактуванням молекули-мішені з однією або декількома активністями N-глікозилування. Таке зв'язування може зробити можливим більш легке очищення після модифікацій Nглікозилуванням. Прийнятні твердофазні носії включають в себе, але не обмежуються ними, багатоямкові планшети для аналізів, частинки (наприклад, магнітні або частинки, що кодуються), хроматографічну колонку або мембрану. У деяких варіантах здійснення, будь-який із змінених поліпептидів SAP, описаних тут, може бути приєднаний до гетерологічної частини при допомозі ферментативних або хімічних способів. "Гетерологічною частиною" називають будь-який компонент, який приєднаний (наприклад, ковалентно або нековалентно) до зміненої молекули-мішені, причому цей компонент відрізняється від компонента, початково присутнього на цьому поліпептиді SAP. Гетерологічні частини включають в себе, наприклад, водорозчинні і не розчинні у воді полімери, що націлюють частини, терапевтичні частини, діагностичні частини і біомолекули. 16 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Поліпептиди SAP цього винаходу можуть містити один або декілька "модифікованих" цукрових залишків. Модифікуюча група може бути приєднана до цукрової частини ферментативними способами, хімічними способами або їх комбінацією, з отриманням за допомогою цього модифікованого цукру, наприклад, модифікованої галактози, фукози або сіалової кислоти. При використанні модифікованої сіалової кислоти, в цих способах може бути використана або сіалілтрансфераза, або транс-сіалідаза. Цей цукор може бути заміщений в будь-якому положенні, яке дозволяє приєднання модифікуючої частини, хоч все ще дозволяє цукру функціонувати як субстрат для ферменту, що використовується для сполучення цього модифікованого цукру з цим пептидом. Звичайно, цукрова частина і модифікуюча група зв'язані разом за допомогою використання реактивних груп, які звичайно перетворюються процесом зв'язування в нову органічну функціональну групу або в нереактивні частинки. Ця реактивна відносно цукру функціональна група (реактивні у відношенні цукру функціональні групи) можуть бути локалізовані в будь-якому положенні на цукровій частині. Реактивні групи і класи реакцій, що використовуються в застосуванні на практиці даного винаходу, звичайно є групами і класами реакцій, які добре відомі в галузі хімії біокон'югатів. Існуючі переважні класи реакцій, доступні з реактивними відносно цукру частинами, є класами реакцій, які протікають при відносно м'яких умовах. Вони включають в себе, але не обмежуються ними, нуклеофільні заміни (наприклад, реакції амінів і спиртів з ацилгалогенідами, активними складними ефірами), електрофільні заміни (наприклад, реакції з енамінами) і додавання множинних зв'язків вуглець-вуглець і вуглець-гетероатом (наприклад, реакція Міхаеля, реакція Дільса-Альдера). Ці і інші застосовні реакції обговорюються, наприклад, в Smith and March, Advanced Organic Chemistry, 5th Ed., John Wiley & Sons, New York, 2001; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; і Feeney et al., Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982. Застосовні реактивні функціональні групи, що звішуються з цукрового ядра або модифікуючої групи, включають в себе, але не обмежуються ними: (a) карбоксильні групи і їх різні похідні (наприклад, складні ефіри N-гідроксисукциніміду, складні ефіри Nгідроксибензотриазолу, галогенангідриди кислот, ацилімідазоли, складні тіоефіри, складні пнітрофенілові ефіри, складні алкілові, алкенілові, алкінілові і ароматичні ефіри); (b) гідроксильні групи, які можуть бути перетворені, наприклад, в складні ефіри, прості ефіри, альдегіди і т.д.; (с) галогеналкільні групи, в яких галоген може бути пізніше витіснений нуклеофільною групою, такою як, наприклад, амін, карбоксилатний аніон, карбаніон або алкоксидний іон, з отриманням за допомогою цього ковалентного приєднання нової групи в функціональній групі атома галогену; (d) діенофільні групи, які здатні брати участь в реакціях Дільса-Альдера, такі як, наприклад, малеімідогрупи; (е) альдегідні або кетонові групи, так що подальша дериватизація можлива через утворення карбонільних похідних, таких як, наприклад, іміни, гідразони, семікарбазони або оксими, або через такі механізми, як реакція (приєднання) Гріньяра або приєднання алкіллітію; (f) сульфонілгалогенідні групи для подальшої реакції з амінами, наприклад, для утворення сульфонамідів; (е) тіолові групи, які можуть бути, наприклад, перетворені в дисульфіди або реагувати з алкіл- і ацилгалогенідами; (h) амінні або сульфгідрильні групи, які можуть бути, наприклад, ацильовані, алкіловані або окислені; (i) алкени, які можуть зазнавати, наприклад, циклоприєднання, ацилювання, реакції приєднання Міхаеля, метатезису (реакції обміну), реакції Хека і т.д.; (j) епоксиди, які можуть реагувати, наприклад, з амінами і гідроксильними сполуками. Ці реакційноздатні функціональні групи можуть бути вибрані таким чином, що вони не беруть участі в реакціях, необхідних для збирання реакційноздатних цукрового ядра або модифікуючої групи, або не перешкоджають цим реакціям. Альтернативно, реакційноздатна функціональна група може бути захищена від участі в цій реакції присутністю захисної групи. Кваліфікованим в даній галузі фахівцям зрозуміло, як захистити конкретну функціональну групу таким чином, що вона не перешкоджає вибраному набору умов реакції. Відносно прикладів застосовних захисних груп, див., наприклад, Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991. У деяких варіантах здійснення, модифікований цукор є активованим цукром. Активовані модифіковані цукри, що використовуються в даному винаході, звичайно є глікозидами, які були синтетично змінені для включення активованої групи, що видаляється. У даному контексті, термін "активована група, що видаляється" стосується частин молекул, які легко витісняються в регульованих ферментом нуклеофільних реакціях заміщення. Багато які активовані цукри відомі в даній галузі. Див., наприклад, Vocadlo et al., In Carbohydrate Chemistry and Biology, Vol. 2, Ernst et al. Ed., Wiley-VCH Verlag: Weinheim, Germany, 2000; Kodama et al., Tetrahedron Lett. 34: 6419 17 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (1993); Lougheed, et al., J. Biol. Chem. 274: 37717 (1999)). Приклади таких груп, що видаляються, включають в себе фтор, хлор, бром, тозилат, мезилат, трифлат і т.п. Переважні активовані групи, що видаляються, для застосування в даному винаході, є групами, які не утруднюють значно стерично ферментативне перенесення глікозиду до акцептора. Таким чином, переважні варіанти здійснення активованих глікозидних похідних включають в себе глікозилфториди і глікозилмезилати, причому глікозилфториди є особливо переважними. Серед глікозилфторидів, найбільш переважними є -галактозилфторид, -манозилфторид, -глюкозилфторид, фукозилфторид, -ксилозилфторид, -сіалілфторид, -N-ацетилглюкозамінілфторид, -Nацетилглюкозамінілфторид, -галактозилфторид, -манозилфторид, -глюкозилфторид, фукозилфторид, -ксилозилфторид, -сіалілфторид, -N-ацетилглюкозамінілфторид і -Nацетилгалактозамінілфторид. У деяких аспектах, модифікований цукровий залишок кон'югований з одним або декількома водорозчинними полімерами. Багато які водорозчинні полімери відомі кваліфікованим в даній галузі фахівцям і застосовні в практиці даного винаходу. Термін водорозчинний полімер включає в себе такі молекулярні частинки, як сахариди (наприклад, декстран, амілозу, гіалуронову кислоту, полі(сіалову кислоту), гепарани, гепарини і т.д.); полі(амінокислоти); нуклеїнові кислоти; синтетичні полімери (наприклад, полі(акрилову кислоту), прості полі(ефіри), наприклад, полі(етиленгліколь)); пептиди, білки і т.п. Даний винахід може здійснюватися з будьяким водорозчинним полімером з єдиним обмеженням, що цей полімер повинен включати в себе точку, в якій може бути приєднана інша частина цього кон'югату. Способи і хімія для активації водорозчинних полімерів і сахаридів, а також способи кон'югування сахаридів і полімерів з різними молекулярними частинками описані в літературі. Способи активації полімерів, що звичайно використовуються, включають в себе активацію функціональних груп ціаногенбромідом, періодатом, глутаральдегідом, біепоксидами, епіхлоргідрином, дивінілсульфоном, карбодіімідом, сульфонілгалогенідами, трихлортриазином і т.д. (див., R. F. Taylor, (1991), Protein Immobilization, Fundamentals and Applications, Marcel Dekker, S. S. Wong, (1992), Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al., (1993), Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, N.Y.; Dunn, R. L., et al., Eds. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991). У деяких аспектах, модифікований цукровий залишок кон'югують з одним або декількома водонерозчинними полімерами. У деяких варіантах здійснення, кон'югація водонерозчинного полімеру може бути використана для доставки терапевтичного пептиду регульованим чином. Полімерні системи доставки лікарських засобів відомі в даній галузі. Див., наприклад, Dunn et al., Eds. Polymeric drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D. C. 1991. Кваліфікованим в даній галузі фахівцям буде зрозуміло, що по суті будь-яка відома система доставки лікарських засобів застосовна до кон'югатів даного винаходу. Репрезентативні водонерозчинні полімери включають в себе, але не обмежуються ними, поліфосфазени, полі(вінілові спирти), поліаміди, полікарбонати, поліалкілени, поліакриламіди, поліалкіленгліколі, поліалкіленоксиди, поліалкілентерефталати, прості полівінілові ефіри, складні полівінілові ефіри, полівінілгалогеніди, полівінілпіролідон, полігліколіди, полісилоксани, поліуретани, полі(метилметакрилат), полі(етилметакрилат), полі(бутилметакрилат), полі(ізобутилметакрилат), полі(гексилметакрилат), полі(ізодецилметакрилат), полі(лаурилметакрилат), полі(фенілметакрилат), полі(метилакрилат), полі(ізопропілакрилат), полі(ізобутилакрилат), полі(октадецилакрилат), поліетилен, поліпропілен, полі(етиленгліколь), полі(етиленоксид), полі(етилентерефталат), полі(вінілацетат), полівінілхлорид, полістирол, полівінілпіролідон, плюроніки і полівінілфенол, і їх співполімери. Ці та інші полімери, що обговорюються в даному описі, можуть бути легко отримані з комерційних джерел, таких як Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.), Polysciences (Warrenton, Pa.), Aldrich (Milwaukee, Wis.), Fluka (Ronkonkoma, і BioRad (Richmond, Calif), або синтезовані з мономерів, що отримуються від цих постачальників, з використанням стандартних способів. Репрезентативні полімери, що біологічно деградуються, що використовуються в кон'югатах цього винаходу, включають в себе, але не обмежуються ними, поліактиди, полігліколіди і їх співполімери, полі(етилентерефталат), полі(масляну кислоту), полі(валеріанову кислоту), полі(співполімер лактиду і капролактону), полі(співполімер лактиду і гліколіду), поліангідриди, поліортоефіри, їх суміші і співполімери. Особливо застосовні композиції, які утворюють гелі, такі як композиції, що включають в себе колаген, і плюроніки. В одному переважному варіанті здійснення, один або декілька модифікованих цукрових залишків кон'югують з однією або декількома молекулами ПЕГ. 18 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких аспектах, цей модифікований цукор кон'югують з біомолекулою. Біомолекули цього винаходу можуть включати в себе, але не обмежуються ними, функціональні білки, ферменти, антигени, антитіла, пептиди, нуклеїнові кислоти (наприклад, окремі нуклеотиди або нуклеозиди, олігонуклеотиди, полінуклеотиди і одноланцюгові нуклеїнові кислоти або нуклеїнові кислоти з великою кількістю ланцюгів), лектини, рецептори або їх комбінацію. Деякі переважні біомолекули є по суті нефлуоресцентними або випускають таку мінімальну кількість флуоресценції, що вони не придатні для використання як флуоресцентний маркер в аналізі. Інші біомолекули можуть бути флуоресцентними. У деяких варіантах здійснення, біомолекула є націлюючою частиною молекули. Термін "націлююча частина" і "націлюючий агент", в даному контексті, стосується молекулярних частинок, які селективно локалізуються в конкретній тканині або області тіла. У деяких варіантах здійснення, біомолекула вибрана для напряму поліпептиду SAP цього винаходу до конкретного внутрішньоклітинного компартменту, для посилення за допомогою цього доставки цього пептиду до цього внутрішньоклітинного компартменту відносно кількості недериватизованого пептиду, який доставляється до цієї тканини. Ця локалізація опосередкована специфічним пізнаванням молекулярних детермінант, молекулярним розміром націлюючого агента або кон'югату, іонними взаємодіями, гідрофобними взаємодіями і т.п. Інші механізми націлення агента на конкретні тканини або район відомі кваліфікованим в даній галузі фахівцям. У деяких варіантах здійснення, цей модифікований цукор включає в себе терапевтичну частину. Кваліфікованим в даній галузі фахівцям буде зрозуміло, що є перекриття між категорією терапевтичних частин і категорією біомолекул, тобто, багато які біомолекули мають терапевтичні властивості або терапевтичний потенціал. Класи застосовних терапевтичних частин молекул включають в себе, наприклад, нестероїдні протизапальні лікарські засоби; стероїдні протизапальні лікарські засоби; ад'юванти; антигістамінні лікарські засоби; протикашльові лікарські засоби; протизудні лікарські засоби; антихолінергічні лікарські засоби; протиблювотні лікарські засоби і лікарські засоби проти нудоти; лікарські засоби проти анорексії; стимулюючі засоби центральної дії; лікарські засоби проти аритмії; лікарські засоби проти -адренергічного блокатора; кардіотонічні лікарські засоби; антигіпертензивні лікарські засоби; діуретичні лікарські засоби; судинорозширювальні лікарські засоби; судинозвужувальні лікарські засоби; противиразкові лікарські засоби; анестезуючі лікарські засоби; антидепресантні лікарські засоби; транквілізуючі і седативні лікарські засоби; антипсихотичні лікарські засоби і антимікробні лікарські засоби. Інші лікарські частини, застосовні в здійсненні даного винаходу, включають в себе протипухлинні лікарські засоби, агенти, що руйнують клітини, антиестрогени і антиметаболіти. У цьому класі включені також агенти на основі радіоізотопів як для діагностики (наприклад, візуалізації), так і для терапії, і кон'юговані токсини. Терапевтична частина може бути також гормоном, міорелаксантом, протисудинним засобом, агентом, що активує кістки, ендокринним модулюючим агентом, модулятором діабету, андрогеном, антидіуретичними засобами або кальцитоніновим лікарським засобом. Інші застосовні модифікуючі групи включають в себе імуномодулюючі лікарські засоби, імуносупресори і т.д. Використовуються також групи з протизапальною активністю, такі як суліндак, етодолак, кетопрофен і кеторолак. Інші лікарські засоби для застосування разом з даним винаходом, будуть очевидними кваліфікованим в даній галузі фахівцям. Поліпептиди SAP із зміненим N-глікозилуванням, що отримуються способами цього опису, можуть бути гомогенними (тобто, проба поліпептиду SAP є однорідною в специфічній структурі N-глікану) або по суті гомогенними. Під терміном "по суті гомогенні" мається на увазі, що щонайменше близько 25 % (наприклад, щонайменше близько 27 %, щонайменше близько 30 %, щонайменше близько 35 %, щонайменше близько 40 %, щонайменше близько 45 %, щонайменше близько 50 %, щонайменше близько 55 %, щонайменше близько 60 %, щонайменше близько 65 %, щонайменше близько 70 %, щонайменше близько 75 %, щонайменше близько 80 %, щонайменше близько 85 %, щонайменше близько 90 % або щонайменше близько 95 % або щонайменше близько 99 %) поліпептидів SAP містять одну і ту ж специфічну структуру N-глікану. У деяких варіантах здійснення, варіантні поліпептиди SAP цього винаходу мають IC 50 для інгібування диференціювання моноцитів в фіброцити in vitro, яка дорівнює менше за 1/2, менше за 1/3, менше за 1/4, менше за 1/10 або менше за 1/100 IC50 відповідної проби SAP дикого типу, виділеного з сироватки людини. Існують багато добре охарактеризованих способів визначення чутливості мононуклеарних клітин периферичної крові (PBMC) або клітин-моноцитів до SAP для диференціювання фіброцитів. Ці способи можуть бути використані для визначення відносної ефективності будь-якого з варіантних поліпептидів SAP цього винаходу в порівнянні з пробою, 19 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 отриманою з сироватки людини SAP, будь-яким іншим варіантним поліпептидом SAP або іншим супресором або активуючим агентом фіброцитів. PBMC або моноцити, що підходять для застосування в цих способах, можуть бути отримані з різних ліній культури тканини. Альтернативно, прийнятні клітини для аналізів диференціювання фіброцитів можуть бути отримані з біологічної проби, яка містить PBMC або клітини-моноцити. Біологічна проба може бути отримана з сироватки, плазми, здорової тканини або фіброзної тканини. Звичайно, аналізи диференціювання фіброцитів проводять інкубуванням PBMC або клітин-моноцитів в середовищах з різними концентраціями поліпептиду SAP для визначення ступеня диференціювання фіброцитів. Концентрація SAP може знаходитися в діапазоні від 0,0001 мкг/мл до 1 мг/мл, і, в деяких варіантах здійснення, дорівнює 0,001 мкг/мл, 1,0 мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 15 мкг/мл, 20 мкг/мл, 25 мкг/мл, 30 мкг/мл, 35 мкг/мл, 40 мкг/мл, 45 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 200 мкг/мл, 300 мкг/мл або 500 мкг/мл. У деяких аналізах, ці середовища можуть бути доповнені 1-100 нг/мл hMCSF; причому переважна концентрація hMCSF дорівнює 25 нг/мл. Вказівка на те, що PBMC і моноцити диференціювалися в фіброцити, може бути визначена кваліфікованим в даній галузі фахівцем. Звичайно, фіброцити морфологічно визначаються у вигляді прикріплених клітин з формою подовженого веретена і з присутністю овального ядра. У деяких аналізах, клітини фіксують і забарвлюють Hema 3 перед підрахунком фіброцитів прямим підрахунком, наприклад, з використанням інвертованого мікроскопа. Величина диференціювання фіброцитів інтерпретується кваліфікованим в даній галузі фахівцем у вигляді показника чутливості клітини до SAP. Як показано прикладами цього опису, більш висока супресія диференціювання фіброцитів вказує на більш високий ступінь чутливості до SAP. Альтернативний спосіб вимірювання диференціювання фіброцитів включає в себе визначення експресії фіброцит-специфічних маркерів клітинної поверхні або факторів, що секретуються, наприклад, цитокінів (наприклад, IL-1ra, ENA-78/CXCL-5, PAI-1), фібронектину, колагену-1. Способи детектування і/або кількісного визначення маркерів клітинної поверхні або факторів, що секретуються, добре відомі в даній галузі, і вони включають в себе, але не обмежуються ними, різні способи на основі ELISA і FACS, що використовують імунореактивні антитіла проти одного або декількох фіброцит-специфічних маркерів. Як описано в прикладах цього опису, вимірювання експресії отриманого з макрофагів хемокіну (MDC) є одним з ефективних способів визначення диференціювання фіброцитів. Способи детектування і/або характеристики N-глікозилування (наприклад, зміненого Nглікозилування) поліпептиду SAP включають в себе електрофорез вуглеводів з використанням ДНК-секвенатора (DSA), з використанням флуорофора (FACE) або час-пролітної масспектрометрії з лазерною десорбцією і іонізацією (SELDI-TOF MS). Наприклад, аналіз може використовувати DSA-FACE, в якому, наприклад, глікопротеїни денатуруються після імобілізації, наприклад, на мембрані. Потім ці глікопротеїни можуть бути відновлені прийнятним відновлювальним агентом, таким як дитіотреїтол (DATA) або -меркаптоетанол. Сульфгідрильні групи білків можуть бути карбоксильовані з використанням кислоти, такої як йодоцтова кислота. Потім, N-глікани можуть бути вивільнені з цього білка з використанням ферменту, такого як Nглікозидаза F. N-глікани можливо, необов'язково, відтворені і дериватизовані відновним амінуванням. Потім ці дериватизовані N-глікани можуть бути сконцентровані. Обладнання, що підходить для аналізу N-глікану, включає в себе, наприклад, ДНК-секвенатор ABI PRISMо 377 (Applied Biosystems). Аналіз даних може виконуватися з використанням, наприклад, програми GENESCAN. 3.1 (Applied Biosystems). Необов'язково виділені маннопротеїни можуть бути додатково оброблені одним або декількома ферментами для підтвердження їх N-гліканового статусу. Зразкові ферменти включають в себе, наприклад, -манозидазу або -1,2-манозидазу. Додаткові способи аналізу N-гліканів включають в себе, наприклад, мас-спектрометрію (наприклад, MALDI-TOF-MS), рідинну хроматографію високого тиску (HPLC) на нормальній фазі, оберненій фазі і іонообмінну хроматографію (наприклад, з імпульсним амперометричним детектування, коли глікани не є міченими, і з УФ-поглинанням або флуоресценцією, якщо глікани є відповідним чином міченими). Див., також статті Callewaert et al. (2001) Glycobiology 11(4):275-281 і Freire et al. (2006) Bioconjug. Chem. 17(2):559-564, описи кожної з яких включені в даний документ за допомогою посилання в їх повному об'ємі. Способи лікування В одному аспекті, цей опис забезпечує способи лікування чутливого до SAP порушення у пацієнта введенням терапевтично ефективної кількості варіантного поліпептиду SAP цього винаходу пацієнту, який потребує цього. Доза і частота обробки можуть бути визначені кваліфікованим в даній галузі фахівцем і буде варіюватися в залежності від симптомів, віку і маси тіла пацієнта і характеру і тяжкості порушення, що підлягає лікуванню або запобіганню. У деяких варіантах здійснення, варіантний поліпептид SAP вводять пацієнту один або два рази на 20 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 день, один раз або два рази на тиждень, один раз або два рази на місяць або безпосередньо до появи симптомів або при появі симптомів. Дози можуть бути легко визначені способами, відомими кваліфікованим в даній галузі фахівцям або описаними тут. Токсичність і терапевтична ефективність SAP може бути визначена стандартними фармацевтичними процедурами на експериментальних тваринах, наприклад, визначенням LD50 і ED50. ED50 (ефективна доза 50) є кількістю лікарського засобу, необхідною для отримання вказаного ефекту в 50 % популяції тварин. LD50 (летальна доза 50) є дозою лікарського засобу, яка вбиває 50 % популяції проби. У деяких експериментах, чутливе до SAP порушення є фіброзом. Застосування SAP як терапевтичне лікування для фіброзу описане в заявці на патент США № 2007/0243163, яка включена в даний опис за допомогою посилання. Пов'язані з фіброзом порушення, які піддаються лікуванню способом, що розглядається, включають в себе, але не обмежуються ними, колагенову хворобу, інтерстиціальну хворобу легень, фіброзуючу хворобу легень (наприклад, облітеруючий бронхіоліт, ідіопатичний легеневий фіброз, пневмофіброз відомої етіології, пухлинну строму в легеневому захворюванні, системний склероз, що ушкоджує легені, синдром Херманського-Пудлака, пневмоконіоз у шахтарів, асбестоз, хронічну легеневу гіпертензію, СНІД-асоційовану легеневу гіпертензію, саркоїдоз, помірну або важку астму і т.п.), фіброзуюче судинне захворювання, артеріальний склероз, атеросклероз, варикозні вени, коронарні інфаркти, інфаркти головного мозку, інфаркти міокарда, м'язовоскелетний фіброз, післяопераційні спайки, хворобу нирок людини (наприклад, нефротичний синдром, синдром Альпорта, ВІЛ-асоційовану нефропатію, полікістозне захворювання нирок, хворобу Фабрі, діабетичну нефропатію, хронічний гломерулонефрит, нефрит, асоційований з системним червоним вовчаком і т.п.), прогресуючий системний склероз (PSS), первинний холангіт, що утворює фестончатість (PSC), фіброз печінки, цироз печінки, нирковий фіброз, пневмофіброз, муковісцидоз (фіброзно-кістозну дегенерацію підшлункової залози), хронічну хворобу трансплантат проти хазяїна, склеродермію (локальну або системну), базедову хворобу (хворобу Грейвса), діабетичну ретинопатію, глаукому, хворобу Пейроні, фіброз пеніса, уретростеноз після цистоскопа, внутрішнє розростання після хірургії, утворення рубців, мієлофіброз, ідіопатичний ретроперитонеальний фіброз, перитонеальний фіброз відомої етіології, індукований лікарським засобом ерготизм, фіброз, супутні доброякісному або злоякісному раку, фіброз, супутній мікробній інфекції (наприклад, вірусній, бактерійній, паразитарній, грибковій і т.д.), хворобу Альцгеймера, фіброз, що супроводжує запальне захворювання травного тракту (що включає в себе утворення стриктури у разі хвороби Крона і мікроскопічного коліту), пухлини стромальних клітин, мукозит, фіброз, індукований хімічним пошкодженням або пошкодженням фактором навколишнього середовища (наприклад, хіміотерапією раку, пестицидами або опроміненням (наприклад, раковою радіотерапією). У деяких варіантах здійснення, пов'язане з фіброзом порушення вибране з системної або локальної склеродермії, келоїдів, гіпертрофічних рубців, атеросклерозу, рестенозу, запалення легень і фіброзу, ідіопатичного легеневого фіброзу, цирозу печінки, фіброзу як результату хронічної інфекції гепатиту В або С, захворювання нирок, серцевого захворювання, що виникає через рубцову тканину, дегенерацію жовтої плями, і ретинальну і вітреальну ретинопатію. У деяких варіантах здійснення, пов'язане з фіброзом порушення виникає через хіміотерапевтичні лікарські засоби, індукований опроміненням фіброз і пошкодження і опіки. У деяких варіантах здійснення, пов'язані з фіброзом порушення або стан виникає внаслідок післяопераційного утворення рубців, наприклад, після трабекулектомії або іншої фільтруючої операції ока. У деяких варіантах здійснення, чутливе до SAP порушення є алергічним порушенням, такими як порушення, опосередковані реакціями Th1 або Th2. Застосування SAP як терапевтичне лікування для алергічних порушень описане також в заявці на патент США № 61/209795, яка включена в даний опис за допомогою посилання. Пов'язані з алергією порушення, які можуть піддаватися лікуванню SAP, включають в себе, але не обмежуються ними, алергічний риніт, алергічний синусит, алергічний кон'юнктивіт, алергічну бронхоконстрикцію, алергічну задишку, алергічне збільшення утворення слизу в легенях, атопічну екзему, дерматит, кропивницю, анафілаксію, пневмонію і алергічну астму. У деяких варіантах здійснення, варіантний поліпептид SAP цього винаходу може бути використаний для лікування алергенспецифічних імунних реакцій, таких як анафілаксія, на різні антигени, що включають в себе, але що не обмежуються ними, антимікробні засоби (наприклад, цефалоспорини, сульфонаміди, пеніцилін і інші -лактами), протисудомні засоби (наприклад, фенітоїн, фенобарбітал, карбамазепін, дапсон, алопуринол і міноциклін), хімітерапевтики (наприклад, таксани, сполуки платини, аспарагінази і епіподофілотоксини), гепарин, інсулін, протамін, аспірин і інші нестероїдні протизапальні лікарські засоби, міорелаксанти (наприклад, 21 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 сукцинілхолін, атракурій, веркуроній і панкуроній), індукційні агенти (наприклад, барбітурати, етомідат, пропофол), наркотики (наприклад, фентаніл, меперидин, морфін), колоїди для розширення внутрішньосудинного об'єму, радіоконтрастні матеріали, продукти крові, латекс, продукти тварин, лупа тварин, кліщі пилу, комахи (наприклад, укуси, ужалення або отрута), косметичні засоби, метали (наприклад, нікель, кобальт і хромат), рослини, спори, пилок, їжу (наприклад, молоко, яйця, пшеницю, сою, арахіс і деревні горіхи, морські продукти), вакцинацію, і антигени грибів (наприклад, види Aspergillus, Curvularia, Exserohilum, і Alternaria). У деяких варіантах здійснення, чутливе до SAP порушення є аутоімунним порушенням, такими як порушення, опосередковані реакціями Th1 або Th2. Застосування SAP як терапевтичне лікування для цих аутоімунних порушень описане також в Попередній заявці на патент США № 61/209845, яка включена тут за допомогою посилання. Аутоімунні порушення, які можуть піддаватися лікуванню SAP, включають в себе, але не обмежуються ними, діабет типу I, розсіяний склероз, ревматоїдний артрит, псоріатичний артрит, аутоімунний міокардит, звичайну пухирчатку (пемфігус), важку псевдопаралітичну міастенію, аутоімунний тиреоїдит Хашимото, хворобу Грейвса, хворобу Аддісона, аутоімунний гепатит, хронічний артрит Лайма, спадкову застійну (дилатаційну кардіоміопатію, ювенільний дерматоміозит, поліхондрит, синдром Шегрена, псоріаз, ювенільний ідіопатичний артрит, запальну хворобу травного тракту, системний червоний вовчак, хронічне обструктивне захворювання легень і хворобу трансплантат проти хазяїна. У деяких варіантах здійснення, чутливе до SAP порушення є запаленням слизової оболонки. Застосування SAP як терапевтичне лікування для запалення слизової оболонки описане також в заявці на патент США № 12/217614, яка включена тут за допомогою посилання. Способи цього винаходу можуть бути застосовні для лікування запалення слизової оболонки порожнини рота, стравоходу і шлунково-кишкового тракту, а також раку шлунку і дванадцатипалої кишки або ерозій шлунка і стравоходу. У деяких варіантах здійснення, варіантний поліпептид SAP цього винаходу може бути використаний для лікування запального захворювання або стану. У деяких варіантах здійснення, це запальне захворювання може бути вірусною, бактерійною або паразитарною інфекцією. Застосування SAP як терапевтичне лікування для вірусної інфекції було також описане в патенті США № 6406698 і в Міжнародній заявці на патент № WO 1997/026906, які включені тут за допомогою посилання. Фармацевтичні препарати і композиції У деяких варіантах здійснення, описані тут способи включають в себе введення щонайменше одного варіантного поліпептиду SAP цього винаходу суб'єкту як терапевтичного агента. Терапевтичні агенти цього винаходу можуть бути приготовані загальноприйнятим чином з використанням одного або декількох фізіологічно прийнятних носіїв або ексципієнтів. Наприклад, терапевтичні агенти і їх фізіологічно прийнятні солі і сольвати можуть бути приготовані для введення, наприклад, ін'єкцією (наприклад, SubQ, IM, IP), інгаляцією або інсуфляцією (або через рот, або через ніс) або пероральним, букальним, під'язиковим, черезшкірним, назальним, парентеральним або ректальним введенням. У деяких варіантах здійснення, терапевтичні агенти можуть вводитися локально, в місце, в якому присутні клітинимішені, тобто в конкретних тканині, органі або рідині (наприклад, крові, цереброспінальній рідини, пухлинній масі і т.д.). Даний винахід забезпечує додатково застосування будь-якого варіантного поліпептиду SAP цього винаходу для приготування лікарського засобу для лікування або попередження порушення або стану, описаного тут, у пацієнта, наприклад, застосування варіантного поліпептиду SAP для приготування лікарського засобу для лікування порушення або стану, описаного тут. У деяких аспектах, будь-який варіантний поліпептид SARS цього винаходу може бути використаний для приготування фармацевтичного препарату для застосування при лікуванні або попередженні захворювання або стану, описаного тут. Терапевтичні агенти можуть бути приготовані для різних способів введення, в тому числі системного і місцевого або локалізованого введення. Способи і композиції звичайно можуть бути знайдені в Remington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA. Для парентерального введення переважною є ін'єкція, що включає в себе внутрішньом'язову, внутрішньовенну, внутрішньоочеревинну і підшкірну ін'єкцію. Для ін'єкції, ці сполуки можуть бути приготовані в рідких розчинах, переважно в фізіологічно сумісних буферах, таких як розчин Хенка або розчин Рінгера. Крім того, ці сполуки можуть бути приготовані в твердій формі і розчинені або суспендовані перед використанням. У винахід включені також ліофілізовані форми. У деяких варіантах здійснення, ці терапевтичні агенти можуть вводитися в клітини різними способами, відомими кваліфікованим в даній галузі фахівцям, що включають в себе, 22 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 але що не обмежуються ними, інкапсулювання в ліпосомах, іонофорез, або включенням в інші носії, такі як гідрогелі, циклодекстрини, нанокапсули, що біологічно деградуються, і біоадгезивні мікросфери. Для перорального введення, ці фармацевтичні композиції можуть мати форму, наприклад, таблеток, пастилок або капсул, приготованих загальноприйнятими способами з фармацевтично прийнятними ексципієнтами, такими як зв'язувальні агенти (наприклад, заздалегідь желатинований кукурудзяний крохмаль, полівінілпіролідон або гідроксилметилцелюлоза); наповнювачі (наприклад, лактоза, мікрокристалічна целюлоза або гідрофосфат кальцію); мастильні речовини (наприклад, стеарат магнію, тальк або діоксид кремнію); дезінтегруючі агенти (наприклад, картопляний крохмаль або гліколат натрію-крохмалю); або зволожувальні агенти (наприклад, лаурилсульфат натрію). На таблетки можуть бути нанесені покриття способами, добре відомими в даній галузі. Рідкі препарати для перорального введення можуть мати форму, наприклад, розчинів, сиропів або суспензій, або вони можуть бути представлені у вигляді сухого продукту для відтворення з водою або іншим носієм перед використанням. Такі рідкі препарати можуть бути приготовані загальноприйнятими способами з фармацевтично прийнятними добавками, такими як суспендуючі агенти (наприклад, сироп сорбіту, похідні целюлози або гідрогенізовані придатні в їжу жири); емульгуючі агенти (наприклад, лецитин і аравійська камедь); неводні носії (наприклад, мигдалеве масло, масляний ефір, етиловий спирт або фракціоновані рослинні олії) і консерванти (наприклад, метил- або пропіл-пгідроксибензоати або сорбінова кислота). Препарати можуть також містити буферні солі, смакові, фарбувальні і підсолоджуючі агенти у разі необхідності. Препарати для перорального введення можуть бути також приготовані для регульованого вивільнення активної сполуки. Для введення інгаляцією (наприклад, при легеневій доставці), терапевтичні агенти можуть доставлятися загальноприйнятим чином у вигляді аерозольного розчину з упаковок, що знаходяться під тиском або розпилювача, з використанням відповідного пропелента, наприклад, дихлордифторбутану, трихлорфторметану, дихлортетрафторетану, діоксиду вуглецю або іншого прийнятного газу. У разі аерозолю, що знаходиться під тиском, одиниця дози може бути визначена за рахунок клапана для доставки відміряної кількості. Можуть бути приготовані капсули і картриджі, наприклад, з желатину, для використання в інгаляторі або інсуфляторі, що містить порошкоподібну суміш сполуки і прийнятну порошкову основу, таку як лактоза або крохмаль. У способах цього винаходу, ці фармацевтичні сполуки можуть також вводитися інтраназальним або інтрабронхіальним способами, що включають в себе інсуфляцію, порошки і аерозольні композиції (наприклад, стероїдні інгаляційні препарати, див. Rohatagi (1995) J. Clin. Pharmacology. 35:1187-1193; Tjwa (1995) Ann. Allergy Asthma Immunol. 75:107-111). Наприклад, аерозольні препарати можуть бути вміщені в прийнятні пропеленти, що знаходяться під тиском, такі як дихлордифторметан, пропан, азот і т.п. Вони можуть бути також приготовані у вигляді фармацевтичних речовин для препаратів, що не знаходяться під тиском, наприклад, що знаходяться в розпилювачі або аерозольному інгаляторі. Звичайно, таке введення виконується у водному фармакологічно прийнятному буфері. Фармацевтичні композиції, що підходять для респіраторної доставки (наприклад, інтраназальної, інгаляційної і т.д.) варіантних поліпептидів SAP, можуть бути приготовані або в твердій, або в рідкій формі. Поліпептиди SAP цього винаходу можуть бути приготовані для парентерального введення ін'єкцією, наприклад, болюсною ін'єкцією, або безперервною інфузією. Препарати для ін'єкції можуть бути представлені в формі одиничної дози, наприклад, в ампулах або багатодозових контейнерах, з доданим консервантом. Ці композиції можуть бути в таких формах, як суспензії, розчини або емульсії в масляних або водних носіях і можуть містити агенти, що сприяють приготуванню, такі як суспендуючі, стабілізуючі і/або диспергуючі агенти. Альтернативно, ці активні інгредієнти можуть знаходитися в формі порошку для об'єднання з прийнятним носієм, наприклад, стерильною апірогенною водою перед використанням. Крім того, поліпептиди SAP цього винаходу можуть бути також приготовані у вигляді препарату пролонгованої дії (депонованого препарату). Такі форми, що мають тривалу дію, можуть вводитися імплантацією (наприклад, підшкірно або внутрішньом'язово) або внутрішньом'язовою ін'єкцією. Таким чином, терапевтичні агенти можуть бути приготовані, наприклад, з прийнятними полімерними або гідрофобними матеріалами (наприклад, у вигляді емульсії в прийнятному маслі) або з іонообмінними смолами або у вигляді помірно розчинних похідних, наприклад, у вигляді помірно розчинної солі. Склад пролонгованого вивільнення включає в себе також пластири. 23 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення, описані тут сполуки можуть бути приготовані для доставки в центральну нервову систему (ЦНС) (огляд в Begley, Pharmacology & Therapeutics 104: 29-45 (2004)). Загальноприйняті підходи для доставки лікарських засобів в ЦНС включають в себе: нейрохірургічні стратегії (наприклад, інтрацеребральну ін'єкцію або інтрацеребровентрикулярну інфузію); молекулярну маніпуляцію агента (наприклад, утворення химерного злитого білка, який містить транспортний пептид, який має афінність відносно молекули поверхні ендотеліальних клітин, в комбінації з агентом, який сам нездатний долати гематоенцефалічний бар'єр, в спробі використання одного з ендогенних транспортних шляхів гематоенцефалічного бар'єра); фармакологічні стратегії, призначені для збільшення розчинення в ліпідах агента (наприклад, кон'югування водорозчинних агентів з ліпідними або холестериновими носіями); і транзиторне порушення цілісності ВВВ гіперосмотичним руйнуванням (що відбувається внаслідок інфузії розчину маніту в сонну артерію або використання біологічно активного агента, такого як пептид ангіотезину). У деяких варіантах здійснення, поліпептиди SAP цього винаходу включають в композицію для місцевого введення, що містить носій для локального введення, який звичайно придатний для місцевого введення лікарського засобу, і що містить будь-який подібний матеріал, відомий в даній галузі. Цей носій для місцевого введення може бути вибраний таким чином, щоб забезпечувати цю композицію в бажаній формі, наприклад, у вигляді мазі, лосьйона, крему, мікроемульсії, гелю, масла, розчину або т.п., і може складатися або з матеріалу, що зустрічається в природі, або з матеріалу синтетичного походження. Переважно, вибраний носій не впливає шкідливим чином на активний агент або інші компоненти композиції для місцевого застосування. Приклади прийнятних носіїв для місцевого застосування для застосування в даному описі включають в себе воду, спирти і інші нетоксичні органічні розчинники, гліцерин, мінеральне масло, силікон, вазелін, ланолін, жирні кислоти, рослинні олії, парабени, віск і т.п. Фармацевтичні композиції (в тому числі косметичні препарати) можуть містити від приблизно 0,00001 до 100 мас. %, наприклад, від 0,001 до 10 мас. % або від 0,1 % мас. до 5 % мас. одного або декількох описаних тут варіантних поліпептидів SAP. У деяких композиціях для місцевого введення активний агент присутній в кількості в діапазоні приблизно 0,25 мас. % - 75 мас. % композиції, переважно, в діапазоні приблизно 0,25 мас. % - 30 мас. % композиції, більш переважно, в діапазоні приблизно 0,5 мас. % - 15 мас. % композиції, і найбільш переважно, в діапазоні приблизно 1 мас. % - 10 мас. % композиції. Стани, що стосуються очей, можуть лікуватися або попереджатися, наприклад, системно, місцево, внутрішньоочною ін'єкцією терапевтичних агентів або введенням пристрою пролонгованого вивільнення, який вивільняє терапевтичні агенти. Поліпептиди SAP цього винаходу можуть доставлятися в фармацевтично прийнятному офтальмічному носії, так що ця сполука підтримується в контакті з очною поверхнею протягом достатнього періоду часу для проникнення цієї сполуки в рогівкові і внутрішні райони ока, наприклад, передню камеру, кон'юнктиву, задню камеру, скловидне тіло, внутрішньоочну рідину, рідку частину скловидного тіла, рогівку, райдужну оболонку/війчасту частину, кришталик, хороїдальну оболонку/сітківку і склеру. Фармацевтично прийнятний офтальмічний носій може бути, наприклад, маззю, рослинним маслом або інкапсулюючим матеріалом. Альтернативно, ці сполуки можуть бути ін'єковані безпосередньо в рідину скловидного тіла і внутрішньоочну рідину. В іншій альтернативі, ці сполуки можуть бути введені системно, наприклад, внутрішньовенною інфузією або ін'єкцією, для лікування ока. Описані тут терапевтичні агенти можуть зберігатися в безкисневому середовищі у відповідності зі способами, відомими в даній галузі. Зразкові композиції містять поліпептид SAP з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями і, необов'язково, іншимитерапевтичними інгредієнтами. Цей носій (носії) повинні бути "фармацевтично прийнятними" в тому значенні, що вони є сумісними з іншими інгредієнтами цієї композиції і не повинні викликати неприйнятної шкідливої дії в суб'єктові. Такі носії описані тут або є добре відомими кваліфікованим в галузі фармакології фахівцям. У деяких варіантах здійснення, ці фармацевтичні композиції є апірогенними і прийнятними для введення пацієнту-людині. У деяких варіантах здійснення, ці фармацевтичні композиції не містять подразнювальних речовин і придатні для введення пацієнту-людині. У деяких варіантах здійснення, ці фармацевтичні композиції не містять алергенів і придатні для введення пацієнтулюдині. Ці композиції можуть бути приготовані будь-яким зі способів, добре відомих в галузі фармації. У деяких варіантах здійснення, поліпептид SAP вводять в композиції затриманого вивільнення, наприклад, в композицію, яка включає в себе полімер повільного вивільнення. Поліпептид SAP може бути приготований з носіями, які будуть захищати його проти швидкого 24 UA 110323 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 вивільнення. Приклади включають в себе носій регульованого вивільнення, такий як полімер, мікроінкапсульовану систему доставки або біоадгезивний гель. Альтернативно, пролонгована доставка поліпептиду SAP може досягатися включенням в цю композицію агентів, які затримують абсорбцію, наприклад, гідрогелів моностеарату алюмінію і желатину. Способи доставки сполук нуклеїнових кислот відомі в даній галузі (див., наприклад, Akhtar et al, 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; і Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995; Sullivan et al, International Application No. WO 94/02595). Ці протоколи можуть бути використані для доставки фактично будь-якої нуклеїнової кислоти. Сполуки нуклеїнових кислот можуть вводитися в клітини різними способами, відомими кваліфікованим в даній галузі фахівцям, в тому числі, але не тільки, інкапсулюванням в ліпосомах, іонтофорезом або включенням в інші носії, такі як гідрогелі, циклодекстрини, нанокапсули, що біологічно деградуються, і біоадгезивні мікросфери. Альтернативно, комбінацію нуклеїнова кислота/носій локально доставляють прямою ін'єкцією або з використанням інфузійного насоса. Інші способи доставки включають в себе, але не обмежуються ними, пероральну (в формі таблетки або пілюлі) і/або внутрішньооболонкову доставку (Gold, 1997, Neuroscience, 76, 1153-1158). Інші підходи включають в себе застосування різних транспортних систем і систем-носіїв, наприклад, за допомогою застосування кон'югатів і полімерів, що біологічно деградуються. Відносно вичерпного огляду стратегій доставки лікарських засобів див. Ho et al., 1999, Curr. Opin. Mol. Ther., 1, 336-343 і Jain, Drug Delivery Systems: Technologies and Commercial Opportunities, Decision Resources, 1998 і Groothuis et al., 1997, J. Neuro Virol, 3, 387-400. Більш докладні описи доставки і введення нуклеїнових кислот забезпечені в Sullivan et al., supra, Draper et al., PCT WO93/23569, Beigelman et al., міжнародній заявці № WO99/05094 і Klimuk et al., міжнародній публікації № WO99/04819. Наступні приклади служать для більш повного опису способу застосування вищеописаного винаходу, а також пояснення найкращих способів, що розглядаються, для здійснення різних аспектів цього винаходу. Зрозуміло, що ці приклади ніяким чином не повинні обмежувати істинний об'єм цього винаходу і представлені швидше для ілюстративних цілей. ПРИКЛАДИ Приклад 1: Рекомбінантний SAP є більш ефективним, ніж SAP, отриманий з сироватки людини. Рекомбінантний SAP людини, виділений з клітин CHO-S (rhSAP), і отриманий з сироватки людини SAP (hSAP) аналізували на біоактивність з використанням біоаналізу in vitro. У цьому аналізі, збагачені моноцитами мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC) інкубували з концентраціями, що варіюються rhSAP або hSAP протягом 96 годин. Після цього інкубування супернатанти отриманих культур витягували і аналізували при допомозі ELISA для визначення кількості хемокіну (MDC), що виробляється макрофагами, яка була продукована. MDC продукується фіброцитами і є, отже, показником диференціювання моноцитів в фіброцити. Порівнянням інгібуючої концентрації, 50 % (IC50) цієї проби з посилальним стандартом hSAP, може бути визначена відносна ефективність гліковаріанта SAP. Цей результат виражали у вигляді відношення IC50 цієї проби проти посилального стандарту hSAP. Всі проби SAP і стандарти розбавляли спочатку до концентрації 1,0 мг/мл в Доповненому середовищі FibroLife. Стандарти SAP серійно розводили для отримання робочих концентрацій стандартів 60, 30, 20, 13,4, 8,8, 6,0, 3,0, 1,5 і 0,75 мкг/мл (кінцева концентрація стандарту 30, 15, 10, 6,7, 4,4, 3,0, 1,5, 0,75 і 0,375 мкг/мл). Див. наступну таблицю . 45 25 UA 110323 C2 Робоча концентрація rhSAP стандарту (мкг/мл) Об'єм стандарту Об'єм доповненого середовища FibroLife 60 400 800 (13,4 мкг/мл станд.) 400 800 (8,8 мкг/мл станд.) 400 600 (6,0 мкг/мл станд.) 600 1,5 600 (3,0 мкг/мл станд.) 600 0,75 35 800 (20 мкг/мл станд.) 3,0 30 400 6,0 25 800 (30 мкг/мл станд.) 8,8 20 600 13,4 15 600 (60 мкг/мл) 20 10 940 30 5 60 (1 мг/мл) 600 (1,5 мкг/мл станд.) 600 Для приготування для аналізу ELISA захоплююче антитіло (тобто, антитіло миші проти MDC людини) розбавляли до робочої концентрації в ЗФР без білка-носія. Це розбавлене антитіло використовували для покриття 96-ямкових планшетів і потім кожний планшет герметизували і інкубували протягом ночі при кімнатній температурі. Перед використанням цих планшетів, що мають покриття, кожну ямку аспірували і промивали промивальним буфером, повторюючи цей процес два рази, що давало загалом три промивання. Потім ці планшети блокували додаванням 300 мкл реагента-розріджувача до кожної ямки і інкубували при кімнатній температурі протягом однієї години. Після інкубування повторювали процедуру аспірації і промивання ямки. Для аналізу ELISA, 100 мкл проб кожного із супернатантів з культур моноцитів/фіброцитів або стандартів SAP додавали в кожну ямку. Потім цей планшет інкубували при кімнатній температурі протягом 2 годин перед аспірацією і промиванням цих ямок. Потім в кожну ямку додавали 100 мкл робочого розведення стрептавідин-HRP. Планшет інкубували протягом 20 хвилин при кімнатній температурі перед додаванням в кожну ямку 50 мкл стоп-розчину. Негайно вимірювали оптичну густину кожної ямки з використанням мікропланшетного рідера, встановленого на 450 нм. Якщо корекція довжини хвилі була доступна, мікропланшетний рідер встановлювали на 540 нм або 570 нм. Якщо корекція довжини хвилі не була доступна, то показання приладу при 540 або 570 нм віднімали з показників приладу при 450 нм. Це віднімання коректує оптичні недосконалості в планшеті. Як rhSAP, так і hSAP аналізували на біоактивність з використанням цього аналізу (фигура 1). В середньому, rhSAP є в 3,4 рази більш активним, ніж hSAP (середнє з 7 незалежних експериментів). Приклад 2: Модифікація структур гліканів SAP З використанням способів глікоремоделювання гліканові частини на пробі рекомбінантного SAP людини (rhSAP) модифікували для заміни кінцевих 2,3-зв'язаних частин сіалової кислоти 2,6-зв'язаними частинами сіалової кислоти (фігура 2, А і В). Подібним чином, пробу отриманого із сироватки людини SAP (hSAP) також модифікували для заміни кінцевих 2,6зв'язаних частин сіалової кислоти 2,3-зв'язаними частинами сіалової кислоти (фігура 2, C і D). Крім того, оскільки rhSAP, виділений із клітин CHO-S є тільки частково сіалілованим, пробу rhSAP обробляли для повного сіалілування приєднаних гліканових структур 2,3-зв'язаними частинами сіалової кислоти. (фігура 2, E і F). Як rhSAP, так і hSAP (Calbiochem Cat#970549) обробляли 2,3,6,8,9-сіалідазою (Sigma Cat #N8271) для повного десіалілування цих поліпептидів. Після обробки сіалідазою протягом 17 годин, десіаліловані (тобто, асіало) rhSAP і hSAP очищали з використанням фосфоетаноламін(PE)-афінної і витіснювальної (Sephadex 200 prep grade) хроматографії. Потім очищені поліпептиди асіало-SAP ферментативно обробляли з використанням або 2,3-, або 2,6сіалілтрансфераз (Calbiochem Cat #566223) в присутності ЦМФ-сіалової кислоти (Calbiochem 26 UA 110323 C2 Cat #233264) протягом 17 годин при 37 °C. Наступні таблиці забезпечують деталі кожної реакційної суміші. Реакції асіало rhSAP (Rxns) Обробка 2,3-сіалілтрансферазою (ST3Gal3) одиниці параметр мг/мл [асіало rhSAP] stk г/мол асіало rhSAP MW мкМ [асіало rhSAP] stk мкМ макс [галактоза] мг/мл rhSAP, ST3Gal3 вихідні [ST3Gal3] stk розчини реагентів г/мол ST3Gal3 MW мкМ [ST3Gal3] stk мг/мл [CMP-SA] stk г/мол CMP-SA MW мM [CMP-SA] stk величина 10,8 116293 93 929 0,9 84000 10,7 25 658,4 38 мкл асіало rhSAP 1 в реакції мкл ST3Gal3 1 в реакції мкл CMP-SA 1 в реакції 260 50 75 буфер (10 мM HEPES/150 мM NaCl, pH 8) мкл 615 Загальний об'єм реакції Об'єми реакцій мкл мкл мкл мкл 1000 [асіало rhSAP] реакції макс [галактоза] [SAP] реакції [ST3Gal3] реакції [ST3Gal3] реакції [CMP-SA] реакції Концентрації в реакції асіало rhSAP:ST3 асіало rhSAP:ST3 CMP-SA:ST3 CMP-SA: асіало rhSAP CMP-SA: галактоза 27 мкМ мкМ мг/мл мкМ мг/мл мM Відношення мас Молярне відношення Молярне відношення Молярне відношення Молярне відношення 24,1 241 2,8 0,5357 0,045 2,85 62 45 5316 118 11,8 UA 110323 C2 продовження таблиці rhSAP, ST6 вихідні розчини реагентів Обробка 2,6-сіалілтрансферазою (реакція ST6) одиниці параметр мг/мл [асіало rhSAP] stk г/мл асіало rhSAP MW мкМ [асіало rhSAP] stk мкМ макс [галактоза] мг/мл [ST6] stk г/мол ST6 MW мкМ [ST6] stk мг/мл [CMP-SA] stk г/мол CMP-SA MW мM [CMP-SA] stk величина 10,8 116293 93 929 0,205 42000 4,9 25 658,4 38 мкл асіало rhSAP 1 в реакції мкл ST6 в реакції мкл CMP-SA в реакції 260 30 75 буфер (10 мM HEPES/150 мM NaCl, pH 8) мкл 635 загальний об'єм реакції об'єми реакцій мкл мкл мкл мкл 1000 [асіало rhSAP] реакції макс [галактоза] [асіало rhSAP] реакції [ST6] реакції [ST6] реакції [CMP-SA] реакції Концентрації в реакції асіало rhSAP:ST6 асіало rhSAP:ST6 CMP-SA:ST6 CMP-SA: асіало rhSAP CMP-SA: галактоза 5 мкМ мкМ мг/мл мкМ мг/мл мM Відношення мас Молярне відношення Молярне відношення Молярне відношення Молярне відношення 24,1 241 2,8 0,146 0,006 2,85 457 165 19448 118 11,8 В окремій реакції виконували повне сіалілування rhSAP з використанням α2,3сіалілтрансферази без першого десіалілування цієї молекули при 37 °C протягом 17 годин у відповідності із наступною таблицею. 28