Спосіб визначення каротиноїдів у ліпофільних екстрактах м’якоті гарбуза

Реферат: Спосіб визначення каротиноїдів включає метод адсорбційної спектрофотометрії шляхом визначення оптичної густини при довжині хвилі 450 нм, використання гексану для одержання проби та як контрольного розчину. Як об'єкт дослідження використовують ліпофільний екстракт з гарбуза звичайного та мускатного (Cucurbita moschata (Duch.) Poir., Cucurbita pepo L.), паралельно в имірюють оптичну густину стандартного розчину калію біхромату. UA 89730 U (12) UA 89730 U UA 89730 U 5 10 15 20 25 30 35 Корисна модель належить до фармації, зокрема до способів хімічного аналізу, а саме до контролю якості лікарської рослинної сировини, що містить каротиноїди. Лікарські рослини є важливим джерелом надходження біологічно активних речовин (БАР) в організм людини, завдяки вмісту складного комплексу хімічних сполук, що справляють різну і багатосторонню фармакологічну дію [1]. Особливу увагу привертають рослини, поширені в нашій місцевості, тобто ті, що мають достатню сировинну базу та лікувальні властивості яких добре відомі [2]. На сьогодні, більше 90 % природних ресурсів, що використовуються в промисловому виробництві соків, стають відходами виробництва і споживання [3]. Так, відходи після первинної переробки рослинної сировини (зокрема шрот) можуть служити джерелом для отримання багатьох природних джерел біологічно активних речовин (БАР) [4,5]. Каротиноїди являють собою один з важливих класів природних сполук, що містяться у рослинній сировині та відіграють важливу провітамінну та антиоксидантну дію, складаючи невід'ємну частину харчування. Найбільш важливим та розповсюдженим джерелом каротиноїдів є різні рослини (овочі та фрукти). Одним з таких рослинних продуктів є гарбуз (від. лат. Cucurbita), що відноситься до сімейства гарбузові (Cucurbitaceae). Найпоширенішими як у всьому світі, так і в Україні є три їх види: Cucurbita maxima Duch., Cucurbita moschata (Duch.) Poir., Cucurbita pepo L. [6, 7]. Однак, ця рослина має значні відмінності щодо складу поживних речовин, залежно від умов зростання, виду та його частин (насіння чи м'якоті). Для визначення якісного та кількісного вмісту каротиноїдів у рослинній сировині рекомендують використовувати фізико-хімічні методи, в першу чергу УФ-спектроскопію. Хромофорна група каротиноїдів представлена полієновим ланцюгом подвійних зв'язків, унаслідок чого вони поглинають світло в діапазоні 450-500 нм і мають жовте або оранжеве забарвлення [8]. Відомий спосіб кількісного визначення суми каротиноїдів в плодах шипшини [9]. Даний спосіб проводять наступним чином: аналітичну пробу сировини подрібнюють до розміру часток, що проходять крізь сито з отворами діаметром 0,2 мм. Близько 1,0 г (точна наважка) подрібненої сировини, вміщують в колбу зі шліфом ємністю 250 мл, додають 70 мл 40 % етанолу і відважують з похибкою ± 0,01 г. Колбу приєднують до зворотного холодильника, нагрівають на водяній бані впродовж 90 хв, періодично струшуючи для змивання часток сировини зі стінок. Потім колбу охолоджують до кімнатної температури, зважують і при необхідності доводять до початкової маси 40 %-ним етанолом. Вилучення пропускають крізь паперовий фільтр, змочений тим самим етанолом, відкидаючи перші 10 мл фільтрату. Оптичну густину отриманого розчину вимірюють на спектрофотометрі при довжині хвилі 450 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм. Розчином порівняння є 40 %-ний етанол. Вміст суми каротиноїдів в мг % (X), у перерахунку на β-каротин і абсолютно суху сировину, розраховують за формулою: A  50  1000  100 , (1) m  2500  100  W  де A - оптична густина випробуваного розчину; m - маса сировини, г; W - втрата в масі при висушуванні сировини, %; 2500 - значення питомого показника поглинання -каротину в етанолі. X 40 45 50 55 Однак, відомий спосіб не придатний для визначення каротиноїдів в ліпофільних екстрактах м'якоті гарбуза. Найближчим аналогом є спосіб визначення сумарного вмісту каротиноїдів в перерахунку на β-каротин [10], згідно з яким аналітичну пробу сировини (листя Cacalia Hastata L.), подрібнюють до розміру часток, що проходять крізь сито з отворами діаметром 0,5 мм. Близько 1,0 г (точна наважка) подрібненої сировини вміщують в конічну колбу ємністю 250 мл з притертою пробкою, додають 30 мл гексану, ретельно переміщують на струшувачі упродовж 30 хв. Після цього вилучення фільтрують в мірну колбу ємністю 100 мл (V) через паперовий фільтр, який промивають 10 мл гексану. Екстракцію повторюють двічі. Вилучення об'єднують і доводять об'єм розчину в мірній колбі до мітки гексаном. Оптичну густину розчину вимірюють на спектрофотометрі при довжині хвилі 450 нм в кюветі з товщиною шару 10 мм. Як розчин порівняння використовують гексан. Вміст суми каротиноїдів (X), в мг (%) в перерахунку на β-каротин і абсолютно сухій сировині, розраховують за формулою: D  V  100  100 , (2) m  2592  100  W  де D - оптична густина випробуваного розчину; V - об'єм розчину, мл (100 мл); m - маса X сировини, г; W втрата в масі при висушуванні сировини, %; 2592 - питомий показник 1 UA 89730 U E1 % 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 поглинання 1 см β-каротину при довжині хвилі 450 нм в гексані. На даний час не відомі випадки застосування зазначеного способу для визначення кількісного вмісту каротиноїдів в ліпофільних екстрактах м'якоті гарбуза. В основу корисної моделі поставлено задачу розробки нового способу визначення каротиноїдів у ліпофільних екстрактах м'якоті гарбуза, який завдяки використанню спектрофотометричного методу при ідентифікації та кількісному визначенні каротиноїдів у заданих умовах дозволяє забезпечити необхідну точність та відтворюваність одночасно з високою швидкістю проведення аналізу та не потребує великих матеріальних витрат. Поставлена задача вирішується таким чином, що спосіб кількісного визначення каротиноїдів методом адсорбційної спектрофотометрії шляхом визначення оптичної густини при довжині хвилі 450 нм, при використанні гексану для одержання проби та як контрольного розчину, який відрізняється тим, що як об'єкт дослідження використовують ліпофільний екстракт з гарбуза звичайного та мускатного (Cucurbita moschata (Duch.) Poir., Cucurbita pepo L.), та паралельно вимірюють оптичну густину стандартного розчину калію біхромату, а ліпофільний екстракт м'якоті гарбуза отриманий за допомогою фреону-22 або гексану. Вихідною сировиною для отримання екстрактів був шрот, одержаний з м'якоті гарбуза після виробництва соку з гарбуза звичайного та мускатного (Cucurbita moschata (Duch.) Poir., Cucurbita pepo L.). Ліпофільні екстракти м'якоті гарбуза були отримані за допомогою розчинників (фреону-22 - екстракт № 1) та (гексану - екстракт № 2) на стандартному обладнані. Спектрофотометричне дослідження гсксанових розчинів ліпофільних екстрактів м'якоті гарбуза проводили на приладі Evolution 60 S. Усі параметри заявленого способу визначені експериментальним шляхом. Вміст суми каротиноїдів X, (у перерахунку на -каротин), в міліграмах, розраховували за формулою: X A  V1  V3  0,00208 , (3) A ст  V2  m н де A - оптична густина випробуваного розчину; Aст - оптична густина розчину стандартного калію дихромату; 0,00208 - кількість β-каротину в міліграмах в розчині, який відповідає за забарвленням розчину стандартного зразка калію дихромату; mн - маса наважки; V1 - об'єм випробовуваного розчину (50 мл); V2 - об'єм випробовуваного розчину (10 мл); V3 - об'єм випробовуваного розчину (2,5 мл); Заявлений спосіб здійснюють наступним чином: вихідний розчин. Близько 0,5000 г екстракту м'якоті гарбуза, кількісно за допомогою гексану переносять у мірну колбу ємністю 50 мл, доводять до позначки певним розчинником і перемішують. випробуваний розчин. 2,5 мл вихідного розчину вміщують в мірну колбу ємністю 10 мл, доводять до позначки тим самим розчином і переміщують. приготування розчину робочого стандартного зразку (РСЗ) калію біхромату. Близько 0,06 г (точна наважка) калію біхромату поміщають у мірну колбу місткістю 1000 мл, розчиняють у 100 мл води очищеної. Термін зберігання розчину 1 місяць. У попередньо зважений бюкс відважують близько 0,5000 г екстракту м'якоті гарбуза, кількісно за допомогою гексану переносять у мірну колбу ємністю 50 мл, доводять до позначки певним розчинником і перемішують. 2,5 мл вихідного розчину вміщують в мірну колбу ємністю 10 мл, доводять до позначки тим самим розчином і переміщують. Оптичну густину випробуваного розчину визначають на спектрофотометрі при довжині хвилі 450 нм в кюветах з товщиною шару 10 мм. Як контрольний розчин використовують гексан. Паралельно вимірюють оптичну густину стандартного розчину калію біхромату, як контрольний розчин використовують воду Р. Отримані результати наведені на кресленні. (УФ-спектри поглинання ліпофільних екстрактів м’якоті гарбуза і калію біхромату). Як видно з креслення, адсорбційний спектр екстрактів у видимому світлі містить одну широку смугу поглинання з максимумом при 430-450 нм. Розчин забарвлений в оранжевочервоний колір, що свідчить про наявність суми каротиноїдів. Заявлений спосіб є простим у виконанні, дозволяє швидко визначити вміст каротиноїдів у ліпофільних екстрактах м'якоті гарбуза, є точним, відтворюваним та відрізняється невеликою собівартістю. Корисна модель ілюструється прикладами. 2 UA 89730 U 5 10 Приклад 1. У попередньо зважений бюкс відважують близько 0,5000 г екстракту (№ 1) м'якоті гарбуза, кількісно за допомогою гексану переносять у мірну колбу ємністю 50 мл, доводять до позначки певним розчинником і перемішують. 2,5 мл вихідного розчину вміщують в мірну колбу ємністю 10 мл, доводять до позначки тим самим розчином і переміщують. Оптичну густину випробуваного розчину визначають на спектрофотометрі при довжині хвилі 450 нм в кюветах з товщиною шару 10 мм. Як контрольний розчин використовують гексан. Паралельно вимірюють оптичну густину стандартного розчину калію біхромату, як контрольний розчин використовують воду Р. Вміст суми каротиноїдів X (у перерахунку на β-каротин), в міліграмах, розраховують за емпіричною формулою (3). Результати кількісного визначення наведені в таблиці 1. Таблиця 1 Результати кількісного вмісту суми каротиноїдів в екстракті м'якоті гарбуза (№ 1) в перерахунку на β-каротин (мг/ г) Кількість суми Метрологічні характеристики каротиноїдів в Маса наважки, г Оптична густина, А середнього результату перерахунку на βвизначення каротин (мг/г) 0,0517 0,495 3,2668 Х=3,2777 2 -4 0,0512 0,493 3,2854 S =1,79×10 0,0506 0,489 3,2974 Р, %=95 t (Ρ, ν)=2,7800 0,0514 0,493 3,2726 ε, %=0,508 0,0516 0,494 3,2665 Примітка: оптична густина розчину калію дихромату при 450 нм (А ст ) дорівнює 0,508 15 20 25 Приклад 2. У попередньо зважений бюкс відважують близько 0,5000 г екстракту (№ 2) м'якоті гарбуза, кількісно за допомогою гексану переносять у мірну колбу ємністю 50 мл, доводять до позначки певним розчинником і перемішують. 2,5 мл вихідного розчину вміщують в мірну колбу ємністю 10 мл, доводять до позначки тим самим розчином і переміщують. Оптичну густину випробуваного розчину визначають на спектрофотометрі при довжині хвилі 450 нм в кюветах з товщиною шару 10 мм. Як контрольний розчин використовують гексан. Паралельно вимірювали оптичну густину стандартного розчину калію дихромату, як контрольний розчин використовували воду Р. Вміст суми каротиноїдів X (у перерахунку на β-каротин), в міліграмах, розраховували за емпіричною формулою (3). Результати кількісного визначення наведені в таблиці 2. Таблиця 2 Результати кількісного визначення суми каротиноїдів в екстракті м'якоті гарбуза (№ 2) в перерахунку на β-каротин (мг/г) Кількість суми Метрологічні характеристики каротиноїдів в Маса наважки, г Оптична густина, А середнього результату перерахунку на β-каротин визначення (мг / г) 0,0500 0,510 8,3363 Х=8,2648 2 -2 0,0510 0,507 8,1090 S =1,35×10 0,0530 0,510 8,3331 Р, %=95 t (Ρ, ν)=2,7800 0,0490 0,502 8,3730 ε, %=1,751 0,0505 0,506 8,1728 Примітка: оптична густина розчину калію дихромату при 450 нм (А ст ) дорівнює 0,509 30 Аналізуючи результати, наведені в табл. 1, 2 видно, що в 1 г екстракту (№ 2) міститься 8,26 мг суми каротиноїдів в перерахунку на β-каротин, а в 1 г екстракту (№ 1) - 3,27 мг суми 3 UA 89730 U 5 10 15 20 25 30 35 каротиноїдів в перерахунок на β-каротин. Отримані результати підтверджені даними статистичної обробки результатів досліджень, та відповідають даним відомим джерелам інформації, що свідчить про достовірність результатів, одержаних заявленим способом. Таким чином, заявлено простий, точний та відтворюваний спосіб визначення суми βкаротиноїдів в експериментальних серіях ліпофільних екстрактів м'якоті гарбуза, який може бути використаний в умовах лабораторій з питань контролю якості рослинної сировини або лікарських засобів. Джерела інформації: 1. Масленников П.В., Чупахина Г.Η., Скрыпник Л.Н. и др. Содержание антоциановых и каротиноидных пигментов в лекарственных растениях // Электронный журнал "Вестник МГОУ" / www.evestnik-mgou.ru. - 2013. - № 1. - C. 1-13. 2. Тернинко І.І., Кисличенко B.C. Фітохімічне вивчення ліпофільних фракцій з трави Calendula officinalis (L.) та Chamomilla recutita (L.) // Актуальні питання фармацевтичної і медичної науки та практики. - 2011. - вип. XXIV, № 3. - С. 82-85. 3. Горелова О.Μ, Сартакова О.С., Полякова Л.В. и др. Исследования по созданию технологии переработки отходов, содержащих органические растворители, на примере фармокологических производств // Ползуновский вестник. - 2006. - № 2. - С. 234-236. 4. Макарова Д.Л.*, Ханина М.А. Фитохимическое изучение шрота Artemisia pontica L. флоры Сибири // Химия растительного сырья. - 2009. - № 1. - С. 93-96. 5. Ухов О.Н., Буркова В.Н., Калинкина Г.И. и др. Исследование химического состава отходов переработки пихтовой лапки // Химия растительного сырья. -2006. - № 1. - С. 55-58. 6. Смирнова Т.И., Малахаев Е.Д., Барановский И.Н. и др. Воздействие этилендиаминдиянтарной кислоты и ее комплекса с цинком на содержание каротиноидов в растениях // Вестник ТвГУ. Серия "Химия". - 2012. - Вып. 13. - С. 61-65. 7. Azevedo-Meleiro СН, Rodriguez-Amaya DB. Qualitative and quantitative differences in carotenoid composition among Cucurbita moschata, Cucurbita maxima, and Cucurbita pepo // J Agric Food Chem. - 2007. - № 55. P. 4027-4033 8. Mi Young K., Eun Jin K., Young-Nam K. et al. // Nutrition Research and Practice (Nutr Res Pract). - 2012. - № 6 (1). - P. 21-27. 9. Тринева О.В., Сафонова E.Φ., Сливкин А.И. Определение каротиноидов в плодах шиповника (Rosa SP.) // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2012. - № 11. - С. 19-23. 10. Олейников Д.Н., Потанина О.Г., Танхаева Л.М. Фармакогностическая характеристика листьев какалии копьевидной (Cacalia Hastata L.) // Химия растительного сырья. - 2004. - № 3. С. 43-52. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 40 45 50 1. Спосіб кількісного визначення каротиноїдів методом адсорбційної спектрофотометрії шляхом визначення оптичної густини при довжині хвилі 450 нм, при використанні гексану для одержання проби та як контрольного розчину, який відрізняється тим, що як об'єкт дослідження використовують ліпофільний екстракт з гарбуза звичайного та мускатного (Cucurbita moschata (Duch.) Poir., Cucurbita pepo L.), та паралельно вимірюють оптичну густину стандартного розчину калію біхромату. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як об'єкт дослідження використовують ліпофільний екстракт м'якоті гарбуза, отриманий за допомогою фреону-22 на стандартному обладнанні. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як об'єкт дослідження використовують ліпофільний екстракт м'якоті гарбуза, отриманий за допомогою розчинника гексану на стандартному обладнанні. 4 UA 89730 U Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5