Спосіб визначення вмісту каротиноїдів у біомасі каротиносинтезуючих дріжджів

Корисна модель належить до мікробіології та біотехнології, а саме до способів визначення концентрації біологічно активних продуктів мікробного синтезу, зокрема каротиноїдів, у біомасі дріжджів. Спосіб може бути використаний на підприємствах мікробіологічної промисловості, в медицині, сільському господарстві, харчовій промисловості для визначення вмісту каротиноїдів у клітинах каротиносинтезуючих дріжджів. Відомі різні способи визначення вмісту каротиноїдів у біомасі каротиносинтезуючих дріжджів, зокрема: - вирощування клітин каротиносинтезуючих дріжджів спільно з клітинами бактерій для руйнування клітинної стінки ферментами b-(1®3)-глюканазою, b-(1®6)-глюканазою, a-(1®3)-глюканазою, ксиланазою, хітиназою, що їх синтезують бактерії Bacillus circulans, з наступною екстракцією ацетоном, переведенням каротиноїдів в петролейний ефір, упарюванням та вимірюванням концентрації на спектофотометрі [Simple Method for the Isolation of Astaxanthin from the Basidiomycetous Yeast Phaffia rhodozyma / Johnson E., Villa Т., Lewis M., Phaff H. // Applied and Environmental Microbiology. - 1978. - V.35, №6. - P.1155-1159]. - руйнування клітин дріжджів механічними способами за допомогою скляних кульок та розтирання зі склом з наступною екстракцією ацетоном та визначенням концентрації за інтенсивністю поглинання світла на спектрофотометрі. [Sedmak J.J., Weerasinghe D.K., Jolly S.O. Extraction and quantitation of astaxanthin from Phaffia rhodozyma II Biotech. Techniques. - 1990. - Vol.4. - P.107-112; Крицкий М.С., Чернишева E.K., Соболева И.С. Никотинамидные коферменты на ранних этапах световой индукции каротиногенеза в мицелии Newospora crassa. // Прикладная биохимия и микробиология. - 1977, - Т.13, вып. 6. - С.901-906]. Недоліком цих способів є їх мала ефективність, недостатня точність оцінки та трудомісткість. Найбільш близьким по суті рішенням до заявленого способу є „Метод определения содержания каротиноидов в биомассе дрожжей" [Кирилица Ε. Направленный синтез каротиноидов у дрожей и перспектива их использования: Диссертация доктора биологии: 03.00.23. - Кишинев, 2005. - 129с.], який включає в себе руйнування клітин гідролізом у 1н НСl впродовж 15хв на водяній бані при температурі 90°С, екстракцію каротиноїдів ацетоном з наступним переведенням в гексан та вимірювання інтенсивності поглинання на спектрофотометрі. Недоліком відомого способу є те, що в результаті гідролізу розчином соляної кислоти частина каротиноїдів окислюється, при цьому не відбувається руйнування усі х клітин для повної екстракції, використання різних розчинників робить процес трудомістким, економічно невигідним, занижує показники вмісту каротиноїдів у біомасі дріжджів. Заявлений нами спосіб усуває недоліки прототипу, забезпечує ефективність та зручність використання, економічність для установ, які будуть його застосовувати. В основу корисної моделі поставлено завдання - розробити новий спосіб визначення вмісту каротиноїдів у біомасі каротиносинтезуючих дріжджів, що забезпечує точність результату, зручність у використанні, економічно вигідний для установ, що його будуть застосовува ти. Технічний результат досягають тим, що обробку клітин після відмивання здійснюють розчином цетил-3-метил амоній броміду, а екстрагування каротиноїдів проводять етиловим спиртом. Замість розчину соляної кислоти у заявленому способі використовують розчин цетил-3-метил амоній броміду, що збільшує проникливість клітинної стінки, попереджує руйнування каротиноїдів та сприяє максимальному виходу ци х пігментів з клітин при екстрагуванні, підвищує точність визначення концентрації каротиноїдів у біомасі. Екстракція каротиноїдів етиловим спиртом дає можливість відмовитись від токсичних, дорогих розчинників (петролейний ефір, гексан, ацетон), і тим самим зробити спосіб визначення каротиноїдів зручним у використанні, ефективним та економічно вигідним. Отже, заявлений нами спосіб забезпечує зручне та надійне визначення каротиноїдів у біомасі каротиносинтезуючих дріжджів і об'єктивну оцінку каротиногенезу культур дріжджів. При проведенні патентно-інформаційного пошуку виявлено технічне рішення, в якому є ряд суттєвих ознак, спільних із заявленим рішенням [„Метод определения содержания каротиноидов в биомассе дрожжей" (Кирилица Ε. Направленный синтез каротиноидов у дрожей и перспектива их использования: Диссертация доктора биологии: 03.00.23. - Кишинев, 2005. - 129с.)]: відмивання біомаси від культуральної рідини, обробку клітин розчином кислоти, екстракція каротиноїдів з клітин розчинниками і визначення концентрації каротиноїдів вимірюванням інтенсивності поглинання світла спектрофотометрично. Однак, наявність зазначених, спільних з прототипом ознак недостатня для отримання технічного результату, який забезпечує заявлений спосіб. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю співпадали б із заявленим способом в доступній патентній і науково-технічній інформації не виявлено. Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію корисної моделі - „новизна”. В патентній і науково-технічній інформації не знайдено технічних рішень, в яких були б описані відомості про ознаки, що відрізняють заявлений спосіб від прототипу і забезпечують досягнення технічного результату: обробку клітин після відмивання здійснюють розчином цетил-3-метил амоній броміду, а екстрагування каротиноїдів проводять етиловим спиртом. Отже, заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про відповідність його критерію корисної моделі - „винахідницький рівень". Заявлений спосіб належить до мікробіології та біотехнології, а саме до способів визначення концентрації різних продуктів мікробного синтезу, зокрема каротиноїдів, у біомасі дріжджів. Спосіб може бути використаний на підприємствах мікробіологічної промисловості, в медицині, сільському господарстві, харчовій промисловості для визначення вмісту каротиноїдів у клітинах каротиносинтезуючих дріжджів та вилучення їх з біомаси, а тому відповідає критерію винаходу /корисної моделі/ „промислова придатність". Таким чином, заявлене технічне рішення є новим, промислово придатним, має винахідницький рівень, тобто відповідає всім умовам патентноспроможності корисної моделі [відповідно до ст.7 розділу II Закону України „Про охорону прав на винаходи і корисні моделі" №1771-ІІІ, 2000 рік]. Відомості, що підтверджують можливість здійснення корисної моделі Заявлений спосіб здійснюють наступним чином. Зважуємо 0,3мг сирої біомаси на торсійній вазі з точністю до 0,0001г і кількісно переносимо в бюкс №2. Вливаємо 5см 3 0,1% розчину СТАВ і ресуспендуємо клітини. Клітини інкубують у цьому розчині 15хв при кімнатній температурі, перемішуючи час від часу скляною паличкою. Після цього клітини осаджують на центрифузі при 3500об/хв та двічі відмивають фосфатним буфером (об'ємом 5см 3) до повного вимивання СТАВ. Відмиті клітини кількісно переносять у скляний бюкс з притертою кришкою, доливають 5см 3 96% етанолу і поміщають у темне місце на 24 години. Через зазначений час клітини центрифугують при 3500об/хв. Надосадову рідину зливають у баночку з темного скла, а осад переносять у бюкс та заливають 5см 3 96% етанолу. Екстракцію продовжують до повного знебарвлення клітин. Зібрані екстракти об'єднують в одну пробу. Мензуркою вимірюємо загальний об'єм екстракту (V). Оптичну густину екстракту вимірюють на фотоколориметрі КФК-3 у кюветі, товщиною 3мм, при довжині хвилі 470нм. Як контроль використовуємо 96% етанол. Визначають кількість каротиноїдів у розчині за показами КФК-3 (Сроз), використовуючи калібрувальну криву, побудовану на біхроматі калію. Розраховують вміст каротиноїдів у біомасі дріжджів (С) за формулою: (1) C=Cроз´V/Mс ух,, де: С - вміст каротиноїдів у біомасі дріжджів, мг/г сухої маси; Сроз - кількість каротиноїдів у розчині за калібрувальною кривою, мг/см 3; V - об'єм екстракту, см 3; Мс ух - маса сухих клітин, г. Результат заокруглюють до соти х. З результатів двох паралельних визначень обчислюють середнє арифметичне і визначають відхилення між кожним результатом та середнім значенням. Допустиме відносне відхилення не повинно перевищувати 10%. За кінцевий результат приймають середнє значення, заокруглене до сотих. Приклад конкретного використання способу Ефективність заявленого способу і його переваги перед прототипом підтверджені прикладом конкретного виконання в умовах лабораторії мікробіологічного синтезу біологічно активних речовин Інституту біології тварин УААН. Метод і результати досліджень наведені нижче. Схема досліду та результати досліджень наведені в Таблиці 1. Таблиця 1 Схема досліду № п/п Показники 1 1 2 2.1 2 Проведено досліджень Етапи виконання Відмивання біомаси 2.2 Обробка клітин перед екстракцією 2.3 Екстракція 2.4 Колір клітин після екстракції Визначення інтенсивності поглинання світла Отримані результати Концентрація каротиноїдів в біомасі дріжджів Phaffia rhodozyma штаму IMB Y-5021, мг/г сухої маси 2.5 3 Способи оцінки Відомий (прототип) Новий 3 4 Не менше десяти Не менше десяти + + Кип'ятіння в 1н розчині соляної Обробка клітин 0,1% розчином кислоти 15хв на водяній бані при цетил-3-метил амоній броміду температурі 90°С Петролейний ефір, гексан, Етиловий спирт 96% ацетон Слабо рожеві безколірні + + 0,51±0,03 0,83±0,04 З отриманих даних видно, що вилучення каротиноїдів з біомаси каротиносинтезуючих дріжджів за умов використання заявленого способу відбувається на 39% ефективніше у порівнянні з прототипом. Наведені дані свідчать про перевагу заявленого способу.