Спосіб обробки овульованих яєць водних тварин на делікатесні харчові продукти і овульовані яйця, одержані цим способом

1. Спосіб обробки овульованих яєць водних тварин в делікатесні харчові продукти, який включає наступні етапи: збирання овульованих яєць, екзогенна обробка свіжозібраних овульованих яєць водним розчином, в який додана щонайменше одна молекула сигнальної трансдукції, природним чином присутня також в яйцеклітині, для фізіологічної стабілізації мембрани яйця шляхом активації овопероксидази, і потім консервування. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що здійснюють екзогенну обробку овульованих яєць у водяній бані водним розчином, в який додають 0,01, 0,02, 0,05 або 0,1 % пероксиду водню. 3. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що здійснюють екзогенну обробку овульованих яєць у водяній бані 0,01 %-ним водним розчином пероксиду водню протягом 1-5 хвилин, причому тривалість обробки встановлюється залежно від бажаної твердості оброблених овульованих яєць. 4. Спосіб за одним з пп. 1-3, який відрізняється тим, що здійснюють екзогенну обробку овульова C2 2 UA 1 3 льстві як делікатеси і споживаються все більше. Незрілі (на різних стадіях) яйця риб, ще не відкладені природним чином, називаються ікрою. Теоретично ікру можна одержувати від всіх самиць риб (або водних тварин), яйця яких не отруйні. Сюди при належному приготуванні також належить навіть дуже отруйна риба-куля фугу. З ікри осетра одержують так звану "чорну ікру" або "російську ікру". При цьому розрізнюють осетрову, білужачу і севрюжачу ікру. Однак, нарівні з дикими осетрами для одержання ікри вже використовуються також вирощені осетри. Для одержання сурогату ікри застосовується, наприклад, ікра молюска морський заєць, тріскових риб і оселедця ("німецька ікра"), "Ісландську ікру" одержують з ікри мойви. З форелі одержують форелеву ікру, з лосося - лососеву ікру червоного кольору. Крім того, ікру добувають також з морського їжака. Нарешті, до названих тут водних тварин треба віднести амфібії, наприклад, жаб і жерлянок, які також розмножуються відкладанням ікри. Ікру в більшості випадків солять, іноді також коптять. Копчену ікру одержують гарячим копченням з ікри, що знаходиться в непошкодженій оболонці. її одержують, як правило, з тріскових, в тому числі наваги, і минтая. Ікру омара, великих річкових раків і інших ракоподібних, а також оранжевий ястик молюска гребінця називають "корайлом". Крім високих смакових якостей ікра має і інші цінні властивості. Ікра багата на білок (25-30%) з високою часткою незамінних амінокислот. Однак, містячи 16% жирів, вона не є дієтичним продуктом. Ікра містить вітаміни D, Е, В12 і нікотинову кислоту, а також мінерали йод і натрій. Крім того, вона має високу частку хорошого холестерину. Ікра, яка є в цей час в продажу, є обробленою (очищення, засіл) ікрою, яку в незрілому стані витягують з яєчників самиць риб, оскільки в цьому стані яйця мають достатню міцність відносно етапів обробки, що проводяться далі. Таким чином, щоб одержувати ікру найкращої якості, яйця збирають до того, як вони досягли своєї максимальної зрілості (стадія овуляції). Значну проблему при одержанні ікри представляє передусім видобуток яєць. Проблема умертвіння самиць тварин для видобутку ікри (наприклад, осетрів) існує як у випадку диких тварин, так і в аквакультурі (близько 2500т/рік у всьому світі). Для видобутку чорної ікри і ікри різних видів риб вже сторіччя прийнято вбивати тварин перед витяганням яєць. Головним аргументом для умертвіння жіночих особин, наприклад, у випадку осетрів, є те, що яйця збирають в незрілому стані (до досягнення стадії природної овуляції), оскільки яйця, максимально доспілі в тілі самиці аж до овуляція і, тим самим, готові до запліднення, є дуже м'якими, і при консервуванні тільки сіллю (хлорид натрію) і в комбінації з бурою будуть лопатися і склеюватися в неїстівне слизисте місиво. У ході овуляції, тобто випускання яйця з фолікула яєчника, з яйцем відбуваються природні зміни (розм'якшення мембрани яйця для майбутнього запліднення сперматозоїдами), які обмежують його пряме застосування як ікри. До цього додаються ще осмотичні ефекти, які виникають пізніше в ході засолювання. 92922 4 Відомі з рівня техніка дослідження зі слабкосолоною ікрою стерляді, яка була одержана з метою випробування з овульованих (зрілих) і неовульованих (незрілих) яєць, показали, що зрілі яйця лопаються вже при легкому дотику і розтікаються в густу жирну масу. Однак суттєві смакові відмінності не були зафіксовані. Ця практика вбивства разом з відчутним надмірним виловом привела до загрози вимирання дикої популяції майже 30 різних видів осетрових. Правда, в Росії заразрозроблений новий метод того, як можна добувати незрілу ікру, не вбиваючи риби. Під наркозом проводиться щось типу багаторазового кесарева розтину над яєчниками, незрілі яйця видавлюються, і розріз знов закривається. Пізніше, коли він заживе, рибу можна знов випустити або тримати в розплідниках для пізнішого відбору ікри. Однак, смертність при цьому дуже витратному способі, що викликає у риби сильний стрес, все ще складає більше 40%. Крім того, згідно з німецьким законом про захист тварин, дії такого роду заборонені. У всьому світі були ініційовані програми відновлення популяції, що вимагають високих вкладень. Осетри в природному середовищі досягають статевої зрілості тільки в 8-12 років, в аквакультурі раніше, приблизно в 2-4 роки залежно від виду осетрових. У рамках програми відновлення різні види осетрових були з різним успіхом випущені на волю з аквакультури, щоб врятувати популяції, які знаходяться під загрозою вимирання. Хоч під час розведення жіночі особини залишаються живими, а яйця добуваються зчищанням, через названі вище причини для одержання ікри в аквакультурі також виникає проблема вбивства самиць. Однак, потрібно брати до уваги і високі комерційні втрати при розведенні мальків і молоді, що підросла, для аквакультури і для заходів з випускання мальків, оскільки самиці показують суттєве поліпшення потужності відтворювання з віком. Важливим для якості ікри є її обробка після збирання. Слабкий засіл робить її більш лежкою. Високоякісна ікра солиться якраз настільки, наскільки потрібно, щоб вона мала обмежений термін придатності. Ікра, яка називається малосольною, повинна містити найбільше від 2,8 до 4% солі. В малосольній ікрі значною мірою зберігається натуральний смак. Крім малосольної ікри існує ще бочкова або солона ікра тривалого зберігання, яка змішується з приблизно 10-12% кухонної солі. Свіжа ікра дуже чутлива до температури, і тому її важко зберігати і подавати до столу. Традиційною формою упаковки є герметична консервна банка, що має внутрішнє покриття, для тільки посоленої, але не нагрітої ікри. Пастеризована (коротким нагрівом до 60°С) ікра, що стала придатною для зберігання, постачається в скляних банках з нагвинчуваною кришкою і в банках з металевим вушком для відкривання і в закритому стані придатна протягом року. Проблемою при зберіганні свіжої ікри є розмноження бактерій, що проникли в неї, яке веде до швидкого псування продукту. Проте, при пастеризації ікра через теплову обробку втрачає зернистість і смак. Наступною проблемою при зберіганні 5 ікри і інших продуктів з ікри є викристалізовування молекул тирозину, які знаходяться в яйцях у вигляді замінних амінокислот. Через це викристалізовування продукт стає непридатним для продажу. Крім того, є також проблема зі швидкістю обробки витягнутої ікри. Досі між збиранням яєць самиць і заповненням ікрою банок повинно пройти не більше 10 хвилин, інакше яйця зіпсуються. Для кожного етапу обробки (консервування, пастеризація і т.д.) після збирання яєць обов'язково потрібно, щоб зібрані яйця витримували цю обробку, не лопаючись, оскільки розрив яєць веде до невиправної втрати якості і тим самим до непридатності продукту. З документа JP 60091934A відомий спосіб одержання упакованої ікри оселедця, при якому зібрана ікра оселедця, яка була витягнута в стадії незрілості з убитих перед цим самиць оселедця, після консервування сіллю піддається антибактерійній обробці розчином пероксиду водню і солі, щоб зробити ікринки більш міцними. Завдяки негайному видаленню крові із зібраної ікри оселедця можна знизити концентрацію використовуваного пероксиду водню, що приводить до поліпшення смаку ікри оселедця. Після обробки пероксидом водню і сіллю проводиться обробка каталазою для видалення оксирадикалів пероксиду водню. Однак, негайне видалення крові, ще не згорнулася, можна здійснити тільки відразу після умертвіння риби або незадовго до розмороження риби, замороженої відразу після умертвіння. Однак, оскільки негайне видалення крові з щойно убитої риби здійснюється з дуже великими витратами, то рибу, як правило, спочатку заморожують, що знову ж веде до втрати якості. Крім того, з рівня техніки відомо, що перевіреним засобом в аквакультурі при одержанні ікри з риб, що розводяться, є застосування таніну. Запліднені яйця обробляють розчином таніну, щоб видалити липкий желейний шар. Тим самим можна краще продезінфікувати яйця при інкубуванні і зменшити ураження грибком і бактеріями під час інкубування яєць. Ця обробка є стандартом для різних видів риб, таких як морський окунь, включаючи осетрів (порівняй публікацію 1, Mizuno і ін.: "Elimination of adhesiveness in the eggs of shishamo smelt Spirinchus lanceolatus using kaolin treatment to achieve high hatching rate in environment with a high iron concentration", Aquaculture 242 (2004) pp.713726). Танін - поліфенол є торговою формою дубильної кислоти. Його структура основана на складних ефірах глюкози і галових кислот. Танін застосовується як барвник для дерева і присутній природним чином в дубі, волоському горісі, червоному дереві і секвої як захист від горіння. Також, з публікації 1 (Фіг.5) можна дізнатися, що обробкою таніном можна досягнути більш високого тиску в яйці аж до лопання. Правда, відомо, що через обробку таніном мембрана яєць стає жорсткою як гума і тим самим більше не придатна для вживання. З документа RU 2 126 218 С1 відомий спосіб фарбування яєць, при якому овульована ікра зі слабким природним забарвленням, зокрема також ікра менш цінних в порівнянні з осетровими видів 92922 6 риб, забарвлюється і солиться в два етапи з проміжком щонайменше 0,5год. На першому етапі в ікру відразу додають 2/3 барвника, а на другому етапі вводять частину барвника, що залишилася, разом з емульсією жиру і білка в кількості від 5 до 10% від маси ікри. Засолення проводиться перед другим етапом фарбування. Тим самим при такому способі не можна виключити, що овульована ікра після додавання барвника на першому етапі не лопне при подальшому засолюванні. Введення емульсії жиру і білка проводиться після засолювання і сприяє стійкому забарвленню, а також поліпшенню органолептичних властивостей і захищаючих від опромінення властивостей ікри. З документа RU 2 232 523 С2, з якого даний винахід виходить як з найближчого рівня техніки, відомий спосіб одержання зернистої ікри з овульованої ікри осетрових. При цьому зібрані овульовані яйця спочатку обробляють в гарячому 1,5-2процентному водному розчині консерванту, щоб підготувати їх до подальшої пастеризації при температурі 65-70°С. Незважаючи на те, що будь-який процес нагрівання помітно впливає на смак ікри, при використанні овульованих яєць, які, як відомо, мають дуже м'яку мембрану, це не гарантує з надійністю, що вона витримає наступні обробки консервантом, не лопаючись. Однак, вже мала частка яєць, що лопнули, значно погіршує якість ікри, оскільки видалити яйця, що лопнули, важко. Однак, особливою перевагою при застосуванні овульованих яєць є те, що для їх збирання не треба ні вбивати тварин, ні піддавати їх операціям, що викликають сильний стрес. Згідно із знаннями і методами обробки з рівня техніки, в цей час виходять з того, що з дозрілих (овульованих) яєць осетрових не можна одержати повноцінної ікри, оскільки природно дозрілі яйця через очікуване запліднення є дуже м'якими і при контакті з сіллю або іншими консервантами відразу ж лопнуть. Згадані способи видобутку ікри з овульованої і необробленої ікри не приводять до задовільних результатів. Тому, як задачу винаходу треба назвати спосіб вказаного типу, при якому щойно зібрані овульовані яйця живих водних тварин обробляють так, щоб вони без втрати якості, зокрема, не лопаючись, могли бути перероблені в делікатесні харчові продукти і, тим самим, дозволяли досягнути конкурентоздатної і придатної для продажу якості. Цим способом повинні, зокрема, досягатися менша чутливість яєць при обробці, а також значно більший термін придатності без сильних способів консервування. Крім того, спосіб повинен бути простим і економічним в застосуванні і бути оформлений так, щоб він міг також підтверджуватися готовим продуктом. Рішення згідно з винаходом вказане в пункті 1 формули винаходу, що належить до способу, і включає наступні технологічні етапи: - збирання запліднених яєць без шкідливого впливу на водну тварину, - екзогенна обробка свіжозібраних, запліднених яєць водним розчином, в який додана щонайменше одна молекула сигнальної трансдукції, природним чином також присутня в яйцеклітині, 7 для фізіологічної стабілізації мембрани яйця через активацію овопероксидази, і потім - консервування. Переважні удосконалення способу вказані в залежних пунктах і далі пояснюються більш детально в зв'язку з винаходом. Крім того, в пункті 13, що належить до продукту, вказується, що овульовані яйця, оброблені способом згідно з винаходом, мають затверділу позаклітинну зовнішню плівку зі зшитими білковими волокнами і необоротно вбудованими молекулами тирозину. Подібна молекулярна структура в природі в незапліднених яйцях не зустрічається. Подібного одержаного штучним шляхом продукту до цього часу в рівні техніки не існувало. У способі згідно з винаходом овульовані яйця, тобто повністю дозрілі для запліднення яйця (ікринки) знерухомлених водних тварин, головним чином осетрових, збирають природним випусканням овульованих яєць з природного отвору тіла і простого зчищанням. Тим самим стресове навантаження на тварин зводиться до мінімуму і навряд чи обтяжує їх. Свіжозібрані овульовані яйця перед консервуванням обробляють екзогенно молекулами сигнальної трансдукції, які також природним чином присутні в яйцеклітині. Тим самим активується фермент овопероксидаза, який ініціює утворення і твердіння міжклітинної зовнішньої плівки і, тим самим, фізіологічну стабілізацію мембрани яйця. Як назву, що легко запам'ятовується, для відповідного винаходу процесу отвердіння можна використовувати позначення "OVOHARD". Шляхом обробки овульованих яєць щонайменше однією природним чином присутньою в яйцеклітині молекулою, яка інакше, при нормальному обміні в клітині, утворювалася б лише в незначних концентраціях, була знайдена абсолютно нешкідлива можливість обробки, яка не викликає сумнівів відносно дотримання норм харчового законодавства, для надання яйцю міцності. При цьому способом згідно з винаходом, внаслідок простого внесення натуральної речовини викликається штучно ініційоване отвердження одержаних яєць, яке робить овульовані яйця значно менш чутливими до подальшої обробки, передусім при консервуванні і наповненні, а також при зберіганні і фасуванні. Іншою перевагою цього штучного отвердження є краще збереження і, тим самим, збут одержаних яєць, оскільки попереджується утворення кристалів тирозину при зберіганні. Активуванням овопероксидази викликається зшивання білкових волокон і необоротне вбудовування тирозину в непроникну мембрану, тим самим запобігається кристалізація. Крім того, обробка має бактерицидну дію, внаслідок чого суттєво подовжується термін придатності продуктів. Спосіб згідно з винаходом полягає у зовнішній обробці свіжозібраних овульованих яєць щонайменше однією молекулою, яка також природним чином присутня в яйцеклітині і яка грає ключову роль в ланцюгу сигнальної трансдукції, що ініціює твердіння мембрани при природному заплідненні. При цьому маються на увазі, зокрема, іони кальцію (Са++), які після зовнішнього збудження течуть через яйце і приводять до активації ферментів. Крім 92922 8 того, існує щонайменше одна інша ключова молекула. Мається на увазі утворювана з NADPHзалежної оксидази молекула пероксиду водню Н2О2. Пероксид водню ініціює в незначних мікромолярних концентраціях природне, ендогенно зумовлене утворення твердої оболонки запліднення навколо яйця. Іони кальцію (Са++) знаходяться в незаплідненій яйцеклітині в так званих накопичувачах кальцію, мітохондріях і ендоплазматичній сітці, але можуть також попасти в клітину шляхом втікання зовні через специфічні рецептори. За допомогою цієї хвилі кальцію відбувається вивільнення ферментів з внутрішньоклітинних накопичувачів, в яких вони знаходяться в неактивній формі. У свою чергу, ці ферменти (наприклад, глюкоза-6фосфатдегідрогеназа) виробляють NADPH. NADPH означає важливу в анаболізмі фосфориловану форму NADH, яка утворюється з NAD (нікотинамід-аденін-динуклеотид) при додаванні гідридних іонів. NADPH-оксидаза продукує пероксид водню, який, в свою чергу, є субстратом для овопероксидази, відповідальної за тверднення мембрани яйця. У природі незапліднене овульоване яйце знаходиться в стані спокою доти, поки при природному заплідненні не буде бомбардуватися множиною сперматозоїдів. Всі сперматозоїди, крім одного, який зливається з яйцем, повинні затримуватися. При природному заплідненні через декілька секунд після проникнення сперматозоїда мембрана яйця твердне, щоб запобігти смертельному для зародка багаторазовому заплідненню декількома сперматозоїдами (поліспермія, виключення - незначне багаторазове запліднення, яке веде до народження однояйцевих близнюків). Зародок, що утворюється, справляється з цією задачею тим, що протягом секунд утворює міжклітинну зовнішню плівку, яка непроникна для інших сперматозоїдів. Крім того, зародок захищається від механічного пошкодження і отруйних речовин. Ключовим ферментом для цього процесу є овопероксидаза, яка знаходиться напоготові в стані очікування в гранулах (кортикальних гранулах) за мембраною яйця. У момент запліднення запускається вищеописана реакція. Через утворену овопероксидазу відбувається зшивання білкових волокон і необоротне вбудовування стимульованої процесом тирозинкінази в непроникну міжклітинну мембрану, яка захищає зародок. Цей механізм поширюється на весь тваринний світ безхребетних, як морські їжаки, і хребетних, як риби, миші і люди, для захисту ембріонів (див., наприклад, публікацію II, La Fleur et al.: "Searching ovoperoxidase: oocyte specific member of a heme dependent peroxidase superfamily that functions to stop polyspermy", Mechanisms of Developments 70 (1998), pp.77-89, і публікацію III, Wessel et al.: "The Biology of Cortical Granules" Int. Rev. Cytol. 209 (2001), pp.117-206). У публікації IV: "Conformational Control of Ovoperoxidase Catalysis in the Sea Urchin fertilization Membrane", автори T.L. Deits і ін. (Journal of Biological Chemistry, Vol.261, No.26, Issue of September 15, pp.12159-12165,1966) і в публікації V "Release of ovoperoxidase from sea urchin eggs hardens the fertilization membrane with 9 tyrosine crosslinks", Ch.A. Foerder et al. (Proc. Natl. Acad. Ser. Vol.74, No.11, pp.4214-4218, October 1977, Biochemistry) було основоположно і уперше хроматографічним методом встановлене зшивання тирозину і твердіння мембрани і те, як це відбувається. Крім того, було досліджено, що тирозин (залишки) грає важливу роль в процесі тверднення. За допомогою специфічних інгібіторів пероксидази було виявлено, що (ово)пероксидаза, очевидно, грає важливу біологічну роль при зшиванні тирозину і тим самим при твердінні мембрани. На основі описаного вище клітиннобіологічного явища в способі згідно з винаходом було розроблено екзогенне внесення щонайменше однієї, природним чином присутньої в яйцеклітині молекули сигнальної трансдукції для твердіння мембрани яйця без використання сперматозоїдів. При цьому під молекулами сигнальної трансдукції переважно маються на увазі оксирадикал пероксиду водню Н2О2 або розчин хлориду кальцію СаСІ2 як джерело іонів кальцію. Можливе спільне застосування обох молекул сигнальної трансдукції, оскільки це більше усього імітує твердіння мембрани яйця в ході природного процесу, і таким шляхом можливий індивідуальний дизайн продукту, зокрема, відносно міри твердості оброблених яєць, залежно від стратегії маркетингу. Екзогенне внесення і проникнення молекул сигнальної трансдукції, що штучно вводяться, в незапліднене овульоване яйце моделює згідно з винаходом каскад сигнальної трансдукції природного запліднення, і відбувається утворення твердої міжклітинної зовнішньої плівки у незапліднених овульованих яєць. Рівномірне твердіння всіх яєць, що досягається способом згідно з винаходом, підвищується із збільшенням тривалості обробки від 1 хвилини до 20 хвилин. Тим самим міру твердості можна індивідуально регулювати тривалістю обробки. Навпаки, концентрація, що вводиться, молекул сигнальної трансдукції, які також природним чином присутні в яйцеклітині, але при низьких концентраціях, надає найсильнішу дію на міру тверднення (див. Фіг.5С для Н2О2). Це зрозуміло, оскільки природні концентрації молекул сигнальної трансдукції в клітині діють на рівні як нано-, так і мікромолів. Відповідно до способу згідно з винаходом обробку свіжозібраних яєць можна особливо вигідно проводити у водяній бані протягом п'яти хвилин при додаванні 0,01%-0,02% пероксиду водню і/або іонів кальцію у вигляді хлориду кальцію СаСІ2. Обидві молекули сигнальної трансдукції можуть використовуватися по окремості, а також в комбінації. Після збирання оброблювані незапліднені овульовані яйця спочатку промивають в фізіологічному розчині кухонної солі до контакту з водою, щоб запобігти передчасному склеюванню і збільшити термін придатності свіжих яєць для обробки. При цьому етап промивання проводиться переважно в стерильних, умовах. Потім стерильно промиті яйця просто подають у відповідну ванну з визначеними згідно з удосконаленням заявленого способу концентраціями пероксиду водню і/або хлориду кальцію і по закінченні часу впливу про 92922 10 водяться через сито. Таким чином, винахід пропонує дуже простій, швидкий спосіб, який при цьому не вимагає великих витрат. Вигідною тут є також низька концентрація використовуваних реагентів, яка зумовлює лише самі незначні потрібні кількості цих реагентів, що знову ж позитивно діє на смак оброблених овульованих яєць. Пероксид водню розкладається на воду і кисень і тому не має смаку. Кальцій присутній у всіх рослинних і тваринних клітинах і має смак, декілька вапняковий, тільки в дуже високих концентраціях, які, однак, згідно з винаходом не використовуються. Спосіб згідно з винаходом застосовується головним чином до незапліднених, овульованих яєць (ікринок) відповідних водних тварин. При цьому, природно, збирання живих водних тварин переважно проводити так, щоб не викликати загрози цьому виду. Однак, рівним чином можна також добувати ікру з убитих або мертвих водних тварин. Перевагою при цьому є те, що яйця спійманих диких тварин, а також тварин з аквакультури, можна переробити, навіть якщо вони в своїй зрілості наближаються до стадії овуляції. Досі в оброблювальній промисловості ікру, яка вже знаходиться в стадії овуляції, викидали невикористаною, що представляє економічні втрати, які не є несуттєвими. З одного боку, можна використовувати ікринки водних тварин, убитих через інші причини (наприклад, для споживання), а з іншого боку, ніяка водна тварина більше не буде убита марно, якщо виявиться, що її яйця вже знаходяться в стадії овуляції (досі такі яйця викидалися невикористаними як непридатні). Також, за рахунок способу згідно з винаходом, завдяки зшитому тирозину, стабільно включеному в отверджену мембрану яйця, його викристалізовування при зберіганні попереджується, внаслідок чого досягається суттєве поліпшення продукту і часто навіть порятунок продукту. Крім того, спосіб згідно з винаходом має бактерицидні, стерилізуючі властивості, внаслідок чого суттєво поліпшується збереження овульованих яєць і одержаних з них делікатесних продуктів. Однак, основна перевага способу згідно з винаходом полягає в тому, що з ним уперше стало можливим переробляти як ікру дозрілі овульовані яйця риб і інших водних тварин на стадії овуляції. Яйця збирають зчищанням, однак їх можна також збирати механічно або за допомогою відсмоктувального пристрою, так щоб самиці тварин залишалися живими. Нарівні із збереженням популяції видів, що знаходяться під загрозою, є також перевага в збереженні здатних до репродукції самиць, чим досягаються значні економічні переваги для аквакультури. При неодноразовому настанні стадії розмноження значно підвищується видобуток ікри і результат відтворювання (частка життєздатних ембріонів). Спосіб згідно з винаходом може просто і без проблем застосовуватися до будь-якого виду яєць живих тварин, що мешкають у воді і біля води, і тим самим, зокрема, також сприяти збереженню рідкісних видів тварин. Особливу перевагу для економіки це дає, природно, при одержанні ікри з яєць осетра і при одержанні корайла з яєць ома 11 рів. Тверднення зібраних овульованих яєць, здійснюване при застосуванні способу згідно з винаходом, робить можливим, крім того, надійне консервування яєць, наприклад, хлоридом натрію або бурою. Також без проблем яйця можна закоптити. Більше не треба побоюватися того, що яйця лопнуть, що суттєво підвищує якість продукту. Крім того, можна виробляти ікру різної міри твердості шляхом зміни тривалості обробки/концентрації і в комбінації з сіллю і/або бурою і, тим самим, пристосовуватися до органолептичних вимог до смаку відповідного кола споживачів. Застосування способу згідно з винаходом суттєво змінює одержані овульовані яйця в тому, що стосується морфології затверділої мембрани яйця. Зокрема, фахівець за допомогою просвічувальної мікроскопії, а в деталях за допомогою електронної мікроскопії, може просто і однозначно ідентифікувати затверділу міжклітинну зовнішню плівку із зшитими волокнами білка і необоротне вбудовування молекул тирозину. Ця картина не зустрічається в природних, оброблених звичайним шляхом яйцях водних тварин. Твердіння яйцеклітини може відбуватися завжди тільки в зв'язку із заплідненням і, отже, в присутності щонайменше одного сперматозоїда в заплідненій яйцеклітині. Тим самим можна без сумнівів підтвердити застосовність способу згідно з винаходом також по готовому незаплідненому продукту. Далі за допомогою Фіг. докладніше пояснюються форми здійснення способу обробки яєць водних тварин в делікатесні продукти відповідно до винаходу. При цьому показано: Фіг.1: процес природного тверднення у яєць морського їжака, Фіг.2: обробка даних з утворення NADPH за допомогою мікроскопії з уповільненою покадровою зйомкою для оцінки способу згідно з винаходом, Фіг.3А: необроблене овульоване яйце морського їжака, Фіг.3В: оброблене овульоване яйце морського їжака, Фіг.4А: знімки надтонких зрізів мембрани необробленого овульованого яйця осетра, Фіг.4В: знімки надтонких зрізів мембрани необробленого овульованого яйця осетра після обробки хлоридом кальцію, Фіг.4С: знімки надтонких зрізів мембрани необробленого овульованого яйця осетра після обробки пероксидом водню, Фіг.5А, В: діаграма вимірювання частки (в %) компонентів мембрани від повної товщини мембрани незрілих яєць (ікринок) осетра, оброблених згідно з винаходом, і Фіг.5С, D діаграма вимірювання частки (в %) компонентів мембрани від повної товщини мембрани овульованих яєць осетра, оброблених згідно з винаходом. Фіг.1 показує природне запліднення яєць морського їжака і утворення міжклітинної мембрани запліднення. Лівий знімок показує в 200-кратному збільшенні незапліднене яйце. Правий знімок в тому ж збільшенні показує запліднене яйце з затверділою мембраною запліднення (фертилізацій 92922 12 ною мембраною, стрілка). Маленькими рисками показані атакуючі сперматозоїди. Спосіб згідно з винаходом був перевірений на живих яйцях морських їжаків (Psammechinus miliaris) і на яйцях сибірського осетра (Acipenser baerii). Результати тверднення овульованих яєць досліджувалися in vivo за допомогою вимірювання ферментної активності і морфології яєць морського їжака і яєць осетра. Як вказувалося вище, активація ферменту глюкоза-6-фосфатдегідрогенази для одержання відновного еквівалента NADPH для виробництва Н2О2 як субстрату для овопероксидази, ініціювання твердіння мембрани яйця є миттєвою. Підвищення активності G6PDH під впливом екзогенних стимулів можна виміряти на живих яйцях. Як доказ, методи Van Noorden і Fredericks (1992) з використанням солі тетразолію були перенесені на живі клітини. Утворювана при взаємодії з субстратом NADPH кількісно відновлює сіль тетразолію (TNBT) до коричнюватого продукту реакції - формазану. Утворення продукту реакції реєструється за допомогою вимірювання під часі поглинання на довжині хвилі 585 нм. Фіг.2 показує знімки цейтрайферної мікроскопії (мікроскопії з уповільненою покадровою зйомкою, формування зображень на приладі Zeiss Axiovert, Axiocam, програма KS300, Axiovsion Software) утворення NADPH в яйцях живих морських їжаків. Стрілка вказує введення екзогенного стимулу (Н2О2, 1% в морській воді). Обидві верхні криві поглинання в кортикальній області (край яйця) і в цитоплазмі (внутрішня частина яйця) виявляють після введення помітне зростання у часі (в секундах). Був проведений контрольний експеримент без екзогенного стимулу. Обидві нижні криві поглинання для кортикальної області і цитоплазми показують відсутність яких-небудь змін після введення. Вимірювальні маски (вимірювальна макрокоманда) для мікроскопії представлені на обох нижніх знімках Фіг.2. Лівий знімок показує кільцеву вимірювальну маску для кортикальної області, правий знімок показує круглу вимірювальну маску для цитоплазми. Ферментна активність в кортикальній області під мембраною яйця є найвищою, оскільки тут виникає найвища потреба в NADPH для використання Н2О2. Ідентичний хід активування ферменту спостерігався для овопероксидази після внесення Н2О2. Фіг.3а показує необроблене овульоване яйце морського їжака без захисної мембрани (збільшення 400х). Кортикальні гранули лежать вільно розподіленими на поверхні яйця і покриті лише тонким, не помітним в просвічувальний мікроскоп шаром вітеліну. Фіг.3b показує яйце, оброблене способом згідно з винаходом, з помітною утвореною захисною мембраною (стрілка, збільшення 400х). Підтвердження проводилося гістологічними дослідженнями тонких зрізів зафіксованого матеріалу яйця (4% формальдегід Бейкера, залиття в епон для ПОМ, забарвлення толуїдином синім) перед і після обробки екзогенним агентом тверднення за винаходом. Широкі дослідження зібраних яєць осетра (Acipenser baerii) показали, що спосіб, розробле 13 ний для яєць морського їжака, може бути напряму перенесений на них і дає бажані результати. Проведене після тверднення яєць консервування кухонною сіллю і бурою, а також випробування на придатність при зберіганні понад 12 місяців показали, що яйця залишаються стабільними. На Фіг.4А-С показані одержані за допомогою просвічувальної мікроскопії знімки нарізаних в кріостаті зрізів, забарвлених Н&Е, електронномікроскопічних знімків ультратонких зрізів, зафіксованих галієм і осмієм і укладених в епон яєць осетра. Знімки показують зміни мембрани овульованих яєць осетра внаслідок обробки згідно з винаходом. Фіг.4А показує знімок, одержаний просвічувальною мікроскопією, зрізу овульованого яйця осетра без обробки згідно з винаходом. Оточуюча плазму яйця (EPL) оболонка (суцільна лінія) осетрових яєць складається з декількох шарів мембран. Мембрана, що знаходиться в самій середині, позначена однією зірочкою (*), а сама зовнішня мембрана (мембрана запліднення) - трьома зірочками (***). На Фіг.4Аа показаний електронномікроскопічний знімок в 3000-кратному збільшенні в області самої внутрішньої мембрани (*) і його фрагмент в 12000-кратному збільшенні з вільними клубками волокон тирозину. На Фіг.4В показане овульоване яйце осетра, оброблене згідно з винаходом 115мг/л хлориду кальцію. На Фіг.4Вb показаний електронномікроскопічний знімок в 3000-кратному збільшенні і його фрагмент в 12000-кратному збільшенні з ущільненням через зшивання тирозину. На Фіг.4С показане овульоване яйце осетра, оброблене 0,01% пероксиду водню. Фіг.4Сс показує електронно-мікроскопічний знімок в 3000-кратному збільшенні і його фрагмент в 12000-кратному збільшенні з ущільненням до клубків через зшивання тирозину. З порівняння Фіг.4А (необроблений), 4В (оброблений хлоридом кальцію), 4С (оброблений пероксидом водню) виразно видно, що внаслідок обробки способом згідно з винаходом сама внутрішня 92922 14 мембрана (*) овульованого яйця осетра зменшується в діаметрі і ущільнюється через зшивання тирозину, тоді як сама зовнішня мембрана (***) збільшується в діаметрі, але також стає? щільнішою. Ущільнення веде до бажаного тверднення мембрани яйця. Міру твердіння можна регулювати дозуванням екзогенних добавок (виду, кількості і тривалості). Фіг.5A-D показують різні діаграми виміряних часткою (в %) компонентів мембрани в повній товщині мембрани для стандартної ікри з незрілих яєць, що є в цей час в продажу (Фіг.5А, 5В), і ікри з овульованих яєць (Фіг.5С, 5D) після обробки способом згідно з винаходом пероксидом водню або хлоридом кальцію. Фіг.5А і 5С показують обробку пероксидом водню Н2О2 (обробка 0: необроблений, обробка 1: 0,01%-ний розчин, обробка 2: 0,02%-ний розчин, обробка 3: 0,05%-ний розчин, обробка 4: 0,1%-ний розчин), Фіг.5В і 5D показують обробку хлоридом кальцію СаСІ2 (обробка 0: необроблений, обробка 1:115мг/л, обробка 2: 123мг/л, обробка 3: 130мг/л, де л = на літр розчину). Це означає, що дозування іонів кальцію в діапазоні мікромолів повинно містити істотно більше іонів кальцію, ніж в звичайній питній і мінеральній воді. "FM" означає фертилізаційну мембрану (мембрану запліднення), яка одержується без запліднення, а тільки внаслідок обробки способом згідно з винаходом, "ІМ" означає внутрішню мембрану. З Фіг.5А і 5В чітко видно, що при обробці стандартної ікри, що є в цей час в продажу, тобто ікри з незрілих яєць, не відбувається ніяких суттєвих змін щільності мембрани, тоді як, згідно з фігурами 5С і 5D, при обробці овульованих яєць згідно з винаходом суттєвим є зміщення частки в товщині з внутрішньої мембрани на утворену фертилізаційну мембрану, яка викликає тверднення. Показані середні значення по відповідних 50 вимірюваннях внутрішньої мембрани (ІМ) і зовнішньої фертилізаційної мембрани (FM) з розподілом значень в довірчому інтервалі 25%-75% (прямокутники) і мінімальні і максимальні значення. 15 92922 16 17 92922 18 19 92922 20 21 Комп’ютерна верстка А. Рябко 92922 Підписне 22 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601