Застосування 3-(5-аміно-2-метил-4-оксохіназолін-3(4н)-іл)-піперидин-2,6-діону в лікуванні імунних і запальних захворювань

Реферат: Винахід стосується способу застосування сполуки І для модулювання активності лімфоцитів, включаючи активність В-клітин і/або Т-клітин, при імунних захворюваннях або запальних захворюваннях. UA 110965 C2 (12) UA 110965 C2 UA 110965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1. Перехресне посилання на споріднені заявки По даній заявці вимагається пріоритет на основі попередньої патентної заявки США № 61/451995, поданої 11 березня 2011 р., і попередньої патентної заявки США № 61/480272, поданої 28 квітня 2011 р., повний зміст яких включений в даний документі за допомогою посилання. 2. Список послідовностей Дана заявка подана разом зі списком послідовностей, представленим у вигляді файлу з назвою 12827-263-228_SeqListing.txt, розміром 6571 байт, створеного 8 березня 2012 р. Повний зміст списку послідовностей включений в даний документ за допомогою посилання. 3. Галузь техніки Даний винахід стосується способів лікування, запобігання і/або контролювання захворювань, пов'язаних з активністю лімфоцитів, включаючи активність В-клітин і/або Т-клітин, наприклад, імунних захворювань або запальних захворювань, що включає введення сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера, рацемічної суміші, спів-кристала, клатрату або поліморфа, де сполука I являє собою 3-(5-аміно-2-метил-4оксохіназолін-3(4H)-іл)піперидин-2,6-діон. У даному документі також представлені фармацевтичні композиції і режими дозування для такого лікування, запобігання і/або контролювання. 4. Рівень техніки Запальні і імунні захворювання, що модулюються активністю лімфоцитів, включаючи активність В-клітин і/або Т-клітин, такі як вовчак, склеродермія, синдром Шегрена, ANCAіндукований васкуліт, антифосфоліпідний синдром і міастенія, продовжують залишатися важливими медичними проблемами. Вовчак або системний червоний вовчак, являє собою сукупність аутоімунних захворювань, які можуть спричиняти хронічне запалення в різних частинах тіла, особливо в шкірі, суглобах, крові і нирках. Імунна система організму звичайно виробляє білки, що називаються антитілами, для захисту організму від вірусів, бактерій і інших чужорідних матеріалів (тобто, антигенів). При аутоімунних захворюваннях, таких як вовчак, імунна система втрачає здатність розрізняти антигени і власні клітини і тканини, і може продукувати антитіла, спрямовані проти власних клітин і тканин, з утворенням імунних комплексів. Ці імунні комплекси можуть нагромаджуватися в тканинах і спричиняти запалення, пошкодження тканин і/або болю. Три найпоширеніші типи вовчака включають системний червоний вовчак (СЧВ) (SLE), шкірний червоний вовчак (ШЧВ) (CLE) і медикаментозний вовчак. Більш докладний опис вовчака або системного червоного вовчака, можна знайти в книзі Wallace, 2000, The Lupus Book: А Guide for Patients and Their Families, Oxford University Press, перероблене і доповнене видання, повний зміст якого включений в даний документ за допомогою посилання. Склеродермія є рідкісним захворюванням, зі стабільною частотою зустрічальності приблизно 19 випадків на 1 мільйон чоловік. Точна причина виникнення склеродермії невідома. Аномалії включають аутоімунні вияви і зміну функції ендотеліальних клітин і фібробластів. Системна склеродермія звичайно починається з потовщення шкіри, як правило, на пальцях, що супроводжується синдромом Рейно. Хвороба Рейно звичайно передує подальшим виявам системної склеродермії. На ранніх стадіях захворювання уражені ділянки шкіри можуть бути опухлими і м'якими. Як правило, потовщені і затверділі ділянки шкіри знаходяться переважно на обличчі, руках і пальцях. Часто має місце склеродактилія. Шум тертя сухожиль часто визначається при пальпації і може супроводжуватися болем. На більш пізніх стадіях захворювання можуть виникати виразки на пальцях і відбуватися аутоампутація. Характерною рисою є порушення моторики шлунково-кишкового тракту, що часто виявляється у вигляді печії або діареї з порушенням всмоктування або псевдообструкцією. Уперше виникаюча гіпертензія або ниркова недостатність є виявами супутнього пошкодження судин. Також можливий розвиток серцевої недостатності або аритмії через серцевий фіброз. (Hachulla Е., Launay D., Diagnosis and classification of systemic sclerosis, Clin Rev Allergy Immunol 2010; 40(2): 78-83). Основними виявами склеродермії і, зокрема, системного склерозу, є надлишковий синтез і відкладення колагену, ендотеліальна дисфункція, спазм, колапс і облітерація в результаті фіброзу. З точки зору діагностики, важливим клінічним параметром є потовщення шкіри безпосередньо поблизу зап'ястно-фалангових суглобів. Синдром Рейно є частим, майже універсальним компонентом склеродермії. Він діагностується по зміні кольору шкіри під впливом холоду. Ішемія і потовщення шкіри є симптомами хвороби Рейно. Як і раніше існує потреба в профілактичних або терапевтичних лікарських засобах, які можна використовувати для лікування або запобігання імунним або запальним захворюванням, 1 UA 110965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 включаючи вовчак, склеродермію, синдром Шегрена, ANCA-індукований васкуліт, антифосфоліпідний синдром і міастенію. 5. Суть винаходу Даний винахід стосується способів лікування, менеджменту, полегшення і/або запобігання захворюванням, розладів і/або станів, пов'язаних з імунними і запальними захворюваннями, що включає введення терапевтично ефективної кількості сполуки формули I Сполука I, або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера, рацемічної суміші, спів-кристала, клатрату або поліморфа. У одному варіанті здійснення сполука являє собою 3-(5-аміно-2-метил-4-оксохіназолін-3(4H)іл)піперидин-2,6-діон. У деяких варіантах здійснення захворювання вибирають з вовчака, склеродермії, синдрому Шегрена, ANCA-індукованого васкуліту, антифосфоліпідного синдрому і міастенії. У одному варіанті здійснення даний винахід стосується способів модулювання, наприклад, зниження, активності лімфоцитів, в тому числі активності В-клітин і/або Т-клітин, що включає створення контакту В-клітини і/або Т-клітини з ефективною кількістю сполуки I. Даний винахід також стосується фармацевтичних композицій, одиничних лікарських форм і наборів, прийнятних для застосування в лікуванні, запобіганні, послабленні і/або менеджменті захворювань, розладів і/або станів, пов'язаних з імунними і запальними захворюваннями, що містять сполуку I, необов'язково в поєднанні з одним або більше іншими терапевтичними засобами. У деяких варіантах здійснення сполуку I вводять в поєднанні з одним або більше терапевтичними засобами, тобто, фармацевтичними засобами, які є модуляторами активності лімфоцитів, в тому числі активності В-клітин і/або активності Т-клітин. Поєднання охоплюють одночасне, а також послідовне введення. 6. Короткий опис креслень На Фіг. 1 показаний ефект 3-(5-аміно-2-метил-4-оксохіназолін-3(4H)-іл)піперидин-2,6-діону на продукцію цитокінів і хемокінів в стимульованих анти-CD3 людських Т-клітинах, представлений у вигляді абсолютної виробленої кількості. На Фіг. 2 показаний ефект 3-(5-аміно-2-метил-4-оксохіназолін-3(4H)-іл)піперидин-2,6-діону на продукцію цитокінів і хемокінів в стимульованих анти-CD3 людських Т-клітинах, представлений у вигляді процентів від контролю. На Фіг. 3 показане інгібування продукції цитокінів і хемокінів в стимульованих ліпополісахаридом мононуклеарних клітинах периферичної крові 3-(5-аміно-2-метил-4оксохіназолін-3(4H)-іл)піперидин-2,6-діоном. На Фіг. 4 показане збільшення продукції цитокінів і хемокінів в стимульованих ліпополісахаридом мононуклеарних клітинах периферичної крові 3-(5-аміно-2-метил-4оксохіназолін-3(4H)-іл)піперидин-2,6-діоном. На Фіг. 5 показане збільшення продукції НК-клітинами IFN-гамма у відповідь на іммобілізування IgG і IL-2, представлене у вигляді абсолютної виробленої кількості, для 3-(5аміно-2-метил-4-оксохіназолін-3(4H)-іл)піперидин-2,6-діону. На Фіг. 6 показане збільшення продукції НК-клітинами IFN-гамма у відповідь на іммобілізування IgG і IL-2, представлене у вигляді процентів від кількості IFN-гамма, продукованої в присутності 1 мкМ помалідоміду, для 3-(5-аміно-2-метил-4-оксохіназолін-3(4H)іл)піперидин-2,6-діону. На Фіг. 7 показаний ефект 3-(5-аміно-2-метил-4-оксохіназолін-3(4H)-іл)піперидин-2,6-діону на опосередковану НК-клітинами ADCC відносно покритих ритуксимабом клітин лімфоми. На Фіг. 8 приведені мікрофотографії забарвлених гематоксиліном і еозином зрізів шкіри, що демонструють дермальне потовщення пошкодженої шкіри в мишачій моделі індукованого блеоміцином шкірного фіброзу (запобігання викликаному запаленням фіброзу). На Фіг. 9 приведені мікрофотографії забарвлених гематоксиліном і еозином зрізів шкіри, що демонструють дермальне потовщення пошкодженої шкіри в мишачій моделі індукованого блеоміцином шкірного фіброзу (регресія розвиненого фіброзу). 7. Докладний опис винаходу 2 UA 110965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Якщо не вказано інше, всі технічні і наукові терміни, що використовуються в даному документі, мають те ж значення, якого їм звичайно надають фахівці в даній галузі. Повний зміст всіх патентів, патентних заявок, опублікованих заявок і інших публікацій включено в даний документ за допомогою посилань. У випадку, коли є множинавизначень термінів, приведених в даному документі, терміни, приведені в даному розділі, будуть мати переважну силу, якщо не вказано інше. Використовувані в даному документі терміни "лікувати", "що лікує" і "лікування", якщо не вказано інше, означають полегшення або зменшення тяжкості захворювання або симптому, пов'язаного із захворюванням або станом, який лікують. Використовувані в даному документі терміни "запобігати", "запобігання" і іншим формам слова включають інгібування початку або прогресування захворювання або розладу, або симптому конкретного захворювання або розладу. У деяких варіантах здійснення пацієнти з сімейною історією раку є кандидатами для режиму профілактики. Як правило, в контексті раку, термін "запобігання" означає введення лікарського засобу до появи ознак або симптомів раку, зокрема у пацієнтів з ризиком розвитку раку. Використовуваний в даному документі термін "менеджмент", якщо не вказано інше, означає запобігання рецидиву конкретного захворювання або розладу у суб'єкта, який страждав на нього, збільшення терміну, протягом якого суб'єкт, страждаючий на захворювання або розлад, залишається в стадії ремісії, зниження смертності серед суб'єктів і/або підтримування нижчого ступеня тяжкості захворювання, або запобігання симптомам, пов'язаним із захворюванням або контрольованим станом. Використовуваний в даному документі термін "суб'єкт" означає тварину, як правило, ссавця, включаючи людину. Використовуваний в даному документі термін "пацієнт" означає суб'єкта людину. Використовувані в даному документі терміни "терапевтично ефективна кількість" і "ефективна кількість" сполуки, якщо не вказано інше, означають кількість, достатню для забезпечення терапевтичного ефекту при лікуванні, запобіганні і/або менеджменті захворювання, для затримування появи або мінімізації одного або більше симптомів, пов'язаних із захворюванням або станом, який лікують. Терміни "терапевтично ефективна кількість" і "ефективна кількість" можуть включати кількість, яка поліпшує загальні результати терапії, знижує або запобігає симптомам або причинам захворювання або розладу, або збільшує терапевтичну ефективність іншого терапевтичного засобу. Використовуваний в даному документі термін "профілактично ефективна кількість" сполуки, якщо не вказано інше, означає кількість, достатню для запобігання захворюванню або стану, або одного або більше симптомів, пов'язаних із захворюванням або станом, або для запобігання їх рецидиву. Профілактично ефективна кількість сполуки означає кількість терапевтичного засобу, одного або в поєднанні з іншими засобами, що забезпечує профілактичний ефект, запобігаючи захворюванню. Термін "профілактично ефективна кількість" може включати кількість, яка поліпшує загальну профілактику або посилює профілактичну ефективність іншого профілактичного засобу. Використовуваний в даному документі термін "фармацевтично прийнятна сіль", якщо не вказано інше, включає, але не обмежується ними, сіль кислотної групи, яка може бути присутньою в сполуках за винаходом. При певних кислих умовах сполуки може утворювати самі різноманітні солі з різними неорганічними і органічними кислотами. Кислотами, які можна використовувати для отримання фармацевтично прийнятних солей таких основних сполук, які утворюють солі, що містять фармакологічно прийнятні аніони, включаючи, але не обмежуючись ними, ацетат, бензолсульфонат, бензоат, бікарбонат, бітартрат, бромід, кальцію едетат, камсилат, карбонат, хлорид, бромід, йодид, цитрат, дигідрохлорид, едетат, едисилат, естолат, езилат, фумарат, глюцептат, глюконат, глутамат, гліколіларсанілат, гексилрезорцинат, гідрабамін, гідроксинафтоат, ізетіонат, лактат, лактобіонат, малат, малеат, манделат, метансульфонат (мезилат), метилсульфат, мускат, напсилат, нітрат, пантотенат, фосфат/дифосфат, полігалактуронат, саліцилат, стеарат, сукцинат, сульфат, танат, тартрат, теоклат, триетіодид і памоат. Використовуваний в даному документі термін "гідрат", якщо не вказано інше, означає сполуку за винаходом або її сіль, що додатково включає в стехіометричній або нестехіометричній кількості воду, пов'язану нековалентними міжмолекулярними силами. Гідрати можуть бути кристалічними або некристалічними. Використовуваний в даному документі термін "сольват", якщо не вказано інше, означає сольват, утворений в результаті зв'язування однієї або більше молекул розчинника із сполукою 3 UA 110965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 за винаходом. Термін "сольват" включає гідрати (наприклад, моногідрат, дигідрат, тригідрат, тетрагідрат і тому подібні). Сольвати можуть бути кристалічними або некристалічними. Використовуваний в даному документі термін "стереоізомер", якщо не вказано інше, охоплює всі енантіомерно/стереомерно чисті і енантіомерно/стереомерно збагачені сполуки за винаходом. Використовуваний в даному документі термін "стереомерно чистий" або "енантіомерно чистий", якщо не вказано інше, означає, що сполуки містить один стереоізомер і практично не містить його стереомер або енантіомер з протилежною конфігурацією. Наприклад, сполуки є стереомерно або енантіомерно чистим, якщо сполука містить 80 %, 90 % або 95 % або більше одного стереоізомера і 20 %, 10 % або 5 % або менше стереоізомера з протилежною конфігурацією. У деяких випадках сполука за винаходом вважається оптично активною або стереомерно/енантіомерно чистою (тобто, практично в R-формі або практично в S-формі) відносно хірального центра, коли сполука являє собою приблизно 80 % ЕІ (енантіомерний надлишок) або більше, переважно, дорівнює або більше ніж 90 % ЕІ відносно конкретного хірального центра, і більш переважно, 95 % ЕІ відносно конкретного хірального центра. Використовуваний в даному документі термін "стереомерно збагачений" або "енантіомерно збагачений", якщо не вказано інше, охоплює рацемічні суміші, а також інші суміші стереоізомерів сполук за винаходом (наприклад, R/S=30/70, 35/65, 40/60, 45/55, 55/45, 60/40, 65/35 і 70/30). Терміни "спільне введення" і "в поєднанні з" означають введення двох або більше терапевтичних засобів (наприклад, сполуки I або композиції за винаходом і іншого модулятора активності лімфоцитів, в тому числі активності В-клітин і/або Т-клітин, або іншого активного засобу) або спільно, одночасно, або послідовно без яких-небудь конкретних термінів. У одному варіанті здійснення сполука I і щонайменше один інший засіб присутні в клітині або в організмі суб'єкта в один і той же час або виявляють свій біологічний або терапевтичний ефект в один і той же час. У одному варіанті здійснення терапевтичний засіб(засоби) присутні в одній і тій же композиції або стандартній лікарській формі. У іншому варіанті здійснення терапевтичний засіб(засоби) присутні в різних композиціях або стандартних лікарських формах. "В-клітина" являє собою лімфоцит, який дозріває в кістковому мозку, і включає "ненавчену" В-клітину, В-клітину пам'яті або ефекторну В-клітину (плазматичні клітини). У даному документі В-клітина може бути нормальною або незлоякісною В-клітиною. "Т-клітина" являє собою лімфоцит, який дозріває в тимусі, і включає хелперну Т-клітину, Тклітину пам'яті і цитотоксичну Т-клітину. Використовуваний в даному документі термін "загальна виживаність" означає час з моменту рандомізації до загибелі по будь-якій причині, і вимірюється в популяції всіх включених в дослідження пацієнтів, що прийняли хоча б одну дозу препарату. Загальну виживаність можна оцінювати в рандомізованих контрольованих дослідженнях. Використовуваний в даному документі термін "частота об'єктивної відповіді" означає пропорцію пацієнтів із зменшеними попередньо визначеними симптомами склеродермії в кінці заданого періоду часу. Тривалість відповіді звичайно вимірюється з моменту початкової відповіді до того моменту, коли було відмічено прогресування склеродермії. Використовуваний в даному документі термін "час до прогресування" означає час з моменту рандомізації до об'єктивного прогресування склеродермії. У деяких варіантах здійснення час до прогресування не включає смерті. Використовуваний в даному документі термін "виживаність без прогресування" означає час з моменту рандомізації до об'єктивного прогресування склеродермії або смерті. Використовуваний в даному документі термін "час до констатації відсутності ефекту терапії" означає час визначення будь-якого клінічного виходу(ів) з моменту рандомізації до моменту припинення лікування по будь-якій причині, включаючи прогресування захворювання, токсичність лікувального препарату і смерть. Використовуваний в даному документі термін "смертність" означає кількість смертних випадків в даній популяції. Використовуваний в даному документі термін "смертність від респіраторних захворювань" означає кількість пацієнтів, які вмерли від гострої гіпоксії або іншого конкретного погіршення дихальної функції, що приводить до смерті, наприклад, виникнення потреби в штучній вентиляції легенів, результатом чого є смерть, зупинки дихання, або будь-якого іншого стану у суб'єкта, що за своєю природою вважається респіраторним. Використовуваний в даному документі термін "респіраторна госпіталізація" означає випадки госпіталізації в результаті погіршення легеневого статусу, про що свідчать записи при госпіталізації пацієнта або інші медичні висновки. 4 UA 110965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Використовуваний в даному документі термін "модифікована оцінка стану шкіри по Роднану (Rodnan)" означає валідовану числову систему оцінки в балах дермального потовщення шкіри. Використовуваний в даному документі термін "потовщення шкіри" означає жорсткість або ущільнення шкіри, які можна оцінювати за допомогою різних методів, в тому числі з використанням дюрометра і mRSS. Використовуваний в даному документі термін "ущільнення шкіри" стосується шкіри, що стала жорсткою, почервонілою, запаленою, потовщеною або чутливою. Використовуваний в даному документі термін "дерматологічний індекс якості життя" означає оцінку якості життя з точки зору шкірних симптомів для пацієнта, страждаючого на склеродермію. Використовуваний в даному документі термін "легенева функція" означає будь-яке вимірювання потоку форсованого видиху, форсованої життєвої місткості, FEV 25-75 %, об'єму або життєвої місткості легенів. Використовуваний в даному документі термін "дифузійна здатність для окису вуглецю" означає оцінку поглинання окису вуглецю через альвеолярно-капілярну мембрану. Це може служити заміною для вимірювання здатності легенів перенести кисень з легенів в кров. Використовуваний в даному документі термін "індекс задишки по Малеру (Mahler)" означає інструмент, що дозволяє проводити клінічні вимірювання задишки. Використовуваний в даному документі термін "бальна система анкети лікарні святого Георгія при патології органів дихання" означає інструмент, що дозволяє вимірювати якість життя у пацієнтів з хворобою легенів. Використовуваний в даному документі термін "оцінка стану шлунково-кишкового тракту згідно з консорціумом по клінічних випробуваннях склеродермії на базі Каліфорнійського університету ("UCLA scleroderma clinical trial consortium gastrointestinal tract score")" означає анкету, яку повинні заповнити пацієнти зі склеродермією для оцінки шлунково-кишкових симптомів, пов'язаних зі склеродермією (системним склерозом). Використовуваний в даному документі термін "потік-опосередкована дилатація" означає будь-яке вимірювання функції судинного ендотелію у пацієнта, страждаючого на склеродермію. Використовуваний в даному документі термін "тест шестихвилинної ходьби" означає будьяку оцінку відстані, яку пацієнт, що страждає на склеродермію, може пройти за 6 хвилин, або будь-яку стандартизовану процедуру для оцінки здатності ходити протягом фіксованого періоду часу або на фіксовану відстань. При використанні в даному документі помалідомід означає наступну сполуку: 7.1 Сполука I У деяких варіантах здійснення сполука I для застосування в способах за винаходом, включаючи комбіновану терапію, і в композиціях за винаходом являє собою сполуку формули: сполука I, або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідрати, стереоізомер, таутомер, рацемічну суміш, спів-кристал, клатрат або поліморф. У одному варіанті здійснення сполука являє собою 3-(5-аміно-2-метил-4-оксохіназолін-3(4H)іл)піперидин-2,6-діон. Сполуку I або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер, рацемічну суміш, спів-кристал, клатрат або поліморф можна отримувати способами, відомими фахівцям в даній галузі, наприклад, методом, описаним в патенті США 7635700 і попередній патентній заявці США № 61/451806. У деяких варіантах здійснення сполука формули I є твердою. У деяких варіантах здійснення сполука формули I є гідратованою. У деяких варіантах здійснення сполука формули I є сольватованою. У деяких варіантах здійснення сполука формули I є безводною. У деяких варіантах здійснення сполука формули I є негігроскопічною. 5 UA 110965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення тверда сполука формули I є аморфною. У деяких варіантах здійснення тверда сполука формули I є кристалічною. У деяких варіантах здійснення тверда сполука формули I знаходиться в кристалічній формі, описаній в попередній патентній заявці США № 61/451806, поданій 11 березня 2011 р., повний зміст якої включений в даний документ за допомогою посилання. Тверді форми сполуки формули I можна отримувати способами, описаними в попередній патентній заявці США № 61/451806. Тверді форми також можна отримувати іншими методами, відомими фахівцям в даній галузі. У деяких варіантах здійснення сполука формули I являє собою гідрохлоридну сіль 3-(5аміно-2-метил-4-оксо-4H-хіназолін-3-іл)піперидин-2,6-діону, або його енантіомера або суміші енантіомерів; або його фармацевтично прийнятного сольвату, гідрату, спів-кристала, клатрату або поліморфа. У деяких варіантах здійснення гідрохлоридна сіль є твердою. У деяких варіантах здійснення гідрохлоридна сіль є безводною. У деяких варіантах здійснення гідрохлоридна сіль є негігроскопічною. У деяких варіантах здійснення гідрохлоридна сіль є аморфною. У деяких варіантах здійснення гідрохлоридна сіль є кристалічною. У деяких варіантах здійснення гідрохлоридна сіль знаходиться в кристалічній формі А. Гідрохлоридну сіль сполуки формули I і її тверді форми можна отримувати способами, описаними в попередній патентній заявці США № 61/451806. Гідрохлоридну сіль і її тверді форми можна також отримувати іншими методами, відомими фахівцям в даній галузі. Сполука формули I за винаходом містить один хіральний центр і може існувати у вигляді суміші енантіомерів, наприклад, рацемічної суміші. Даний опис охоплює застосування стереомерно чистих форм такої сполуки, а також застосування сумішей таких форм. Наприклад, в способах і композиціях, розкритих в даному документі, можна використовувати суміші, що містять рівні або нерівні кількості енантіомерів сполуки формули I за винаходом. Ці ізомери можуть бути синтезовані асиметрично або розділені з використанням стандартних методів, таких як хіральні колонки або хіральні розділювальні речовини. Див., наприклад, Jacques, J., et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley-Interscience, New York, 1981); Wilen, S. H., et al., Tetrahedron 33: 2725 (1977); Eliel, E. L., Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962) і Wilen, S. H., Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions р. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN, 1972). Потрібно зазначити, що якщо існує розходження між зображеною структурою і назвою, даною цій структурі, більш важливою є зображена структура. Крім того, якщо стереохімія структури або частини структури не вказана, наприклад, напівжирною або пунктирною лінією, структуру або частину структури потрібно інтерпретувати як таку, що охоплює всі стереоізомери структури. 7.2 Способи лікування Даний винахід стосується способів лікування, запобігання і/або контролювання захворювань, розладів і/або станів, пов'язаних з імунними і запальними захворюваннями, що включає введення терапевтично ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту, який потребує цього. У деяких варіантах здійснення захворювання вибирають з вовчака, склеродермії, синдрому Шегрена, ANCA-індукованого васкуліту, антифосфоліпідного синдрому і міастенії. У деяких варіантах здійснення, захворювання являє собою вовчак або склеродермію. Чутливість до сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомеру, таутомеру або рацемічних сумішей можна вивчати в різних тестах in vivo і in vitro, включаючи відомі фахівцям в даній галузі тваринні моделі для імунних і запальних захворювань, включаючи, але не обмежуючись ними, модель системного червоного вовчака на мишах MRL/MpJ-Faslpr/J, модель системного червоного вовчака на мишах NZBWF1/J, модель індукованого блеоміцином шкірного фіброзу і мишачу модель системної склеродермії на мишах з товстою шкірою-1 (Tsk-1). 7.2.1 Лікування склеродермії У деяких варіантах здійснення даного винаходу запропоновані способи лікування, запобігання і/або контролювання склеродермії або її симптомів, що включають введення терапевтично ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту, який страждає на склеродермію. У деяких варіантах здійснення даного винаходу запропоновані способи запобігання склеродермії або її симптомам, які включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту з ризиком розвитку склеродермії. 6 UA 110965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення склеродермія являє собою локалізовану, системну, обмежену або дифузну склеродермію. У деяких варіантах здійснення системна склеродермія включає синдром CREST (кальциноз, синдром Рейно, дисфункція або порушення моторики стравоходу, склеродактилія, телеангіектазія). Склеродермія також відома як системний склероз або прогресуючий системний склероз. У деяких варіантах здійснення винаходу запропоновані способи лікування або запобігання хворобі або синдрому Рейно. У деяких варіантах здійснення системний склероз включає ураження легенів в результаті склеродермії, нирковий криз в результаті склеродермії, серцеві вияви, м'язову слабкість (включаючи втому або обмежену CREST), порушення моторики і спазм шлунково-кишкового тракту, а також відхилення в центральній, периферичній і вегетативній нервовій системі (включаючи тунельний синдром зап'ястка з подальшою невралгією трійчастого нерва). Він також включає загальну втрату працездатності, в тому числі депресію і погіршення якості життя. У деяких варіантах здійснення обмежена склеродермія обмежена виявами на руках, обличчі, шиї або їх поєднанні. У деяких варіантах здійснення дифузна склеродермія включає ущільнення шкіри і також спостерігається на ділянках вище зап'ястка (або ліктів). У деяких варіантах здійснення дифузний системний склероз являє собою склеродермію без склеродермії і включає фіброз внутрішніх органів, але без потовщення шкіри; або сімейний прогресуючий системний склероз. У одному варіанті здійснення склеродермія не пов'язана з виснаженням, таким як виснаження, викликане хворобою. У одному варіанті здійснення запропоновані способи зменшення, пригнічення або запобігання одному або більше з наступних симптомів склеродермії: (i) поступовому затвердженню, потовщенню і ущільненню шкіри (наприклад, на кінцівках, наприклад, на руках, обличчі і ногах); (ii) зміні кольору шкіри; (III), онімінню кінцівок; (iv) блискучій шкірі; (v) невеликим білим вузликам під поверхнею шкіри, при розриві яких витікає біла як крейда рідина; (vi) дисфункції стравоходу Рейно (біль, оніміння і/або зміна кольору в руках, викликана спазмом судин під впливом холоду або емоційного стресу); (vii) телеангіектазії (червоні плями, наприклад, на руках, долонях, передпліччях, обличчі і губах); (viii) болю і/або ригідності в суглобах; (ix) набряку рук і ніг; (х) шкірного свербежу; (xi) здерев'янінню і скручуванню пальців; (xii) виразкам на зовнішній стороні деяких суглобів, таких як міжфалангові суглоби пальців і лікті; (xiii) проблемам з травленням, таким як печія, труднощі при ковтанні, діарея, подразнений кишечник і запор; (xiv) втомі і слабкості; (xv) задишці; (xvi) артриту; (xvii) випаданню волосся; (xviii) проблемам з внутрішніми органами; (xix) виразкам на пальцях або (xx) аутоампутації пальців, що включають введення ефективної кількості сполуки I пацієнту, який потребує цього. Без зв'язку з якою-небудь конкретною теорією, вважається, що сполука I або її фармацевтично прийнятна сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші посилює Th1 імунну відповідь і пригнічує Th2 імунну відповідь, що може приводити до антифіброзних ефектів на шкірі. Крім того, за винаходом запропоновані способи для поліпшення стану або зменшення товщини шкіри у пацієнта, який страждає на склеродермію, що включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту. У одному варіанті здійснення товщина шкіри зменшується на приблизно 20 %, приблизно 25 %, приблизно 30 %, приблизно 40 %, приблизно 50 %, приблизно 60 %, приблизно 70 %, приблизно 80 %, приблизно 90 % або більше. Крім того, за винаходом запропоновані способи досягнення одного або більше клінічних результатів, які мають відношення до склеродермії, що включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту, що потребує цього. Крім того, за винаходом запропоновані способи збільшення загальної виживаності, частоти об'єктивної відповіді, часу до прогресування, виживаності без прогресування і/або часу до констатації відсутності ефекту терапії у пацієнта, який страждає на склеродермію, що включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту. Крім того, за винаходом запропоновані способи для зниження смертності, смертності від респіраторних захворювань і/або респіраторної госпіталізації пацієнта, який страждає на склеродермію, що включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту. Крім того, за винаходом запропоновані способи для поліпшення показників модифікованої оцінки стану шкіри по Роднану у пацієнта, який страждає на склеродермію, що включають 7 UA 110965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту. У одному варіанті здійснення поліпшення показників модифікованої оцінки стану шкіри по Роднану становить 5, 10, 15 або 20 балів або більше. Крім того, за винаходом запропоновані способи для поліпшення стану або зменшення товщини шкіри у пацієнта, який страждає на склеродермію, що включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту. У одному варіанті здійснення товщина шкіри зменшується на приблизно 20 %, приблизно 25 %, приблизно 30 %, приблизно 40 %, приблизно 50 %, приблизно 60 %, приблизно 70 %, приблизно 80 %, приблизно 90 % або більше. Крім того, за винаходом запропоновані способи для поліпшення стану або зменшення ущільнення шкіри у пацієнта, який страждає на склеродермію, що включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту. Крім того, за винаходом запропоновані способи для поліпшення дерматологічного індексу якості життя пацієнта, який страждає на склеродермію, що включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту. Крім того, за винаходом запропоновані способи для поліпшення функції легенів у пацієнта, який страждає на склеродермію, що включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту. Крім того, за винаходом запропоновані способи поліпшення дифузійної здатності для окису вуглецю у пацієнта, який страждає на склеродермію, що включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту. У одному варіанті здійснення дифузійна здатність для окису вуглецю у пацієнта поліпшується за рахунок поліпшення дифузійної здатності легенів для окису вуглецю (DLCO) на приблизно 10 %, приблизно 20 %, приблизно 25 %, приблизно 30 %, приблизно 40 %, приблизно 50 %, приблизно 60 %, приблизно 70 %, приблизно 80 %, приблизно 90 % або більше. Крім того, за винаходом запропоновані способи поліпшення індексу задишки по Малеру у пацієнта, який страждає на склеродермію, що включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту. У одному варіанті здійснення поліпшення індексу задишки по Малеру становить 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10 балів або більше. Крім того, за винаходом запропоновані способи поліпшення показника в балах анкети лікарні святого Георгія при патології органів дихання у пацієнта, який страждає на склеродермію, що включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту. У одному варіанті здійснення поліпшення показника в балах анкети лікарні святого Георгія при патології органів дихання становить 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52 балів або більше. Крім того, за винаходом запропоновані способи поліпшення показників оцінки стану шлунково-кишкового тракту згідно з консорціумом по клінічних дослідженнях склеродермії на базі Каліфорнійського університету у пацієнта, який страждає на склеродермію, що включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту. Крім того, за винаходом запропоновані способи лікування або запобігання виразкам на пальцях у пацієнта або групи пацієнтів зі склеродермією, що включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту. Крім того, за винаходом запропоновані способи поліпшення потік-опосередкованої дилатації у пацієнта, який страждає на склеродермію, що включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту. Крім того, за винаходом запропоновані способи поліпшення або збільшення відстані в тесті шестихвилинної ходьби для пацієнта, який страждає на склеродермію, що включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту. У одному варіанті здійснення 8 UA 110965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 збільшення відстані в тесті шестихвилинної ходьби становить приблизно 200 метрів, приблизно 250 метрів, приблизно 300 метрів, приблизно 350 метрів, приблизно 400 метрів або більше. 7.2.2 Лікування червоного вовчака У деяких варіантах здійснення винаходу запропоновані способи лікування, запобігання і/або контролювання червоного вовчака або його симптомів, що включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту, страждаючому на червоний вовчак. У одному варіанті здійснення винаходу запропоновані способи запобігання червоному вовчаку або його симптомам, які включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту з ризиком розвитку червоного вовчака. У деяких варіантах здійснення винаходу запропоновані способи лікування, запобігання і/або контролювання системного червоного вовчака (СЧВ), шкірного червоного вовчака (ШЧВ) і медикаментозного вовчака. Термін "системний червоний вовчак" використовується в даному документі взаємозамінно з термінами "СЧВ" і "вовчак" і стосується всіх виявів захворювання, відомих в даній галузі (включаючи ремісії і раптове загострення хвороби). При СЧВ ключову роль грає аномальна гіперактивність В-лімфоцитів і масоване аномальне виробництво аутоантитіл імуноглобуліну гамма (IgG). Цей патологічний процес приводить до секвестрації і руйнування покритих Ig клітин, фіксації і розщеплення білків комплементу, і викиду хемотаксинів, вазоактивних пептидів і руйнівних ферментів в тканині (Hahn B. H. Systemic Lupus Erythematosus. В: Harrison's Principles of Internal Medicine (16-е видання), під редакцією Kasper D. L., Braunwald Е., Fauci A. S., Hauser S. L., Longo D. L., Jameson, J. L., New York (US): McGraw-Hill; 2005. pp. 1960-1967). Симптоми СЧВ варіюються від людини до людини, і можуть з'являтися і зникати. У більшості пацієнтів симптоми включають біль і набряк в суглобах. Часто вражаються суглоби пальців, рук, зап'ястки і коліна. У деяких хворих розвивається артрит. Інші загальні симптоми включають: біль в грудях при глибокому зітханні, втома, лихоманка без видимих причин, загальний дискомфорт, неспокій або відчуття нездоров'я (нездужання), випадання волосся, виразки в порожнині рота, збільшення лімфатичних вузлів, підвищену чутливість до сонячного світла, висип на шкірі висип на щоках і переніссі у вигляді "метелика" спостерігається у приблизно половини людей, страждаючих на СЧВ, у деяких пацієнтів висип гіршає під впливом сонячного світла, і, крім того, висип може розповсюджуватися. Інші симптоми залежать від того, яка частина тіла уражена, і можуть включати наступне: Головний мозок і нервова система: головний біль, оніміння, поколювання, судоми, проблеми зі зором, зміни особистості, Травний тракт: біль в животі, нудота і блювання, Серце: аномальні серцеві ритми (аритмії), Легкі: кашель з кров'ю і утруднене дихання, і Шкіра: неоднорідний колір шкіри, зміна кольору пальців на холоді (синдром Рейно). У деяких пацієнтів є тільки шкірні симптоми. Це називається дискоїдний вовчак. У одному варіанті здійснення винаходу запропоновані способи лікування помірного, тяжкого або дуже тяжкого СЧВ. Використовуваний в даному документі термін "тяжкий СЧВ" означає стан СЧВ, при якому пацієнт має один або більше тяжких або небезпечних для життя симптомів (таких як гемолітична анемія, значне ураження серця або легенів, захворювання нирок або ураження центральної нервової системи). Крім того, за винаходом запропоновані способи досягнення одного або більше клінічних результатів, що стосуються СЧВ, які включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту, що потребує цього. Крім того, за винаходом запропоновані способи збільшення загальної виживаності, частоти об'єктивної відповіді, часу до прогресування, виживаності без прогресування і/або часу до констатації відсутності ефекту терапії у пацієнта, страждаючого на СЧВ, що включають введення ефективної кількості сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей пацієнту. У деяких варіантах здійснення сполуки I, або її фармацевтично прийнятна сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші, діє як інгібітор диференціації первинних людських CD19+ В-клітин пам'яті до стадії плазмабластів. Без зв'язку з якою-небудь конкретною теорією, вважається, що сполука I, або її фармацевтично прийнятна сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші, блокує клітини на стадії недостатнього дозрівання, тим самим зменшуючи кількість плазмабластів, які здатні продукувати високі рівні 9 UA 110965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 імуноглобуліну. Функціональним наслідком даного ефекту є знижена продукція імуноглобуліну G (IgG) і імуноглобуліну M (IgM) в цих диференційованих культурах. У деяких варіантах здійснення сполука I або її фармацевтично прийнятна сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші, інгібує здатність первинних людських CD19+ В-клітин пам'яті диференціюватися до стадії плазмабластів. У деяких варіантах здійснення сполука I або її фармацевтично прийнятна сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші, не надає істотного ефекту на зрілі CD138+ плазматичні клітини в молодих культурах. У деяких варіантах здійснення сполука I, або її фармацевтично прийнятна сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші, інгібує фактори диференціації В-клітин, включаючи регуляторний фактор інтерферонів 4 (IRF4), індукований лімфоцитами білок дозрівання (BLIMP), X-бокс-білок-1 (XBP-1) і білок 6 В-клітинної лімфоми (Bcl6). 7.2.3 Лікування інших імунних захворювань або розладів Крім того, за винаходом запропоновані способи лікування, менеджменту або запобігання іншим імунним захворюванням або станам з використанням сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей. У деяких варіантах здійснення винаходу, наприклад, запропонований спосіб лікування індивідуума, що страждає на захворювання або розлад, у випадках, коли захворювання або розлад викликане, або пов'язане з, неадекватною або небажаною імунною відповіддю, наприклад, захворювання, розлад або стан, який можна лікувати за допомогою імуносупресії, шляхом введення індивідууму сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей. У різних конкретних варіантах здійснення вказане імунне захворювання являє собою одне або більше захворювань, вибраних із синдрому Шегрена, ANCA-індукованого васкуліту, антифосфоліпідного синдрому, міастенії, хвороби Аддісона, осередкової алопеції, анкілозуючого спондиліту, синдрому антифосфоліпідних антитіл, антифосфоліпідного синдрому (первинного або вторинного), астми, аутоімунного гастриту, аутоімунної гемолітичної анемії, аутоімунного гепатиту, аутоімунного захворювання внутрішнього вуха, аутоімунного лімфопроліферативного захворювання, аутоімунної тромбоцитопенічної пурпури, хвороби Бало, хвороби Бехчета, бульозного пемфігоїду, кардіоміопатії, целіакії, хвороби Шагаса, хронічної запальної демієлінізуючої полінейропатії, рубцевого пемфігоїду (наприклад, пемфігоїду слизових оболонок), синдрому холодової аглютинації, хвороби Дегоса, герпесоподібного дерматиту, спадкової змішаної кріоглобулінемії, синдрому Гудпасчера, хвороби Грейвса, синдрому Гійєна-Барре, тиреоїдиту Хашимото (хвороби Хашимото; аутоімунного тиреоїдиту), ідіопатичного легеневого фіброзу, ідіопатичної тромбоцитопенічної пурпури, IgA-нефропатії, ювенільного артриту, червоного плоского лишаю, хвороби Меньєра, змішаного захворювання сполучної тканини, кільцеподібної склеродермії, нарколепсії, нейроміотонії, педіатричних аутоімунних нервово-психічних розладів (PANDAs), звичайної пухирчатки, злоякісної анемії, вузликового поліартриту, поліхондриту, ревматичної поліміалгії, первинної агамаглобулінемії, первинного біліарного цирозу, хвороби Рейно (синдрому Рейно), синдрому Рейтера, рецидивуючого поліхондриту, ревматизму, синдрому Шегрена, синдрому м'язової скутості (синдрому Мерша-Вольтмена), артериїту Такаясу, скроневого артериїту (гігантоклітинного артериїту), увеїту, васкуліту (наприклад, васкуліту, не пов'язаного з червоним вовчаком), вітиліго і/або гранулематозу Вегенера. 7.3 Дозування і дозовані кількості Доза сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей, яку потрібно вводити пацієнту, досить широко варіюється і може залежати від думки медичного працівника. Дози сполуки I або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей варіюються залежно від таких факторів, як: конкретний стан, який треба лікувати, запобігати або контролювати; вік і стан здоров'я пацієнта і кількість другої активної речовини, якщо така є. Як правило, сполуку I або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші можна вводити пацієнту від одного до чотирьох або більше разів на добу в дозі від приблизно 0,005 мг/кг маси тіла пацієнта до приблизно 10 мг/кг маси тіла пацієнта, однак вищезгадане дозування можна відповідним чином змінювати залежно від віку, маси тіла і стану здоров'я пацієнта, а також способу введення. У одному варіанті здійснення доза складає від приблизно 0,01 мг/кг маси тіла пацієнта до приблизно 5 мг/кг маси тіла пацієнта, від приблизно 0,05 мг/кг маси тіла пацієнта до приблизно 1 мг/кг маси тіла пацієнта, від приблизно 0,1 мг/кг маси тіла пацієнта до приблизно 0,75 мг/кг маси тіла пацієнта, або від приблизно 0,25 мг/кг маси тіла пацієнта до приблизно 0,5 мг/кг маси тіла пацієнта. 10 UA 110965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У одному варіанті здійснення вводять одну дозу на добу. У будь-якому випадку, кількість сполуки І, що вводиться, або її фармацевтично прийнятної солі, сольвату, гідрату, стереоізомера, таутомера або рацемічних сумішей буде залежати від таких факторів, як розчинність активного компонента, використовуваний препарат і спосіб введення. У одному варіанті здійснення застосування концентрації місцевої форми забезпечує внутрішньоклітинний вплив концентрацій приблизно 0,01-10 мкМ. У деяких варіантах здійснення сполуку I або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідраті, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші використовують в кількості від приблизно 0,1 мг до приблизно 1000 мг на добу, і її можна регулювати звичайним чином (наприклад, однакову кількість вводять кожний день періоду лікування, профілактики або контролювання), циклами (наприклад, один тиждень вводять, інший пропускають) або в кількості, яка збільшується або зменшується протягом курсу лікування, профілактики або контролювання. У інших варіантах здійснення доза може складати від приблизно 1 мг до приблизно 300 мг, від приблизно 0,1 мг до приблизно 150 мг, від приблизно 1 мг до приблизно 200 мг, від приблизно 10 мг до приблизно 100 мг, від приблизно 0,1 мг до приблизно 50 мг, від приблизно 1 мг до приблизно 50 мг, від приблизно 10 мг до приблизно 50 мг, від приблизно 20 мг до приблизно 30 мг або від приблизно 1 мг до приблизно 20 мг. 7.4 Комбінована терапія У способах і композиціях за даним винаходом сполуку I або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші можна комбінувати з іншими фармацевтично активними сполуками ("другими активними речовинами"). Визначені поєднання можуть працювати синергічно при лікуванні конкретних типів захворювань або розладів, а також станів і симптомів, пов'язаних з такими захворюваннями або розладами. Сполука I або її фармацевтично прийнятна сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші, може також діяти, зменшуючи побічні ефекти, пов'язані з певними другими активними речовинами, і навпаки. У способах і композиціях за винаходом можна використовувати один або більше других активних інгредієнтів або речовин. Другі активні речовини можуть бути великими молекулами (наприклад, білками) або малими молекулами (наприклад, синтетичними неорганічними, металоорганічними або органічними молекулами). У іншому варіанті здійснення спосіб лікування за винаходом включає введення другого терапевтичного засобу, при цьому другий терапевтичний засіб являє собою протизапальний препарат, наприклад, стероїдний протизапальний препарат або нестероїдний протизапальний препарат (NSAID), ацетамінофен, напроксен, ібупрофен, ацетилсаліцилову кислоту і тому подібне. У більш конкретному варіанті здійснення, в якому вводять NSAID, можна також вводити інгібітор протонного насоса (PPI), наприклад, омепразол. У одному варіанті здійснення протизапальний засіб являє собою кортикостероїд. У іншому варіанті здійснення протизапальний засіб являє собою колхіцин. У іншому варіанті здійснення другий терапевтичний засіб являє собою імуномодулючу сполуку або імунодепресант, такий як азатіоприн (Imuran™, Azasan™), метотрексат (Rheumatrex™, Trexall™), пеніциламін (Depen™, Cuprimine™), циклофосфамід (Cytoxan™), ® мікофенолат (CellCept™, Myfortic™), босентан (Tracleer ), преднізон (Deltasone™, Liquid Pred™) і інгібітор PDE5. У іншому варіанті здійснення, коли хворіюча людина має виразки на пальцях і легеневу гіпертензію, можна вводити судинорозширювальний засіб, такий як простациклін (ілопрост). У іншому варіанті здійснення другий терапевтичний засіб являє собою інгібітор рецепторів ActRII або інгібітор активін-ActRII. Інгібітори рецепторів ActRII включають інгібітори ActRIIA і інгібітори ActRIIB. Інгібітори рецепторів ActRII можуть являти собою поліпептиди, що містять активін-зв'язувальні домени ActRII. У деяких варіантах здійснення поліпептиди, що містять активін-зв'язувальні домени, пов'язані з Fc-частиною антитіла (тобто, отримують кон'югат, який містить поліпептид, що містить активін-зв'язувальний домен рецептора ActRII, і Fc-частину антитіла). У деяких варіантах здійснення активін-зв'язувальний домен пов'язаний з Fc-частиною антитіла через лінкер, наприклад, пептидний лінкер. Типовий поліпептид активін-зв'язувального ActRIIA, злитий з людським Fc-доменом, приведений в SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 1 11 UA 110965 C2 Типовий злитий білок, що містить розчинний позаклітинний домен ActRIIB, злитий з Fcдоменом, приведений в SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 2 5 10 15 20 25 30 35 40 Додаткові приклади відмінних від антитіл білків, вибраних для зв'язування активіну або ActRIIA, а також способи їх конструювання і вибору приведені в WO/2002/088171, WO/2006/055689, WO/2002/032925, WO/2005/037989, US 2003/0133939 і US 2005/0238646, повний зміст кожного з яких включений в даний документ за допомогою посилання. Можна вводити будь-яке поєднання вищезгаданих терапевтичних засобів, прийнятних для лікування захворювань або їх симптомів. Такі терапевтичні засоби можна вводити в будь-якому поєднанні із сполукою I або її фармацевтично прийнятною сіллю, сольватом, гідратом, стереоізомером, таутомером або рацемічними сумішами, одночасно або у вигляді окремого курсу лікування. 7.5 Циклічна терапія У деяких варіантах здійснення сполуку I або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, таутомер або рацемічні суміші за винаходом циклічно вводять пацієнту. Циклічна терапія включає введення активної речовини протягом певного періоду часу з подальшим відпочинком (тобто, припиненням введення) протягом певного періоду часу, і повторення такої послідовності введення. Циклічна терапія може знижувати розвиток стійкості до одного або декількох терапевтичних засобів, допомагати уникати або зменшувати побічні ефекти одного з терапевтичних засобів і/або підвищувати ефективність лікування. Отже, в одному варіанті здійснення сполуку за винаходом вводять щодня в одній або декількох дозах в чотири-шеститижневому циклі з періодом відпочинку протягом приблизно тижня або двох тижнів. Циклічна терапія також дозволяє збільшити частоту, кількість і протяжність циклів дозування. Таким чином, інший варіант здійснення включає введення сполуки за винаходом протягом більшої кількості циклів, ніж це звичайно відбувається, коли її вводять самостійно. У ще одному варіанті здійснення сполуку за винаходом вводять протягом більшої кількості циклів, ніж та, яка викликала б обмежуючу дозу токсичності для пацієнта, якому додатково не вводять другий активний інгредієнт. У одному варіанті здійснення сполуку за винаходом вводять щодня і безперервно протягом трьох або чотирьох тижнів в дозі від приблизно 0,1 мг до приблизно 500 мг на добу, з подальшим відпочинком протягом одного або двох тижнів. У інших варіантах здійснення доза може складати від приблизно 1 мг до приблизно 300 мг, від приблизно 0,1 мг до приблизно 150 мг, від приблизно 1 мг до приблизно 200 мг, від приблизно 10 мг до приблизно 100 мг, від приблизно 0,1 мг до приблизно 50 мг, від приблизно 1 мг до приблизно 50 мг, від приблизно 10 мг до приблизно 50 мг, від приблизно 20 мг до приблизно 30 мг або від приблизно 1 мг до приблизно 20 мг, з подальшим відпочинком. У одному варіанті здійснення сполуку за винаходом і другий активний інгредієнт вводять перорально, при цьому сполуку за винаходом вводять за 30-60 хвилин до введення другого активного інгредієнта, протягом циклу, що продовжується від чотирьох до шести тижнів. У 12 UA 110965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 іншому варіанті здійснення поєднання сполуки за винаходом і другого активного інгредієнта вводять внутрішньовенною інфузією протягом приблизно 90 хвилин кожного циклу. Як правило, кількість циклів, протягом яких пацієнту вводять комбіновані терапевтичні засоби, буде складати від приблизно одного до приблизно 24 циклів, від приблизно двох до приблизно 16 циклів або від приблизно чотирьох до приблизно трьох циклів. 7.6 Фармацевтичні композиції і лікарські форми Фармацевтичні композиції можна використовувати для отримання окремих одиничних лікарських форм. Фармацевтичні композиції і лікарські форми за винаходом містять сполуку за винаходом або її фармацевтично прийнятну сіль, сольват, гідрат, стереоізомер, рацемат, клатрат або проліки. Фармацевтичні композиції і лікарські форми можуть додатково містити один або більше ексципієнтів. Фармацевтичні композиції і лікарські форми за винаходом можуть також містити один або більше додаткових активних інгредієнтів. Приклади необов'язкових других або додаткових активних інгредієнтів приведені вище. Одиничні лікарські форми за винаходом підходять для перорального введення, введення на слизову оболонку (наприклад, назального, сублінгвального, вагінального, букального або ректального), парентерального (наприклад, підшкірного, внутрішньовенного, болюсної ін'єкції, внутрішньом'язового або внутрішньоартеріального), місцевого (наприклад, очні краплі або інші офтальмологічні препарати), трансдермального або черезшкірного введення пацієнту. Приклади лікарських форм включають, але не обмежуються ними: таблетки; каплети; капсули, такі як м'які еластичні желатинові капсули; крохмальні капсули; пастилки; таблетки для розсмоктування; дисперсії; супозиторії; порошки; аерозолі (наприклад, назальні спреї або інгалятори); гелі; рідкі лікарські форми, прийнятні для перорального введення або введення на слизову оболонку пацієнту, включаючи суспензії (наприклад, водні або неводні рідкі суспензії, емульсії масло-в-воді або рідкі суспензії вода-в-маслі), розчини і еліксири; рідкі лікарські форми, прийнятні для парентерального введення пацієнту; очні краплі або інші офтальмологічні препарати, прийнятні для місцевого застосування, і стерильні тверді речовини (наприклад, кристалічні або аморфні тверді речовини), які можна відновлювати для отримання рідких лікарських форм, прийнятних для парентерального введення пацієнту. Склад, форма і тип лікарських форм, як правило, варіюється залежно від їх використання. Наприклад, лікарська форма, що використовується для невідкладного лікування захворювання, може містити більші кількості одного або більше активних інгредієнтів, ніж лікарська форма, що використовується для хронічного лікування того ж захворювання. Аналогічно, парентеральна лікарська форма може містити менші кількості одного або більше активних інгредієнтів, ніж пероральна лікарська форма, що використовується для лікування того ж захворювання. Існують і інші параметри, по яких конкретні лікарські форми, що використовуються, будуть відрізнятися одна від одної, вони будуть очевидні для фахівців в даній галузі. Див., наприклад, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20-е видання, Mack Publishing, Easton PA (2000). У одному варіанті здійснення фармацевтичні композиції і лікарські форми містять один або більше ексципієнтів. Прийнятні ексципієнти добре відомі фахівцям в галузі фармацевтики, і необмежувальні приклади прийнятних ексципієнтів приведені в даному описі. Чи підходить конкретний ексципієнт для включення до складу фармацевтичної композиції або лікарської форми, залежить від різних факторів, добре відомих в даній галузі, включаючи, але не обмежуючись ними, спосіб, в якому лікарську форму будуть вводити пацієнту. Наприклад, пероральні лікарські форми, такі як таблетки, можуть містити ексципієнти, не прийнятні для застосування в парентеральних лікарських формах. Придатність конкретного ексципієнта може також залежати від конкретних активних інгредієнтів в лікарській формі. Наприклад, розкладання деяких активних інгредієнтів може бути прискорене деякими ексципієнтами, такими як лактоза, або при контакті з водою. Активні інгредієнти, що містять первинні або вторинні аміни, особливо чутливі до такого прискореного розкладання. Отже, запропоновані фармацевтичні композиції і лікарські форми, які містять в малій кількості, якщо містять, лактозу і інші моно- і дисахариди. Використовуваний в даному документі термін "вільний від лактози" означає, що кількість присутньої лактози, у разі її присутності, є недостатньою, щоб істотно збільшити швидкість розпаду активного інгредієнта. Вільні від лактози композиції можуть містити ексципієнти, які добре відомі в даній галузі і приведені, наприклад, в U.S. Pharmacopeia (USP) 25-NF20 (2002). Як правило, вільні від лактози композиції містять активні інгредієнти, зв'язувальну речовину/наповнювач і лубрикант в фармацевтично сумісних і фармацевтично прийнятних кількостях. У одному варіанті здійснення вільні від лактози лікарські форми містять активні інгредієнти, мікрокристалічну целюлозу, попередньо желатинізований крохмаль і стеарат магнію. 13 UA 110965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Також запропоновані безводні фармацевтичні композиції і лікарські форми, що містять активні інгредієнти, оскільки вода може сприяти розпаду деяких сполук. Наприклад, додавання води (наприклад, 5 %) широко поширене в галузі фармацевтики як засіб імітації тривалого зберігання для того, щоб визначати такі характеристики, як термін зберігання або стабільність препаратів з плином часу. Див., наприклад, Jens Т. Carstensen, Drug Stability: Principles & Practice, 2-е видання, Marcel Dekker, NY, NY, 1995, pp. 379-80. По суті, вода і тепло прискорюють розкладання деяких сполук. Таким чином, вплив води на препарат може мати велике значення, оскільки волога і/або вологість звичайно мають місце в процесі виробництва, обробки, упаковування, зберігання, перевезення і використання препаратів. Безводні фармацевтичні композиції і лікарські форми можна отримувати з використанням безводних інгредієнтів або інгредієнтів, які містять мало вологи, і в умовах низької вологості. Фармацевтичні композиції і лікарські форми, які містять лактозу і щонайменше один активний інгредієнт, який включає первинний або вторинний амін, є безводними, якщо очікується істотний контакт з вологою і/або вологістю в процесі виробництва, упаковування і/або зберігання. Безводну фармацевтичну композицію потрібно отримувати і зберігати таким чином, щоб зберігався її безводний стан. Відповідно, в одному варіанті здійснення безводні композиції упаковують з використанням захищаючих від води матеріалів таким чином, що їх можна включати у відповідні набори з препаратом. Приклади відповідних упаковок включають, але не обмежуються ними, фольгу, що герметично запечатує, пластмаси, контейнери з одиничною дозою (наприклад, ампули), блістерну упаковку і контурну упаковку. Також запропоновані фармацевтичні композиції і лікарські форми, що містять одну або більше сполук, які знижують швидкість, з якою активний інгредієнт буде розкладатися. Такі сполуки, які називаються в даному документі "стабілізаторами", включають, але не обмежуються ними, антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, рН-буфери або сольові буфери. Подібно до кількостей і типів наповнювачів, кількості і певні типи активних інгредієнтів в лікарській формі можуть відрізнятися залежно від таких факторів, як, але не обмежуючись ними, спосіб, яким її будуть вводити пацієнтам. У одному варіанті здійснення лікарські форми містять сполуку за винаходом в кількості від приблизно 0,10 до приблизно 500 мг. У інших варіантах здійснення лікарські форми містять сполуку за винаходом в кількості приблизно 0,1, 1, 2, 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 або 500 мг. У інших варіантах здійснення лікарські форми містять другий активний інгредієнт в кількості від 1 до приблизно 1000 мг, від приблизно 5 до приблизно 500 мг, від приблизно 10 до приблизно 350 мг або від приблизно 50 до приблизно 200 мг. Зрозуміло, конкретна кількість другої активної речовини буде залежати від конкретної використовуваної речовини, захворювань або розладів, що підлягають лікуванню або контролювання, а також кількості(кількостей) сполуки за винаходом і будь-яких необов'язкових додаткових активних речовин, що одночасно вводяться пацієнту. Пероральні лікарські форми Фармацевтичні композиції, прийнятні для перорального введення, можна надавати у вигляді дискретних форм, таких як, але не обмежуючись ними, таблетки (наприклад, жувальні таблетки), каплети, капсули, і рідини (наприклад, ароматизовані сиропи). Такі лікарські форми містять попередньо визначені кількості активних інгредієнтів і можуть бути отримані фармацевтичними методами, добре відомими фахівцям в даній галузі. Див., в основному, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20-е видання, Mack Publishing, Easton PA (2000). Пероральні лікарські форми за винаходом готують шляхом об'єднання активних інгредієнтів в однорідній суміші зі щонайменше одним ексципієнтом відповідно до загальноприйнятих фармацевтичних методів складання сумішей. Ексципієнти можуть приймати дуже різноманітні форми залежно від форми препарату, який потрібно вводити. Наприклад, ексципієнти, прийнятні для використання в пероральних рідких або аерозольних лікарських формах, включають, але не обмежуються ними, воду, гліколі, масла, спирти, віддушки, консерванти і барвники. Приклади ексципієнтів, прийнятних для використання в твердих пероральних лікарських формах (наприклад, порошках, таблетках, капсулах і каплетах), включають, але не обмежуються ними, крохмаль, цукор, мікрокристалічну целюлозу, розріджувачі, гранулюючі речовини, лубриканти, зв'язувальні речовини і розпушувачі. У одному варіанті здійснення пероральні лікарські форми являють собою таблетки або капсули, в цьому випадку використовують тверді ексципієнти. У іншому варіанті здійснення таблетки можна покривати за допомогою стандартних водних або неводних методів. Такі лікарські форми можна отримувати будь-яким з фармацевтичних методів. Як правило, фармацевтичні композиції і лікарські форми отримують шляхом однорідного і ретельного 14 UA 110965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 змішування активних інгредієнтів з рідкими носіями, тонко подрібненими твердими носіями або обома, з подальшим наданням продукту бажаної форми, якщо це необхідно. Наприклад, таблетку можна отримувати пресуванням або формуванням. Пресовані таблетки можна отримувати пресуванням у прийнятному апараті активного компонента у вільно-текучій формі, такій як порошок або гранули, необов'язково змішаного з ексципієнтом. Формовані таблетки можна отримувати формуванням у відповідному апараті суміші порошкоподібного сполуки, зволоженого інертним рідким розріджувачем. Приклади ексципієнтів, які можна використовувати в пероральних лікарських формах за винаходом, включають, але не обмежуються ними, зв'язувальні речовини, наповнювачі, розпушувачі і лубриканти. Зв'язувальні речовини, прийнятні для використання в фармацевтичних композиціях і лікарських формах, включають, але не обмежуються ними, кукурудзяний крохмаль, картопляний крохмаль або інший крохмаль, желатин, природні і синтетичні камеді, такі як аравійська камедь, альгінат натрію, альгінову кислоту, інші альгінати, порошкоподібний трагакант, гуарову камедь, целюлозу і її похідні (наприклад, етилцелюлозу, ацетат целюлози, кальцій-карбоксиметилцелюлозу, натрій-карбоксиметилцелюлозу), полівінілпіролідон, метилцелюлозу, попередньо желатинізований крохмаль, гідроксипропілметилцелюлозу, (наприклад, №№ 2208, 2906, 2910), мікрокристалічну целюлозу, а також їх суміші. Прийнятні форми мікрокристалічної целюлози включають, але не обмежуються ними, матеріали, що продаються під назвами AVICEL-PH-101, AVICEL-PH-103, AVICEL RC-581, AVICEL-PH-105 (постачальник FMC Corporation, American Viscose Division, Avicel Sales, Marcus Hook, PA), а також їх суміші. Конкретна зв'язувальна речовина являє собою суміш мікрокристалічної целюлози і натрію-карбоксиметилцелюлози, що продається під назвою AVICEL RC-581. Прийнятні безводні або з низькою вологістю ексципієнти або добавки включають AVICEL-PH-103™ і Starch 1500 LM. Приклади наповнювачів, прийнятних для використання в фармацевтичних композиціях і лікарських формах за винаходом, включають, але не обмежуються ними, тальк, карбонат кальцію (наприклад, гранули або порошок), мікрокристалічну целюлозу, порошкоподібну целюлозу, декстрани, каолін, маніт, кремнієву кислоту, сорбіт, крохмаль, попередньо желатинізований крохмаль, а також їх суміші. У одному варіанті здійснення зв'язувальна речовина або наповнювач в фармацевтичних композиціях присутні в кількості від приблизно 50 до приблизно 99 масових процентів від маси фармацевтичної композиції або лікарської форми. Розпушувачі можна використовувати в композиціях для отримання таблеток, які розпадаються при контакті з водним середовищем. Таблетки, які містять дуже багато розпушувача, можуть розпадатися при зберіганні, в той час як ті, які містять його дуже мало, можуть не розпадатися з бажаною швидкістю або при бажаних умовах. Таким чином, для отримання твердих пероральних лікарських форм можна використовувати достатню кількість розпушувача, не дуже багато і не дуже мало, щоб вона не впливала негативно на вивільнення активних інгредієнтів. Кількість розпушувача, що використовується, варіюється залежно від типу препарату, і це очевидно для фахівців в даній галузі. У одному варіанті здійснення фармацевтичні композиції містять від приблизно 0,5 до приблизно 15 масових процентів розпушувача, або від приблизно 1 до приблизно 5 масових процентів розпушувача. Розпушувачі, які можна використовувати в фармацевтичних композиціях і лікарських формах, включають, але не обмежуються ними, агар-агар, альгінову кислоту, карбонат кальцію, мікрокристалічну целюлозу, кроскармелозу натрію, кросповідон, калійполакрилін, натрію гліколят крохмалю, картопляний крохмаль або крохмаль тапіоки, інший крохмаль, попередньо желатинізований крохмаль, інший крохмаль, глини, інші альгіни, іншу целюлозу, камеді, а також їх суміші. Лубриканти, які можна використовувати в фармацевтичних композиціях і лікарських формах, включають, але не обмежуються ними, стеарат кальцію, стеарат магнію, мінеральне масло, легке мінеральне масло, гліцерин, сорбіт, маніт, поліетиленгліколь, інші гліколі, стеаринову кислоту, лаурилсульфат натрію, тальк, гідрогенізовану рослинну олію (наприклад, арахісову олію, бавовняну олію, соняшникову олію, кунжутну олію, оливкову олію, кукурудзяну олію і соєву олію), стеарат цинку, етилолеат, етиллаурат, агар, а також їх суміші. Додаткові лубриканти включають, наприклад, силоїдний силікагель (AEROSIL200, що виробляється W.R. Grace Co. of Baltimore, MD), коагульований аерозоль синтетичного діоксиду кремнію (що постачається на ринок Degussa Co. of Piano, TX), CAB-O-SIL (пірогенний препарат діоксиду кремнію, що продається Cabot Co. of Boston, MA), а також їх суміші. У випадку їх використання, лубриканти можна використовувати в кількості меншій ніж приблизно 1 масовий процент від маси фармацевтичних композицій або лікарських форм, в які їх включають. 15 UA 110965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У одному варіанті здійснення тверда пероральна лікарська форма містить сполуку за винаходом, безводну лактозу, мікрокристалічну целюлозу, полівінілпіролідон, стеаринову кислоту, колоїдний безводний діоксид кремнію і желатин. Лікарські форми з контрольованим вивільненням Активні інгредієнти, такі як сполуки за винаходом, можна вводити за допомогою засобів контрольованого вивільнення або за допомогою пристроїв доставки, які добре відомі фахівцям в даній галузі. Приклади включають, але не обмежуються ними, ті, які описані в патентах США №№: 3845770, 3916899, 3536809, 3598123 і 4008719, 5674533, 5059595, 5591767, 5120548, 5073543, 5639476, 5354556, 5639480, 5733566, 5739108, 5891474, 5922356, 5972891, 5980945, 5993855, 6045830, 6087324, 6113943, 6197350, 6248363, 6264970, 6267981, 6376461, 6419961, 6589548, 6613358, 6699500, кожний з яких включений в даний документ за допомогою посилання. Такі лікарські форми можна використовувати для забезпечення повільного або контрольованого вивільнення одного або більше активних інгредієнтів, використовуючи, наприклад, гідроксипропілметилцелюлозу, інші полімерні матриці, гелі, проникні мембрани, осмотичні системи, багатошарові покриття, мікрочастинки, ліпосоми, мікросфери, або їх поєднання в різних пропорціях, щоб забезпечити бажаний профіль вивільнення. Прийнятні препарати з контрольованим вивільненням відомі рядовим фахівцям в даній галузі, включаючи ті, які описані в даному документі, можна легко вибирати для використання з активними інгредієнтами за винаходом. Таким чином, запропоновані композиції включають одиничні лікарські форми, прийнятні для перорального введення, такі як, але не обмежуючись ними, таблетки, капсули, желатинові капсули і каплети, які пристосовані для контрольованого вивільнення. Всі фармацевтичні препарати з контрольованим вивільненням мають загальну мету поліпшення лікарської терапії в порівнянні з тим, що досягається за рахунок таких же препаратів без контрольованого вивільнення. У ідеалі, використання оптимально розробленого препарату з контрольованим вивільненням в лікуванні характеризується використанням мінімуму лікарської субстанції для лікування або контролювання стану за мінімальну кількість часу. Переваги препаратів з контрольованим вивільненням включають більш тривалу активність лікарського засобу, меншу частоту дозування і краще дотримання пацієнтами режиму терапії. Крім того, препарати з контрольованим вивільненням можна використовувати для надання впливу на час початку дії або інші характеристики, такі як рівні лікарського засобу в крові, і, таким чином, можна впливати на виникнення побічних (наприклад, несприятливих) ефектів. Більшість препаратів з контрольованим вивільненням розроблені так, щоб спочатку вивільняти деяку кількість лікарського засобу (активного інгредієнта), що швидко приводить до бажаного терапевтичного ефекту, і поступово і безперервно вивільняти інші кількості лікарського засобу для підтримування цього рівня терапевтичного або профілактичного ефекту протягом тривалого періоду часу. Для підтримування цього постійного рівня лікарського засобу в організмі, лікарський засіб повинен вивільнятися з лікарської форми зі швидкістю, яка забезпечує заміну кількості препарату, що метаболізується і виводиться з організму. Контрольоване вивільнення активного інгредієнта можна стимулювати різними умовами, включаючи, але не обмежуючись ними, pH, температуру, ферменти, воду або інші фізіологічні умови або сполуки. У деяких варіантах здійснення лікарський засіб можна вводити з використанням внутрішньовенної інфузії, імплантованого осмотичного насоса, трансдермального пластиру, ліпосом або інших способів введення. У одному варіанті здійснення можна використовувати насос (див. Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88: 507 (1980); Saudek et al., N. Engl J. Med. 321: 574 (1989)). У іншому варіанті здійснення можна використовувати полімерні матеріали. У ще одному варіанті здійснення систему з контрольованим вивільненням можна вміщувати в певну ділянку тіла суб'єкта, що визначається практикуючим фахівцем, тобто, в цьому випадку буде потрібна лише частина системної дози (див., наприклад, Goodson, Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Інші системи контрольованого вивільнення обговорюються в огляді Langer (Science 249: 15271533 (1990)). Активний інгредієнт може бути диспергований в твердій внутрішній матриці з, наприклад, поліметилметакрилату, полібутилметакрилату, пластифікованого або непластифікованого полівінілхлориду, пластифікованого нейлону, пластифікованого поліетилентерефталату, натурального каучуку, поліізопрену, поліізобутилену, полібутадієну, поліетилену, співполімерів етилен-вінілацетату, силіконових каучуку, полідиметилсилоксанів, силіконів-карбонатних співполімерів, гідрофільних полімерів, таких як гідрогелі складного ефіру акрилової і метакрилової кислоти, колагену, зшитого полівінілового спирту і зшитого частково гідролізованого полівінілацетату, яка оточена зовнішньою полімерною мембраною з, наприклад, 16 UA 110965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поліетилену, поліпропілену, співполімерів етилену/пропілену, співполімерів етилену/етилакрилату, співполімерів етилену/вінілацетату, силіконових каучуку, полідиметилсилоксанів, неопренового каучуку, хлорованого поліетилену, полівінілхлориду, співполімерів вінілхлориду з вінілацетатом, вініліденхлориду, співполімерів етилену і пропілену, іономера поліетилентерефталату, бутилового каучуку, епіхлоргідринового каучуку, співполімеру етилену/вінілового спирту, потрійного співполімеру етилену/вінілацетату/вінілового спирту і співполімеру етилену/вінілоксіетанолу, яка нерозчинна в рідинах організму. Потім на етапі вивільнення з контрольованою швидкістю активний інгредієнт дифундує через зовнішню полімерну мембрану. Процентний вміст активного компонента в таких парентеральних композиціях значною мірою залежить від його специфічної природи, а також від потреби суб'єкта. Парентеральні лікарські форми Парентеральні лікарські форма можна вводити пацієнтам різними способами, включаючи, але не обмежуючись ними, підшкірним, внутрішньовенним (в тому числі болюсна ін'єкція), внутрішньом'язовим і внутрішньоартеріальним. У деяких варіантах здійснення введення парентеральної лікарської форми обходить природний захист пацієнта від чужорідних речовин і, таким чином, в цих варіантах здійснення парентеральні лікарські форми є стерильними або можуть бути стерилізовані перед введенням пацієнту. Приклади парентеральних лікарських форм включають, але не обмежуючись ними, розчини, готові для ін'єкції, сухі препарати, готові для розчинення або суспендування в фармацевтично прийнятному середовищі для ін'єкції, суспензії, готові для ін'єкції, і емульсії. Прийнятні носії, які можна використовувати для доставки парентеральних лікарських форм, добре відомі фахівцям в даній галузі. Приклади включають, але не обмежуються ними: воду для ін'єкцій USP; водні носії, такі як, але не обмежуючись ними, розчин хлориду натрію для ін'єкцій, розчин Рінгера для ін'єкцій, розчин декстрози для ін'єкцій, розчин декстрози і хлориду натрію для ін'єкцій і розчин Рінгера з лактатом для ін'єкцій; носії, що змішуються з водою, такі як, але не обмежуючись ними, етиловий спирт, поліетиленгліколь і поліпропіленгліколь; і неводні носії, такі як, але не обмежуючись ними, кукурудзяна олія, бавовняна олія, арахісова олія, кунжутна олія, етилолеат, ізопропілміристат і бензилбензоат. Сполуки, які підвищують розчинність одного або більше активних інгредієнтів, розкритих в даному документі, також можна включати в парентеральні лікарські форми. Наприклад, циклодекстрин і його похідні можна використовувати для збільшення розчинності сполуки за винаходом. Див., наприклад, патент США № 5134127, який включений в даний документ за допомогою посилання. Лікарські форми для місцевого застосування або для нанесення на слизову Лікарські форми для місцевого застосування або для нанесення на слизову за винаходом включають, але не обмежуються ними, спреї, аерозолі, розчини, емульсії, суспензії, очні краплі або інші офтальмологічні препарати, або інші форми, відомі фахівцям в даній галузі. Див., наприклад, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16е, 18е і 20е видання, Mack Publishing, Easton PA (1980, 1990 і 2000 р. м.); і Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4-е видання, Lea & Febiger, Philadelphia (1985). Лікарські форми, прийнятні для обробки слизової тканини в порожнині рота, можуть бути сформульовані як рідини для полоскання рота або як пероральні гелі. Прийнятні ексципієнти (наприклад, носії і розріджувачі) і інші матеріали, які можна використовувати для забезпечення доставки лікарських форм для місцевого застосування або для нанесення на слизову за даним винаходом, добре відомі фахівцям в фармацевтичній галузі, і залежать від конкретної тканини, на яку дана фармацевтична композиція або лікарська форма буде нанесена. У одному варіанті здійснення ексципієнти включають, але не обмежуються ними, воду, ацетони, етанол, етиленгліколь, пропіленгліколь, бутан-1,3-діол, ізопропілміристат, ізопропілпальмітат, мінеральне масло і їх суміші для отримання розчинів, емульсій або гелів, які є нетоксичними і фармацевтично прийнятними. Зволожуючі засоби або зволожувачі також можна додавати до фармацевтичних композицій і лікарських форм. Приклади додаткових інгредієнтів добре відомі в даній галузі. Див., наприклад, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-е, 18-е і 20-е видання, Mack Publishing, Easton PA (1980, 1990 і 2000 р. м.). Величину рН фармацевтичної композиції або лікарської форми також можна регулювати для поліпшення доставки одного або більше активних інгредієнтів. Крім того, для поліпшення доставки можна регулювати полярність розчинника носія, його іонну силу або тонічність. Такі сполуки, як стеарати, також можна додавати до фармацевтичних композицій або лікарських форм для зміни гідрофільності або ліпофільності одного або більше активних інгредієнтів з 17 UA 110965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 метою поліпшення доставки. У інших варіантах здійснення стеарати можуть служити як ліпідний носій для препарату, як емульгатор або сурфактант, або як поліпшуючий доставку або збільшуючий проникність засіб. У інших варіантах здійснення солі, сольвати, гідрати, проліки, клатрати, або стереоізомери активних інгредієнтів можна використовувати для подальшого регулювання властивостей отриманої композиції. Набори У одному варіанті здійснення активні інгредієнти за винаходом не вводять пацієнту одночасно або одним і тим же способом введення. У іншому варіанті здійснення запропоновані набори, здатні полегшувати введення відповідних кількостей активних інгредієнтів. У одному варіанті здійснення набір містить лікарську форму сполуки за винаходом. Набори можуть також включати додаткові активні інгредієнти, такі як інші протизапальні, імуномодулюючі сполуки або імунодепресанти, або їх поєднання. Приклади додаткових активних інгредієнтів включають, але не обмежуються ними, ті, які розкриті в даному документі. У інших варіантах здійснення набори можуть додатково включати пристрої, які використовують для введення активних інгредієнтів. Приклади таких пристроїв включають, але не обмежуються ними, шприци, крапельниці, пластири і інгалятори. Набори можуть також включати клітини або кров для трансплантації, а також фармацевтично прийнятні носії, які можуть бути використані для введення одного або більше активних інгредієнтів. Наприклад, якщо активний інгредієнт постачається в твердій формі і повинен бути відновлений для парентерального введення, в комплект може входити герметичний контейнер з прийнятним носієм, в якому активний інгредієнт може бути розчинений з отриманням вільного від частинок стерильного розчину, прийнятного для парентерального введення. Приклади фармацевтично прийнятних носіїв включають, але не обмежуються ними: воду для ін'єкцій USP; водні носії, такі як, але не обмежуючись ними, розчин хлориду натрію для ін'єкцій, розчин Рінгера для ін'єкцій, розчин декстрози для ін'єкцій, розчин декстрози і хлориду натрію для ін'єкцій і розчин Рінгера з лактатом для ін'єкцій; носії, що змішуються з водою, такі як, але не обмежуючись ними, етиловий спирт, поліетиленгліколь і поліпропіленгліколь; і неводні носії, такі як, але не обмежуючись ними, кукурудзяна олія, бавовняна олія, арахісова олія, кунжутна олія, етилолеат, ізопропілміристат і бензилбензоат. Приклади Наступні приклади приведені з метою ілюстрації, а не обмеження. 8.1 Приклад 1: Ефект тестованої сполуки на продукцію цитокінів і хемокінів в людських Тклітинах, стимульованих антитілом проти CD3 людини Даний приклад демонструє ефект 3-(5-аміно-2-метил-4-оксохіназолін-3(4H)-іл)піперидин-2,6діону (тестовані сполуки) на продукцію цитокінів і хемокінів в стимульованих антитілом проти CD3 людини людських Т-клітинах з використанням технології мультиплексування Luminex. Використані наступні скорочення: Абревіатура Пояснення або Визначення IL Інтерлейкін G-CSF Гранулоцитарний колонієстимулюючий фактор GM-CSF Гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор IFN-γ Інтерферон гамма Фактор некрозу пухлин альфа TNF- RANTES Хемокін, експресований і секретований нормальними Т-клітинами при активації У даному дослідженні були використані наступні матеріали: Середовище RPMI-1640 з додаванням 10 % FBS, 100 одиниць/мл пеніциліну, 100 мг/мл стрептоміцину і 2 мМ L-глутаміну (Life Technologies). ® Коктейль RosetteSep , збагачений людськими Т-клітинами (StemCell, каталожний № 15061). 12-плексний набір людських цитокінів/хемокінів Luminex (Millipore, каталожний № MPXHCYTO-60K-12). Прилад Luminex IS 100 (Millipore). Антитіло проти CD3 людини, клон OKT3 (eBioscience, каталожний № 16-0037-85). Вихідні розчини тестованих сполук готували в концентрації 4мМ в ДМСО. Т-клітини виділяли ® з лейкоцитарної плівки негативною селекцією з використанням коктейлю RosetteSep , збагаченого людськими Т-клітинами, відповідно до інструкцій виробника. Всі ямки 96-ямкових планшетів попередньо покривала антитілом проти CD3 людини в концентрації 3 мкг/мл в 100 мкл 1X PBS протягом 4 годин при 37 °C. Планшети промивали 3 рази повним середовищем RPMI-1640 до проведення Т-клітинного аналізу. Потім Т-клітини 5 висівали на попередньо покриті анти-CD3 антитілами планшети при щільності клітин 2,5×10 18 UA 110965 C2 5 10 клітин/ямку в 180 мкл повного середовища RPMI-1640. До клітин додавали 20 мкл серійно 10кратно розведеної тестованої сполуки в концентраціях 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 і 0,00001 мкМ в двох повторах. Кінцеві концентрації ДМСО становили 0,25 %. Планшети інкубували протягом 48 годин при 37 °C, 5 % СО2. Через 48 год. супернатанти збирали і тестували за допомогою мультиплексного цитометричного аналізу з матрицею з мікрочастинок (CBA) на наступні цитокіни/хемокіни: IL-2, IL-3, IL-5, IL-10, IL-13, IL-15, IL-17A, GM-CSF, G-CSF, IFN-γ, TNF-α, і RANTES. Планшети для аналізу CBA аналізували на приладі Luminex IS 100. Дані для кожного донора зображали графічно, використовуючи програму GraphPad Prism 5.0, і виражали у вигляді середнього значення пг/мл ± SEM і % від контролю з DMSO ± SEM. Тестована сполука виявляла імуномодулюючу активність відносно стимульованих анти-CD3 первинних людських Т-клітин, змінюючи продукцію деяких цитокінів і хемокінів. Базові рівні цитокінів і хемокінів, продуковані стимульованими людськими Т-клітинами, інкубованими з носієм, приведені в таблиці 1 нижче. Таблиця 1 Базові рівні цитокінів і хемокінів Цитокін/Хемокін Продукована базова кількість (пг/мл) IL-2 31 IL 38 IL-5 27 IL-10 449 IL-13 205 IL-17A 19 GM-CSF 132 IFN-γ 1271 TNF- 411 RANTES 314 15 20 25 30 Тестована сполука збільшувала продукцію IL-2, IL-3, IL-5, IL-10, IL-13, GM-CSF, IFN-γ, RANTES і TNF- в стимульованих людських Т-клітинах. Збільшення продукції за рахунок тестованої сполуки було значною мірою залежним від концентрації для більшості цитокінів і хемокінів, за винятком IL-10 і IL-5. Тестована сполука підвищувала продукцію IL-10 при низьких концентраціях, однак інгібувала збільшення продукції IL-10 при високих концентраціях. Тестована сполука збільшувала продукцію IL-5 в 3 і 4 рази при 0,01 і 0,1 мкМ, відповідно, демонструючи менше збільшення як при нижчих, так і при вищих концентраціях. Ефект тестованої сполуки на продукцію цитокінів і хемокінів в стимульованих анти-CD3 людських Тклітинах, виражений у вигляді абсолютної продукованої кількості і у вигляді процента від контрольних клітин з додаванням носія, показаний на Фіг. 1 і 2, відповідно. Пунктирна лінія на Фіг. 2 означає рівень, еквівалентний подвоєній базовій продукції (EC200). 8.2 Приклад 2: Протизапальна активність Протизапальну активність 3-(5-аміно-2-метил-4-оксохіназолін-3(4H)-іл)піперидин-2,6-діону (тестованої сполуки) вивчали на людських мононуклеарних клітинах периферичної крові (лМКПК) (hPBMC). Технологію Luminex використовували для визначення інгібуючої (стимулюючої) концентрації, IC50 для сполуки з метою одночасного отримання профілів протизапальних цитокінів/хемокінів і IL-10 (протизапального цитокіну) для стимульованих ЛПС (LPS) людських МКПК від здорового донора. Використані наступні скорочення: 19 UA 110965 C2 Абревіатура GM-CSF IL ЛПС MCP-1 MDC ΜΙΡ-1 ΜΙΡ-1 МКПК PPM RANTES 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Пояснення або Визначення Гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор Інтерлейкін Ліпополісахарид Білок хемотаксису моноцитів 1 Макрофагальний хемокін Макрофагальний запальний білок 1-альфа Макрофагальний запальний білок 1-бета Мононуклеарні клітини периферичної крові Плейотропний модифікатор шляху Хемокін, експресований і секретований нормальними Т-клітинами при активації Фактор некрозу пухлин альфа TNF- 50 мл лейкоцитарних плівок від здорових донорів отримували з Центра крові в Нью-Джерсі (East Orange, New Jersey). Ліпополісахарид (штам) (каталожний № L-1887) купували у Sigma. Мультиплексні набори з гранулами, покритими антитілами, для технології Luminex xMAP купували у Millipore (Billerica, Massachusetts) і об'єднували в мультиплексний формат перед аналізом. Очищення мононуклеарних клітин периферичної крові людини 50 мл людських лейкоцитарних плівок розносили аліквотами по 25 мл кожна в дві 50-мл конічні пробірки, і по 25 мл стерильного розчину HBSS додавали в кожну конічну пробірку. Пробірки обережно перемішували перевертанням. Аліквоти по п'ятнадцять мл Фіколл-Пак Плюс (GE Healthcare (location); каталожний № 17-1440-02) кімнатної температури вносили в 50-мл конічні пробірки. Потім 25 мл суміші лейкоцитарних плівок/HBSS обережно і повільно нашаровували на поверхню фікола. Проби центрифугували при 450 об/хв протягом 35 хвилин. Верхній шар, що містить плазму, відбирали піпеткою і відкидали. Поверхню розділення, що містить мононуклеарні клітини, переносили в дві 50-мл конічні пробірки. У обидві конічні пробірки додавали HBSS до загального об'єму 50 мл і центрифугували при 1200 об/хв протягом 10 хвилин. Клітини знову промивали в HBSS і центрифугували при 1000 об/хв протягом 10 хвилин. Клітинний осад ресуспендували в 20 мл повного середовища RPMI (RPMI/5 % людської сироватки/1x суміш пеніцилін/стрептоміцин/глутамін) і робили підрахунок клітин. Обробка людських мононуклеарних клітин периферичної крові 6 Сто мкл лМКПК (2×10 /мл) додавали в кожну ямку 96-ямкового плоскодонного планшета 5 (кінцеве число клітин = 2×10 /ямку) і інкубували при 37 °C протягом 1 години. Двадцять мкл (10х) сполуки додавали в кожну ямку для аналізу і двадцять мкл середовища, що містить 2,5 % ДМСО, додавали в кожну контрольну ямку [DMSO](кінцева концентрація = 0,25 %) і планшет інкубували протягом 1 години при 37 °C. Потім клітини стимулювали 80 мкл ЛПС в концентрації 2,5 нг/мл ([ЛПС] кінцева концентрація = 1 нг/мл) і інкубували протягом 18 годин при 37 °C. 50 мкл супернатанта з кожної ямки переносили в 3 нові круглодонні 96-ямкові планшети і зберігали при -20 °C для аналізу Luminex. Для кожного зразка використовували ямки в двох повторах. Аналіз Luminex Зразки супернатанта аналізували на цитокіни в мультиплексному форматі відповідно до інструкцій виробника (Millipore, Billerica, Ma 01821) на приладі Luminex IS 100. Аналізи для IL-12 і GM-CSF проводили в дуплексному форматі, використовуючи нерозбавлені супернатанти, тоді як інші цитокіни аналізували в мультиплексному форматі, використовуючи супернатанти, розбавлені 1:20. Аналіз даних проводили з використанням програмного забезпечення Upstate Beadview. Значення IC50 розраховували з використанням нелінійної регресії, сигмоїдальної кривої доза-відповідь, накладаючи обмеження зверху до 100 % і знизу до 0 %, допускаючи варіабельний нахил кривої. Значення EC50 були основані на верхньому обмеженні сигмоїдальною кривою, що дорівнює 246,9 %, що являє собою середнє збільшення продукції IL10, викликане помалідомідом (контроль) в концентрації 10 мкМ, і нижньому обмеженні до 100 %. Значення визначали, використовуючи GraphPad Prism v5.00. Дані являють собою середні значення + SEM (стандартна помилка середнього) з n (кількість експериментів в двох повторах). Як показали дані в таблиці 2 нижче і на Фіг. 3, загалом, тестована сполука має різну ефективність відносно інгібування різних цитокінів, що вивчаються, наприклад, IL-6, IL-8, IL-1, GM-CSF, MDC, ΜΙΡ-1, ΜΙΡ-1 і TNF-. Крім того, тестована сполука стимулювала продукцію IL10, MCP-1 і RANTES з різною ефективністю, як видно з таблиці 3 і фігури 4. 20 UA 110965 C2 Таблиця 2 Зведені дані профілів інгібування продукції цитокінів тестованою сполукою Цитокін IC50 тестованої сполуки (мкМ) IL-6 0,060 IL-8 >10 IL-1 0,054 GM-CSF 0,95 MDC 0,062 MIP-1 0,30 MIP-1 >10 TNF- 0,034 Таблиця 3 Зведені дані профілів цитокінів, середні значення у % від контролю при 0,1 мкМ Цитокін Тестована сполука (% від контролю) IL-10 MCP-1 10 236 RANTES 5 480 131 8.3 Приклад 3: Ефект на функцію людських клітин - натуральних кілерів (НК) у відповідь на IgG/ритуксимаб У даному прикладі вивчали здатність тестованої сполуки стимулювати функцію людських НК-клітин у відповідь на IgG/ритуксимаб. Імуномодулюючу активність тестованої сполуки порівнювали в двох аналізах на функції клітин - натуральних кілерів (НК): (1) індуковану IgG і IL2 продукцію інтерферону-гамма (IFN-γ) і (2) здатність до знищення клітин, що вимірюється в in vitro моделі ADCC (антитіло-залежної клітинної цитотоксичності). Використані наступні скорочення: Абревіатура Пояснення або Визначення ABC-DLBCL Подібна до активованих В-клітин дифузна В-великоклітинна лімфома ADCC Антитіло-залежна клітинна цитотоксичність ДМСО Диметилсульфоксид IgG Імуноглобулін G IFN-γ Інтерферон-гамма НК Натуральний кілер PPM Плейотропний модифікатор шляху rhIL-2 Людський рекомбінантний інтерлейкін-2 Матеріали, що використовуються в дослідженні, і їх джерела приведені нижче: Лейкоцитарні плівки від здорових добровольців (Центр крові Нью-Джерсі). 21 UA 110965 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Фікол-Гіпак Плюс (Fisher Scientific Co LLC, PA, каталожний № 17144002). Середовище RPMI-1640 з додаванням 10 % FBS (фетальної бичачої сироватки), 100 одиниць/мл пеніциліну, 100 мг/мл стрептоміцину і 2 мМ L-глутаміну (Invitrogen, каталожний № 21870-076). Середовище RPMI-1640 (без фенолу червоного) з додаванням 10 % FBS, 100 одиниць/мл пеніциліну, 100 мг/мл стрептоміцину і 2 мМ L-глутаміну (Invitrogen, каталожний № 11835-030). Ритуксимаб (Рітуксан, Roche, Inc.) (каталожний № DIN 02241927, лот № B50177). Людська AB+ сироватка (Gemini Bio Products, CA, каталожний № 100-512). Набір для нерадіоактивного аналізу на цитотоксичність CytoTox 96 (Promega, WI, каталожний № G1780). Коктейль RosetteSep, збагачений людськими НК-клітинами (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, каталожний № 15065). Кон'югат APC з антитілами миші проти CD56+ людини (BD Biosciences, CA, каталожний № 555518). Людський імуноглобулін G з сироватки (IgG) (Sigma, St. Louis, MO; каталожний № I251110MG). Людський рекомбінантний IL-2 (R&D Systems, MN, каталожний № 202-IL-050/CF). Набір для ELISA для визначення людського IFN-гамма (ThermoFisher, каталожний № PIEHIFNG5). Використовували наступні клітинні лінії: Подібна до активованих В-клітин дифузна В-великоклітинна лімфома (ABC-DLBCL): клітини Riva (NCI, MD). Подібна до В-клітин гермінативного центра дифузна В-великоклітинна лімфома (GCBDLBCL): WSU-DLCL2 (Celgene Signal, CA). Farage (ATCC, VA). Фолікулярна лімфома: DoHH2 (DSMZ, Німеччина). Лімфома Беркітта (BL): Raji (ATCC, VA). НК-клітини від здорових донорів виділяли з лейкоцитарних плівок крові негативною селекцією, використовуючи коктейль RosetteSep, збагачений НК-клітинами (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC), перед центрифугуванням в градієнті щільності суміші фікол-гіпак (Fisher Scientific Co LLC, PA), слідуючи інструкціям виробника. CD56+ НК-клітини виділяли до ~85 % чистоти, що визначається методом протокової цитометрії (BD Biosciences, CA). Аналіз індукованої IgG продукції НК-клітинами інтерферону-гамма (IFN-гамма) Ямки 96-ямкових плоскодонних планшетів покривала людськими IgG (Sigma) в концентрації 100 мкг/мл протягом ночі при 4 °C. На наступний день незв'язані IgG видаляли промиванням холодним 1X PBS. Потім НК-клітини висівали в покриті IgG 96-ямкові планшети при щільності 5 клітин 2×10 клітин в ямку в середовищі 180 RPMI-1640 і додавали 10 нг/мл rhIL-2 (R&D Systems, MN). Тестовану сполуку додавали в об'ємі 20 мкл ДМСО. Кінцеві концентрації тестованої сполуки становили 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1 або 10 мкМ. Кінцеві концентрації ДМСО становили 0,25 %. Через 48 годин супернатанти збирали і аналізували методом ELISA на продукцію IFN-γ. Дані, що використовуються для визначення здатності тестованої сполуки стимулювати продукцію IFN-γ НК-клітинами у відповідь на стимуляцію іммобілізованими IgG і rhIL-2, аналізували для кожного донора з використанням програми GraphPad Prism v5.0. Дані представляли в двох видах, (1) як абсолютна кількість продукованого IFN-γ (пг/мл ± SEM) і (2) як процент від кількості IFN-γ, продукованого в присутності 1 мкМ помалідоміду. Величина EC50 являє собою концентрацію тестованої сполуки, що забезпечує напівмаксимальну продукцію IFN-γ, при цьому максимальну продукцію визначали як кількість IFN-γ, продукованого в присутності 1 мкМ помалідоміду. Значення EC 50 розраховували з використанням нелінійної регресії, сигмоїдальної кривої доза-відповідь, накладаючи обмеження зверху до 100 % і знизу до 0 %, допускаючи варіабельний нахил кривої. Значення EC 50 для тестованої сполуки становило 0,0015 мкМ. Тестована сполука стимулювала продукцію IFN-γ НК-клітинами дозозалежним чином у відповідь на стимуляцію іммобілізованими IgG і IL-2. Результати приведені на Фіг. 5 (виражені в пг/мл продукованого IFN-γ), відповідно. На Фіг. 6 приведені результати для тестованої сполуки, виражені у вигляді збільшення в процентах продукованого IFN-γ відносно IFN-γ, продукованого в присутності помалідоміду в концентрації 1 мкМ. Кожне значення, представлене на Фіг. 5 і 6, являє собою середнє значення з 12-14 визначень ± SEM. Аналіз ADCC 22 UA 110965 C2 4 5 10 15 20 25 30 Очищені НК-клітини (5×10 ) висівали в 96-ямкові круглодонні планшети в 100 мкл середовища RPMI-1640 без фенолу (Invitrogen) + 2 % людська AB + сироватка (Gemini Bio Products, CA) і обробляли 10 нг/мл rhIL-2 і ритуксимабом (5 мкг/мл) плюс тестована сполука в різних концентраціях від 0,01 до 10 мкМ протягом 48 годин. Різні лінії клітин лімфоми (GCB-DLBCL: WSU-DLCL2 і Farage; фолікулярна лімфома: DoHH2; ABC-DLBCL: Riva; лімфома Беркітта [BL]: Raji) обробляли ритуксимабом в концентрації 5 мкг/мл протягом 30 хвилин при 37 °C. Непов'язаний ритуксимаб видаляли промиванням, цільові 3 клітини (5×10 /100 мкл/ямку) додавали до попередньо оброблених ефекторних клітин (НКклітин) в співвідношенні 10:1, і спільно інкубували їх протягом 4 годин при 37 °C. Контрольні умови являли собою НК-клітини плюс пухлинні клітини, оброблені (1) тільки середовищем, (2) тільки ритуксимабом або (3) тільки IL-2. Використовуючи аліквоту супернатанта (50 мкл), цитотоксичність НК-клітин відносно пухлинних клітин аналізували за допомогою стандартного тесту на вивільнення лактатдегідрогенази (LDH) для вимірювання ADCC (Набір для нерадіоактивного аналізу на цитотоксичність CytoTox 96, Promega, WI). Спонтанне вивільнення одними тільки цільовими клітинами становило