Спосіб виявлення наявності соєвих білків у молоці та молочних продуктах

1. Спосіб виявлення наявності соєвих білків у молоці або молочних продуктах передбачає розділення білків проби методом електрофорезу, що включає готування проби, електрофоретичної пластини, верхнього та нижнього буферів, проведення процедури електрофорезу, фіксацію та забарвлення гелю, денситометрування, який відрізняється тим, що в разі молока або рідкого молочного продукту при готуванні проби проводять осадження білків 5 % розчином HCl з наступним центрифугуванням, знежирення осаду органічним розчинником та його висушування, при цьому електрофоретичні пластини готують з 11,0±0,1 % C2 2 (11) 1 3 83595 4 capillary electrophoresis // J Chromatogr A. 1999 В способі виявлення наявності соєвих білків у v.836, N1 - p.153-60]. Ці два способи потребують молоці та молочних продуктах для молока або складного обладнання. рідких молочних продуктів проби обробляють розВідомо спосіб виявлення рослинних білків у чином соляної кислоти для осадження казеїнів молочних продуктах методом імуноферментного молока і білків сої, якщо вони присутні у пробі. аналізу [Sanchez L., Perez M.D., Pu vol P. et al. Подальше центрифугування дозволяє відокремити Determination of vegetal proteins in milk powder by осад білків від супернатанту - рідини, що утворюenzyme-linked immunosorbent assay: interlaboratory ється під час центрифугування над осадом. Осад study // Journal of AOAC international, 2002, - v.85, білків знежирюють органічним розчинником. N6 - p.1390-97]. Такий спосіб передбачає складні В разі виявлення наявності соєвих білків у сиетапи виділення специфічних поліклональних анрах та сирі кисломолочному, пробу розтирають у титіл та антигенів, які не підлягають тривалому фарфоровій ступці та знежирюють органічним зберіганню. розчинником. Найбільш близьким до способу, що заявляєтьЗнежирення білків молока, рідких молочних ся є спосіб виявлення рослинних білків у молочних продуктів або сиру органічним розчинником є непродуктах методом електрофорезу у поліакрилаобхідною процедурою, оскільки молоко та молочні мідному гелі у присутності додецилсульфату напродукти містять жир у кількості 1,5-30%, який затрію [Cattaneo T.M.P., Feroldi Α., Toppino P.M., важає проведенню електрофоретичного розділенOlieman С. Sample preparation for selective and ня і ідентифікації білків. sensitive detection of soya proteins in milk products Білки висушують під тягою за температури 20with chromatographic and electrophoretic techniques 25°С, розтирають у фарфоровій ступці і перено// Neth. Milk Dairy J. 1994 - v.48, p.225-234]. Цей сять у герметичний флакон. Пробу, підготовлену спосіб передбачає розділення білків молочної сутаким чином, можна зберігати за температури міміші з попередньою їх обробкою тетраборатним нус 16-18°С протягом 4-6 місяців. буфером рН 8,3, що дає змогу видалити казеїни і Для проведення електрофорезу - електрофоосадити соєві білки. Електрофорез проводять на ретичного розділення білків, - готують електрофоготових комерційних пластинах PhastGelTM ретичну пластину. При приготуванні поліакриламіGradient 10-15, використовуючи готові комерційні дного гелю для електрофоретичної пластини буферні розчини PhastGel SDS buffer strips (вирозастосовують мочевину у концентрації бництва Pharmacia, Uppsala, Sweden). Недоліком 8,00±0,01моль/дм 3, а співвідношення між акрилатакого способу є висока вартість аналізу та викомідом та метиленбісакриламідом становить 30:1 ристання готових комерційних пластин з гелем, за масою. Концентрація поліакриламіду у гелі також у методі не передбачено спосіб видалення складає 11,0±0,1%. Така модифікація складу гелю жиру і зберігання підготовлених проб. призводить до одночасного підвищення його щільЗавданням винаходу, що пропонується, є розності і запобігає агрегації молекул казеїнів. Це доробка способу виявлення наявності соєвих білків у зволяє досягти чіткого розділення білків у широкомолоці та молочних продуктах незалежно від маму діапазоні молекулярних мас без використання сової частки жиру продукту методом електрофоградієнтного гелю, що значно спрощує процедуру резу у поліакриламідному гелі, який не вимагає електрофорезу. складної апаратурної бази та реактивів, що мають Готують вер хній буферний розчин, рН 8,40високу вартість. 8,42, що містить трисгідроксиметиламінометан у Поставлене завдання вирішується тим, що гоконцентрації 0,033±0,0001моль/дм 3 та додецилсутують проби, електрофоретичну пластину, верхній льфат натрію у концентрації 0,15±0,01% та нижній та нижній буфери, проводять електрофорез, фікбуферний розчин з рН 9,30-9,35, що містить триссацію та забарвлення гелю, денситометрування. В гідроксиметиламінометан у концентрації разі молока або рідкого молочного продукту про0,43±0,001моль/дм 3. Застосування таких буферних водять осадження білків 5% розчином НСl з подарозчинів забезпечує необхідний градієнт напруги льшим центрифугуванням. Отримують осад білків, електричного поля протягом всієї процедури елекякий знежирюють органічним розчинником, а супетрофорезу, що сприяє кращому розділенню білків. рнатант зливають. В разі готування проби твердих, Підготовка приладу: електродні камери заповм'яких, розсільних сирів та сиру кисломолочного нюють буферними розчинами, встановлюють елебезпосередньо знежирюють пробу органічним ктрофоретичну пластину і наносять на неї пробу розчинником. Білки після знежирення висушують білка. Прилад підключають до джерела струму і та наносять на електрофоретичну пластину. Елекпроводять електрофорез при напрузі 100мВ. Після трофоретичну пластину готують з 11,0±0,1%-ого закінчення електрофоретичного розділення білків, поліакриламідного гелю при співвідношенні між проводять фіксацію та забарвлення гелю і його акриламідом та метиленбісакриламідом 30:1 за денситометрування. масою з додаванням мочевини у концентрації Спосіб виявлення наявності соєвих білків у 8,00±0,01моль/дм 3. При проведенні електрофоремолоці та молочних продуктах здійснюється таким зу використовують верхній буферний розчин, рН чином. 8,40-8,42, що містить трисгідроксиметиламіномеДо проби молока або рідкого молочного протан у концентрації 0,033±0,0001моль/дм та додедукту у кількості 50см 3 повільно по краплях додацилсульфат натрію у концентрації 0,15±0,01%, і ють 5% розчин НСl, до появи пластівців білка. Данижній буферний розчин, рН 9,30-9,35, що містить ють відстоятись протягом 30-35хв., потім трисгідроксиметиламінометан у концентрації центрифугують за кутовим прискоренням 50000,43±0,001моль/дм 3. 6000g упродовж 20-25хв. Супернатант зливають, а 5 83595 6 осад білків переносять у фарфорову ступку та фарфорову ступку та тричі знежирювали органічтричі знежирюють органічним розчинником - петним розчинником - петролейним або діетиловим ролейним або діетиловим ефіром, - порціями, за ефіром, - порціями по 15см 3. Органічний розчинник об'ємом вдвічі більшим, ніж маса осаду. Органічз жиром відкидали. Залишки органічного розчинний розчинник з жиром відкидають. ника видаляли висушуванням білків за кімнатної В разі виявлення соєвих білків у твердих, м'ятемператури (20-25)°С під тягою. Сухі білки розтиких, розсільних сирах та сирі кисломолочному рали до однорідного порошкоподібного стану. пробу переносять у фарфорову ступку і знежирюПідготовка проби соєвого молока. Пробу соєють органічним розчинником таким чином, як і вого молока оброблювали таким же чином, як осад білків молока та рідких молочних продуктів. пробу коров'ячого молока. Це дозволяє видалити практично всю жирову фазу Підготовка проби соєвого ізоляту. Соєвий ізодосліджуваної проби незалежно від її вмісту у молят не потребує процедури знежирення, оскільки лочному продукті. масова частка жиру у цьому продукті складає меЗалишки органічного розчинника видаляють нше, ніж 1%. Тому пробу одразу наносять на елеквисушуванням осаду білків за кімнатної температрофоретичну пластину. тури 20-25°С під тягою. При приготуванні 11% поліакриламідного гелю Одержаний сухий осад білків розтирають до для електрофоретичної пластини використовуваоднорідного порошкоподібного стану та переноли співвідношення між акриламідом та метиленбісять у скляний флакон із герметичною накривкою. сакриламідом 30:1 за масою та додавали мочевиПорошок білків у такому флаконі може зберігатись ну з розрахунку 48,05г на 100см гелю. за температури мінус 16-18°С протягом 4-6 місяВикористовували верхній буферний розчин з рН ців. 8,4, що містив трисгідроксиметиламінометан у Для покращення електрофоретичного роздіконцентрації 0,033моль/дм 3 та додецилсульфат лення білків запропоновано при приготуванні полінатрію у концентрації 0,15%, та нижній буферний акриламідного гелю для електрофоретичної пласрозчин з рН 9,30, що містив трисгідроксиметиламітини застосовувати мочевину у концентрації нометан у концентрації 0,43моль/дм 3. 3 8моль/дм , а співвідношення між акриламідом та Одержані білки коров'ячого молока, соєвого метиленбісакриламідом становить 30:1 за масою. молока, та соєвого ізоляту наносили на електроКонцентрація поліакриламіду у гелі складає 11%. форетичну пластину. Подальшу процедуру електТака модифікація складу гелю призводить до одрофоретичного розділення білків у поліакриламідночасного підвищення його щільності і запобігає ному гелі в присутності додецилсульфату натрію агрегації молекул казеїнів. Це дозволяє досягти та мочевини та їх забарвлення проводили за мечіткого розділення білків у широкому діапазоні мотодом Леммлі. лекулярних мас не використовуючи градієнтний Електрофоретичне розділення білків проб когель, що значно спрощує процедуру електрофореров'ячого молока, соєвого молока та соєвого ізозу. ляту показало якісні відмінності їх білкового склаТакож запропоновано використовувати вер хду. Приклад пояснено Фіг.1, 2. ній буферний розчин рН 8,4, що містить трисгідроФіг.1 - Електрофореграма білків: позначення ксиметиламінометан у концентрації 0,033моль/дм 3 1- коров'яче молоко; позначення 2 - соєве молоко; та додецилсульфат натрію у концентрації 0,15% та позначення 3 - соєвий ізолят. нижній буферний розчин з рН 9,30-9,35, що місФіг.2 - Денситограма білків коров'ячого молотить трисгідроксиметиламінометан у концентрації ка, соєвого молока та соєвого ізоляту. 0,43±0,001моль/дм 3. Застосування таких буферних З наведених даних видно, що соєве молоко та розчинів забезпечує необхідний градієнт напруги соєвий ізолят мають ідентичний за молекулярними електричного поля протягом всієї процедури елекмасами склад білків. Склад білків молока відмінтрофорезу, що сприяє кращому розділенню білків. ний за молекулярними масами від соєвих білків. Електрофорез у поліакриламідному гелі у приЦе дозволяє визначати наявність білків сої у мосутності додецилсульфату натрію та мочевини лочних продуктах незалежно від виду соєвого проводять за методом Леммлі [Laeramli U.K. компоненту. Cleavage of structural proteins during the assembly of Електрофореграми білків коров'ячого молока the head of bacteriophage T4 // Nature, - 1970 - v.227 Фіг.1 позначення 1, соєвого молока Фіг.1 позна- P.680-685]. чення 2 та соєвого ізоляту Фіг.1 позначення 3 слуСпосіб дозволяє у молоці, молочних та комбігують еталоном для порівняння під час виявлення нованих продуктах виявляти наявність соєвих білнаявності соєвих домішок у молоці та молочних кових домішок, які складають не менше, ніж 0,3% продуктах. від загальної маси проби. Приклад 2. Приклад 1. Підготовка проби сиру кисломолочного, вигоПідготовка проби коров'ячого молока. У склятовленого з коров'ячого молока. У фарфоровій ний лабораторний стакан місткістю 100см 3 вносиступці розтирали 10г сиру кисломолочного. Знели 50см 3 коров'ячого молока. В молоко повільно жирювали пробу сиру органічним розчинником по краплях додавали 5% розчин НСl до появи плапетролейним або діетиловим ефіром, - тричі порстівців білка. Пробі давали відстоятись протягом ціями по 20см 3. Органічний розчинник з жиром 30-35хв., потім центрифугували упродовж 20-25хв. відкидали. Залишки органічного розчинника видаза кутовим прискоренням 5000-6000g. Суперналяли висушуванням білків під тягою за температутант після центрифугування проби коров'ячого ри 20-25°С. Сухі білки розтирали до однорідного молока зливали, а осаджені білки переносили у порошкоподібного стану. 7 83595 8 Підготовка проби сиру, виготовленого з соєвоДля аналізу були взяті супернатант після го молока. З сиром, виготовленим із соєвого молоцентрифугування коров'ячого молока з Прикладу 1 ка, проводили таку ж підготовку проби, як з сиром та супернатант після центрифугування рідкого кисломолочним, виготовленим з коров'ячого молокомбінованого продукту з суміші коров'ячого і соєка. вого молока з Прикладу 2. Підготовка проби рідкого комбінованого продуОдночасно з метою виявлення соєвих білків кту, ви готовленого з суміші коров'ячого і соєвого на електрофоретичну пластину наносили пробу молока. Рідкий комбінований продукт у кількості білків рідкого комбінованого продукту із суміші 50см 3 вносили у скляний лабораторний стакан коров'ячого і соєвого молока з Прикладу 2. місткістю 100см 3. У рідкий комбінований продукт Пластину з поліакриламідного гелю, верхній та повільно по краплях додавали 5% розчин НСl до нижній буферні розчини готували аналогічно Припояви пластівців білка. Пробі давали відстоятись кладу 1. Електрофоретичне розділення білків у протягом 30-35хв., потім центрифугували упрополіакриламідному гелі в присутності додецилсудовж 20-25хв. за кутовим прискоренням 5000льфату натрію та мочевини та їх забарвлення 6000g. Супернатант після центрифугування проби проводили за методом Леммлі. рідкого комбінованого продукту зливали, а осаПриклад 3 пояснено Фіг.5, 6. джені білки переносили у фарфорову ступку та Фіг.5 - Електрофореграма білків: позначення 7 тричі знежирювали органічним розчинником - пет- рідкий комбінований продукт з суміші коров'ячого ролейним або діетиловим ефіром, - порціями по і соєвого молока; позначення 8 - супернатант з 15см 3. Органічний розчинник з жиром відкидали. коров'ячого молока; позначення 9 - супернатант з Залишки органічного розчинника видаляли висурідкого комбінованого продукту. шуванням білків за кімнатної температури (20Фіг.6 - Денситограма білків супернатанту з ко25)°С під тягою. Сухі білки розтирали до однорідров'ячого молока, супернатанту з рідкого комбіноного порошкоподібного стану. ваного продукту, рідкого комбінованого продукту. Одержані знежирені білки сирів з коров'ячого З представлених Фіг.5 та 6 видно, що супернамолока, соєвого молока та білки рідкого комбінотант Фіг.5 позначення 8 з коров'ячого молока та ваного продукту наносили на електрофоретичну супернатант Фіг.5 позначення 9 з рідкого комбінопластину. ваного продукту мали однаковий білковий склад Пластину з поліакриламідного гелю, верхній та незалежно від складу ви хідної сировини. Білковий нижній буферні розчини готували аналогічно Присклад супернатантів повністю відрізнявся за молекладу 1. Електрофоретичне розділення білків у кулярними масами від складу білків рідкого комбіполіакриламідному гелі в присутності додецилсунованого Фіг.5 позначення 7 продукту, о триманого льфату натрію та мочевини та їх забарвлення після осадження розчином 5% НСl з суміші коропроводили за методом Леммлі. в'ячого та соєвого молока. Супернатант Фіг.5 поПриклад 2 пояснено Фіг.3, 4. значення 9 з рідкого комбінованого продукту не Фіг.3 - Електрофореграма білків: позначення 4 містив білків сої. - сиру кисломолочного з коров'ячого молока, поАналіз електрофореграм супернатантів Фіг.5 значення 5 - сиру з соєвого молока, позначення 6 позначення 8 та Фіг.5 позначення 9 свідчить, що рідкого комбінованого продукту з суміші коров'ячозапропоноване осадження 5% розчином НСl білків го і соєвого молока. молока, рідких молочних та комбінованих продукФіг.4 - Денситограма білків сиру кисломолочтів призводить до повного переходу в осад соєвих ного, виготовленого з коров'ячого молока, сиру, білків за їх наявності. виготовленого з соєвого молока, рідкого комбіноТаким чином, заявлений спосіб виявлення наваного продукту з суміші коров'ячого та соєвого явності соєвих білків у молоці та молочних продукмолока. тах методом електрофорезу у поліакриламідному На електрофореграмі білків рідкого комбіновагелі в присутності додецилсульфату натрію та моного Фіг.3 позначення 6 продукту крім смуг молоччевини є ефективним та зручним для якісного виних білків виявлено смуги, притаманні білкам сої, явлення домішок соєвих білків. Цей спосіб дозвощо на денситограмі представлено відповідними ляє проводити виявлення соєвих білків незалежно піками. від масової частки жиру у продукті. Цей спосіб не Приклад 3. вимагає складної апаратурної бази та реактивів, Для визначення повноти осадження соєвих біщо мають високу вартість. Спосіб дозволяє у молків розчином 5% НСl з рідких молочних та комбілоці, рідких молочних та комбінованих продуктах, нованих продуктів, проводили електрофоретичне а також сирах виявляти наявність соєвих білкових розділення білків супернатантів. домішок, які складають не менше, ніж 0,3% від загальної маси проби. 9 83595 10 11 Комп’ютерна в ерстка О. Гапоненко 83595 Підписне 12 Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601