Спосіб гістохімічного визначення нейтральних ліпідів у м’ясі забійних тварин, птиці та м’ясопродуктах

Реферат: Спосіб гістохімічного визначення нейтральних ліпідів у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах. Від проби м'яса та м'ясопродуктів у кількості 50-60 г нарізають зрізи у кількості 2-4 на заморожувальному мікротомі, товщиною 10-15 мкм, наклеюючи їх на предметні скельця за допомогою суміші яєчного білка і гліцерину у співвідношенні 1:1 упродовж 30-35 хв, у подальшому застосовуючи розчин етанолу з масовою концентрацією 70 % для закріплення зрізів упродовж 3-4 хв та фарбування їх у розчині кислотного оранжевого міцного з масовою концентрацією 0,6 % упродовж 10-11 хв, у подальшому витримуванні зрізів розчином етанолу з масовою часткою 70 % упродовж 2-3 хв, промиваючи дистильованою водою упродовж 5-6 хв, потім зрізи дофарбовують гематоксиліном Караці упродовж 5-6 хв, з наступним промиванням у дистильованій воді упродовж 10-11 хв та заведенням у гліцериновий гель і подальшим х розгляданням препаратів під світловим мікроскопом з об'єктивом зі збільшенням 40 і окуляром х - зі збільшенням 10 і виявленням відкладень нейтральних ліпідів оранжево-червоного кольору. UA 109389 U (12) UA 109389 U UA 109389 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до сільського господарства, зокрема до ветеринарної медицини, і може бути використана для гістохімічного визначення нейтральних ліпідів у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах при встановленні їх якості у виробничих лабораторіях на потужностях з переробки, реалізації і зберіганні м'яса та м'ясопродуктів, у патоморфологічних відділах державних лабораторіях ветеринарної медицини. За результатами цього методу можна отримати якісні показники при гістохімічному визначенні нейтральних ліпідів у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах. Аналогом корисної моделі є спосіб визначення глікогену за методом А. Л. Шабадаша [1], який базується на визначенні глікогену при застосуванні нейтральних фіксуючих рідин - розчину етанолу та розчину калію перйодату, що діють на ферментні системи, запобігаючи тим самим швидкому посмертному розпаду глікогену. Недоліком даного методу є те, що він громіздкий та дає похибку від 25 до 45 %. Прототипом корисної моделі є спосіб визначення нейтральних ліпідів [2], у якому застосовують спиртовий розчин судану III з масовою концентрацією 0,5 %. Недоліком даного методу є те, що розчин Судану III не придатний для довготривалого зберігання. Крім цього даний метод дає похибку у 15-20 %. В основу корисної моделі поставлено задачу - розробити спосіб гістохімічного визначення нейтральних ліпідів у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах шляхом застосування розчину етанолу з масовою концентрацією 70 % для закріплення зрізів м'язової тканини та м'ясопродуктів упродовж 3-4 хвилин та фарбування їх у розчині кислотного оранжевого міцного з масовою концентрацією 0,6 % упродовж 10 11 хв., у подальшому витримуванні зрізів м'яса та м'ясопродуктів у розчині етанолу з масовою часткою 70 %, упродовж 2-3 хв. у дистильованій воді упродовж 5-6 хв., потім зрізи дофарбовують гематоксиліном Караці упродовж 5-6 хв., з наступним промиванням у дистильованій воді упродовж 10-11 хв. та заведенням в гліцериновий гель і подальшим розгляданням препаратів під світловим мікроскопом і виявленням відкладень нейтральних ліпідів оранжево-червоного кольору. Задача вирішується тим, що використовують проби м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів у кількості 50-60 г, від яких нарізають зрізи у кількості 2-4, виготовлені на заморожувальному мікротомі, товщиною 10-15 мкм (мікрометрів), які наклеюють на предметні скельця за допомогою суміші яєчного білка і гліцерину в співвідношенні 1:1 і витримують упродовж 30-35 хв. за кімнатної температури (20±2 °C) і, використовуючи хімічний посуд з відповідними реактивами, послідовно фарбують отримані препарати: - переносять зрізи у розчин етанолу з масовою концентрацією 70 % на 3-4 хв.; - фарбують зрізи у розчині кислотного оранжевого міцного з масовою концентрацією 0,6 % упродовж 10-11 хв. Склад фарби: кислотний оранжевий червоний - 0,6-0,7 г; розчин етанолу з 3 масовою концентрацією 96 % - 70-71 см ; розчин натрію гідроксиду з масовою концентрацією 3 3 10 % - 10-11 см ; вода дистильована 10-11 см . Фарбу кип'ятять 11,5 хв. і фільтрують через фільтрувальний папір; - витримують препарати у розчині етанолу з масовою часткою 70 % упродовж 2-3 хв.; - промивають зрізи у дистильованій воді упродовж 5-6 хв.; - дофарбовують зрізи у розчині гематоксиліну Караці упродовж 5-6 хв.; - промивають зрізи у дистильованій воді упродовж 10-11 хв.; - заводять зрізи у гліцериновий гель: на поверхню зрізів наносять І краплю гліцеринового гелю, зверху кладуть покривне скельце і притискають його вантажем. Пофарбовані препарати х розглядають під світловим мікроскопом з об'єктивом зі збільшенням 40 і окуляром - зі х збільшенням 10 . У кожному зрізі виявляють відкладення нейтральних ліпідів, зафарбовані в оранжево-червоний колір. Етапи вирішення даної задачі наведено у нижчезазначених прикладах. Приклад 1. Для розробки методу використовують проби м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів у кількості 100-120 г, від яких нарізають зрізи у кількості 4-6, що виготовлені на заморожу вальному мікротомі, товщиною 10-15 мкм (мікрометрів), які наклеюють на предметні скельця за допомогою суміші яєчного білка і гліцерину в співвідношенні 1:1 і витримують упродовж 40-45 хв. за кімнатної температури (20±2 °C) і, використовуючи хімічний посуд з відповідними реактивами, послідовно фарбують отримані препарати: - переносять зрізи у розчин етанолу з масовою концентрацією 60 % на 6-8 хв.; - фарбують зрізи у розчині Судану III з масовою концентрацією 0,5 % упродовж 20-21 хв.; - витримують зрізи у розчині етанолу з масовою часткою 60 % упродовж 6-8 хв.; - промивають зрізи у дистильованій воді упродовж 1-3 хв.; - дофарбовують зрізи у розчині гематоксиліну Караці упродовж 6-8 хв.; - промивають зрізи у дистильованій воді упродовж 5-6 хв.; 1 UA 109389 U 5 10 15 20 25 - заводять зрізи у гліцериновий гель: на поверхню зрізів наносять 1 краплю гліцеринового гелю, зверху кладуть покривне скельце і притискають його вантажем. Пофарбовані препарати розглядають під світловим мікроскопом з об'єктивом зі збільшенням х х 40 і окуляром - зі збільшенням 10 . У кожному зрізі виявляють відкладення нейтральних ліпідів, зафарбовані в оранжево-червоний колір. Приклад 2. Для розробки методу використовують проби м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів у кількості 80-100 г, від яких скельця за допомогою суміші яєчного білка і гліцерину у співвідношенні 1:1 і витримують упродовж 30-35 хв. за кімнатної температури (20±2 °C) і, використовуючи хімічний посуд з відповідними реактивами, послідовно фарбують отримані препарати: - переносять зрізи у розчин етанолу з масовою концентрацією 70 % на 3-4 хв.; - фарбують зрізи у розчині кислотного оранжевого міцного з масовою концентрацією 0,6 % упродовж 10-11 хв. Склад фарби: кислотний оранжевий червоний - 0,6-0,7 г; розчин етанолу з 3 масовою концентрацією 96 % - 70-71 см ; розчин натрію гідроксиду з масовою концентрацією 3 3 10 % - 20-21 см ; вода дистильована 10-11 см . Фарбу кип'ятять 1-1,5 хв. і фільтрують через фільтрувальний папір; - витримують зрізи у розчині етанолу з масовою часткою 70 % упродовж 2-3 хв.; - промивають зрізи у дистильованій воді упродовж 5-6 хв.; - дофарбовують зрізи у розчині гематоксиліну Караці упродовж 5-6 хв.; - промивають препарати у дистильованій воді упродовж 10-11 хв.; - заводять препарати зі зрізами у гліцериновий гель: на поверхню зрізів наносять 1 краплю гліцеринового гелю, зверху кладуть покривне скельце і притискають його вантажем. Пофарбовані препарати розглядають під світловим мікроскопом з об'єктивом зі збільшенням х х 40 і окуляром - зі збільшенням 10 . У кожному зрізі виявляють відкладення нейтральних ліпідів, зафарбовані в оранжево-червоний колір. Порівняльна оцінка результатів випробування вищезазначених способів гістохімічного визначення нейтральних ліпідів у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів до прототипу наведені у таблиці 1. Таблиця 1 Порівняння способів гістохімічного визначення нейтральних ліпідів у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів до прототипу № п/ Показники, що порівнюються Складові методу: Застосування приладу Прототип заморожувальний мікротом 100,0 4-6 1 Приклади 2 3 заморожузаморожузаморожувальний вальний вальний мікротом 100мікротом 80-100 г мікротом 50-60 г 120 4-6 6-8 2-4 Кількість м'яса, м'ясопродуктів, г 1. Кількість зрізів Фіксування на предметних яєчного білка і яєчного білка і скельцях сумішшю зі гліцерину 1:1 гліцерину 1:1 співвідношенням Час фіксування зрізів, хв. 30-40 40-45 Закріплення зрізів в розчині етанолу 50 60 2. концентрація, % експозиція, хв. 5 6-8 30 2 яєчного білка і гліцерину 1:1 яєчного білка і гліцерину 1:1 35-40 30-35 80 70 5-6 3-4 UA 109389 U Продовження таблиці 1 Фарбування нейтральних ліпідів концентрація, % 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. спиртовий розчин Судану III 0,5 % Експозиція фарбування, 30 хв. Приготування фарби: кислотний оранжевий червоний, г 3 розчин етанолу 96 %, см розчин натрію гідроксиду, 3 см концентрація, % 3 вода дистильована, см Експозиція кип'ятіння фарби, хв. Витримування зрізів розчином етанолу Концентрація, % 50 Експозиція, хв. 2 Експозиція промивання 5 дистильованою водою, хв. Дофарбовування зрізів гематоксифарбою ліном Караці Експозиція, хв. 5 Експозиція промивання зрізів у дистильованій воді, 1 хв. Експозиція промивання зрізів у водопровідній воді, 5 хв. Експозиція промивання зрізів у дистильованій воді, 1 хв. Заведення під покривне гліцериновий скельце гель збільшення х Мікроскопія препаратів під 40 ; окуляр зі світловим мікроскопом збільшенням х 10 Інтенсивність кольору відкладень нейтральних оранжевий ліпідів Швидкість визначення 1 год. 30 хв. досліду, год./хв. 1 год. 40 хв. Стабільність показників по гістохімічному визначенню 71,2 нейтральних ліпідів у м'ясі, м'ясопродуктах, % спиртовий розчин кислотною розчин Судану оранжевого III 0,5 % міцного 1,0 % розчин кислотного оранжевого міцного 0,6 % 20-21 10-11 10-11 1,0-1,1 0,6-0,7 70-71 70-71 20-21 20-21 10,0 10-11 10,0 10-11 0,5-1 1-2 60 6-8 80 5-6 70 2-3 1-3 6-8 5-6 гематоксиліном Караці 6-8 гематоксиліном Ерліха 5-6 гематоксиліном Караці 5-6 5-6 8-9 10-11 гліцериновий гліцериновий гліцериновий гель гель гель збільшення х x збільшення 40 ; збільшення 40 х 40 ; окуляр зі окуляр зі окуляр зі збільшенням х х збільшенням 10 збільшенням 10 х 10 оранжевочервоний червоний 1 год. 20 хв. - 1 1 год. 20 хв. - 1 год. 30 год. 40 хв. 80,5 3 79,2 оранжевочервоний 1 год. - 1 год. 20 хв. 99,2 UA 109389 U Продовження таблиці 1 % співвідношення результатів гістохімічних 13. досліджень до виявлення загального білка у м'ясі % співвідношення результатів гістохімічних 14. досліджень до виявлення загального жиру у м'ясі 5 10 81,0-82,5 82,0-83,5 86,3-87,0 96,5-98,9 80,5-82,0 83,5-85,2 85,5-87,4 96,8-98,4 Дані таблиці 1 свідчать, що більш достовірні дані, порівняно із результатами гістохімічних досліджень до виявлення загального білка у м'ясі - у 96,5-98,9 % [3] та до результатів гістохімічних досліджень до виявлення загального жиру у м'ясі - у 96,8-98,4 % [4], були отримані при застосуванні методу за прикладом № 3. Також найвища стабільність показників по гістохімічному визначенню нейтральних ліпідів у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах була за прикладом № 3-99,2 %. Використовуючи метод за прикладом № 3, ми провели гістохімічне визначення нейтральних ліпідів у м'ясі забійних тварин та птиці на 27 пробах: м'ясо яловичини - 6 проб; м'ясо свинини - 5 проб; м'ясо баранини - 5 проб; м'ясо козлятини - 4 проби; м'ясо курей - 7 проб. Попередньо проби м'яса забійних тварин і птиці були досліджені на виявлення загального білка та загального жиру гістохімічними методами. Результати наведені у таблиці 2. Таблиця 2 Показники гістохімічних методів визначення якості м'яса забійних тварин, птиці та визначення нейтральних ліпідів за прикладом № 3 Гістохімічні дослідження м'яса Види м'яса забійних тварин №/№ і птиці 1. 2. 3. 4. М'ясо яловичини, n=6 М'ясо свинини, n=5 М'ясо баранини, n=5 М'ясо козлятини, n=4 5. М'ясо курей, n=7 Виявлення загального білка Виявлення загального жиру Виявлення нейтральних ліпідів за прикладом № 3 Утворення забарвлення червонуватооранжевого кольору Утворення забарвлення оранжевого кольору Утворення забарвлення червонувато-жовтооранжевого кольору Утворення забарвлення оранжевочервоного кольору 15 20 Також ми провели гістохімічне визначення нейтральних ліпідів у м'ясопродуктах на 20 пробах: ковбаса варена - 4 проби; ковбаса варено-копчена - 4 проби; ковбаса копчена - 5 проб; ковбаса сирокопчена - 4 проби; балик м'ясний - 3 проби. Попередньо проби м'ясопродуктів були досліджені на виявлення загального білка та загального жиру гістохімічними методами. Результати наведені у таблиці 3. 4 UA 109389 U Таблиця 3 Показники гістохімічних методів визначення якості м'ясопродуктів та визначення нейтральних ліпідів за прикладом № 3 №/№ Види м'ясопродуктів 1. 2. 3. 4. 10 15 20 25 30 Ковбаса сирокопчена, n=4 5. 5 Ковбаса варена, n=4 Ковбаса варено-копчена, n=4 Ковбаса копчена, n=5 Балик м'ясний, n=3 Гістохімічні дослідження м'ясопродуктів Виявлення Виявлення Виявлення нейтральних загального білка загального жиру ліпідів за прикладом №3 Утворення забарвлення Утворення червонуватоУтворення забарвлення оранжевого забарвлення червонуватокольору оранжевожовточервоного Утворення оранжевого кольору забарвлення кольору оранжевого кольору Проведеними дослідженнями встановлено, що при фарбуванні м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів за розробленим способом, на пофарбованих препаратах, які розглядали під х х світловим мікроскопом з об'єктивом зі збільшенням 40 і окуляром - зі збільшенням 10 , виявляли відкладення нейтральних ліпідів оранжево-червоного кольору. Ці дані були стабільними та достовірними, отже, ці показники можна використовувати при якісному оцінюванні м'яса забійних тварин, птиці та м'ясопродуктів. Крім цього, слід зазначити, що метод є експресним, простим у виконанні, а його результати дають конкретні якісні показники по інтенсивності фарбування відкладень нейтральних ліпідів у оранжево-червоний колір. Метод за прикладом № 3 нами пропонується як якісний спосіб гістохімічного визначення нейтральних ліпідів у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах поряд з іншими методами визначення їх якості (масова частка води, масова частка білка, масова частка жиру тощо) [5]. Метод має перевагу перед існуючими якісними методами визначення доброякісності м'яса та м'ясопродуктів тому, що результати мають достовірні показники по інтенсивності забарвлення. Джерела інформації: 1. Шабадаш А.Л. Рациональная методика гистохимическою обнаружения гликогена и ее теоретическое обоснование / А.Л. Шабадаш // Изв. АН СССР. Серия биологических наук. – 1947. - № 6. - С. 745-760. 2. Омеляненко Μ.Μ. Основи патогістологічних досліджень: Методичні вказівки для студентів та лікарів ветеринарної медицини / Μ.Μ. Омеляненко, Л.М. Потоцька. - К., 2013. - 137 с. 3. Шубич М.Г. Гликопротеины и протеогликаны. Принципы их гистохимического анализа / М.Г. Шубич, Г.М. Могильная // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1979. - Т. 77. - № 8. С. 92-99. 4. Шубич М.Г. Методика гистохимического обнаружения общего жира / М.Г. Шубич // Αрх. анатомии, гистологии и эмбриологии. - 1963. - Т. 44. - № 6. - С. 114-116. 5. Богатко Н.М. Біохімічні та мікроскопічні дослідження м'яса і м'ясопродуктів за визначення їх ветеринарно-санітарної оцінки: Методичні рекомендації для слухачів ІПНКСВМ, студентів та магістрантів ФВМ / Н.М. Богатко, О.Ю. Голуб, Д.Л. Богатко та ін. - Біла Церква, 2012. - 63 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 Спосіб гістохімічного визначення нейтральних ліпідів у м'ясі забійних тварин, птиці та м'ясопродуктах, який відрізняється тим, що від проби м'яса та м'ясопродуктів у кількості 50-60 г нарізають зрізи у кількості 2-4 на заморожувальному мікротомі, товщиною 10-15 мкм, наклеюючи їх на предметні скельця за допомогою суміші яєчного білка і гліцерину у співвідношенні 1:1 упродовж 30-35 хв, у подальшому застосовуючи розчин етанолу з масовою концентрацією 70 % для закріплення зрізів упродовж 3-4 хв та фарбування їх у розчині кислотного оранжевого міцного з масовою концентрацією 0,6 % упродовж 10-11 хв, у 5 UA 109389 U 5 подальшому витримуванні зрізів розчином етанолу з масовою часткою 70 % упродовж 2-3 хв, промиваючи дистильованою водою упродовж 5-6 хв, потім зрізи дофарбовують гематоксиліном Караці упродовж 5-6 хв, з наступним промиванням у дистильованій воді упродовж 10-11 хв та заведенням у гліцериновий гель і подальшим розгляданням препаратів під світловим х х мікроскопом з об'єктивом зі збільшенням 40 і окуляром - зі збільшенням 10 і виявленням відкладень нейтральних ліпідів оранжево-червоного кольору, склад фарби: кислотний 3 оранжевий міцний - 0,6-0,7 г; розчин етанолу з масовою концентрацією 96 % - 70-71 см ; розчин 3 3 натрію гідроксиду з масовою концентрацією 10 % - 20-21 см ; вода дистильована 10-11 см , фарбу кип'ятять 1-1,5 хв і фільтрують через фільтрувальний папір. 10 Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6