Спосіб визначення вмісту гістидинвмісних дипептидів у м’ясі та м’ясних продуктах

Реферат: Спосіб визначення вмісту гістидинвмісних дипептидів (ГВД) у м'ясі та м'ясних продуктах. Після процедури екстракції ГВД розчином хлорної кислоти проби не піддають процедурі випарювання. Після додавання розчину натрію карбонату суміш не витримують протягом 10 хв., а дуже швидко переносять в кювету та проводять вимірювання екстинкції до максимального її значення, що значно скорочує час проведення дослідження. UA 112608 U (12) UA 112608 U UA 112608 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі лабораторної практики, а саме до визначення якості продукції тваринництва, і може бути застосована для покращення біологічної та екологічної безпеки. Серед азотвмісних компонентів, що визначаються в м'язових екстрактах, виділяють комплекс гістидинвмісних дипептидів (ГВД). У найбільшій кількості в м'язовій тканині сільськогосподарських тварин зазначені сполуки представлені карнозином (-аланіл-Lгістидином) і анзерином (Р-аланілметілгістіді ном) [1]. Не останню роль відіграють зазначені дипептиди в живому організмі. Карнозин здатний взаємодіяти з проміжними продуктами перекисного окислення ліпідів, знижуючи утворення перекисів; утворювати з супероксид-аніоном кисню комплекс з переносом заряду, знижуючи його активну концентрацію; ефективно нейтралізувати гідроксид-радикал, що перешкоджає пошкодженню мембранних ліпідів і білків в умовах окисного стресу. Анзерин гальмує накопичення кінцевого продукту перекисного окислення ліпідів - малонового діальдегіду. У середовищі з карнозином і анзерином максимальний рівень накопичення малонового діальдегіду знижується на 10-50 % [2]. Карнозин має значний потенціал як природний антиоксидант [3, 4]. У м'язовій тканини його міститься значно більше, ніж вітамінів С і Е [2]. Гістидинвмісні дипептиди знайдені виключно в тканинах тварин. Встановлено тканинну специфічність у розміщенні і накопиченні зазначених дипептидів. ГВД належать до класу біомаркерів, що використовуються для ідентифікації різних видів м'яса. Наприклад, наявність карнозину і анзерину досить специфічна в м'язах вівці, великої рогатої худоби, коней, кенгуру, курки, качки та індички. Вдалося встановити фальсифікат сирої свинини під телятину, базуючись на даних про вміст гістидинвмісні дипептидів у цих видах м'яса [5]. Також визнається вміст карнозину в продуктах харчування на предмет їх тваринного походження [6]. Гістидинвмісні дипептиди проявляють стимулюючу дію на травні залози, а також приймають участь у формуванні специфічного смаку і аромату м'яса [1, 7]. Відзначається їх високе збереження в процесі технологічної переробки м'ясної продукції. Вміст ГВД рекомендують використовувати для оцінки якості м'ясних виробів і визначення частки м'яса в ковбасному фарші [8]. В основу корисної моделі поставлена задача розробити методику визначення гістидинвмісних дипептидів у невеликої кількості біоматеріалу та створити алгоритм розрахунку вмісту ГВД в пробі. Поставлена задача вирішується тим, що дає змогу об'єктивно визначати вміст гістидинвмісних дипептидів в невеликій кількості біоматеріалу, що аналізуються. Аналогами запропонованого нами способу є хроматографічні методи визначення дипептидів шляхом на папері та у тонкому шарі. Прототипом нашого способу є метод визначення карнозину в безбілковому екстракті по діазореакції [9]. Суть корисної моделі пояснює креслення. На кресленні - інформаційна матриця побудови робочого графіку та розрахунку вмісту ГВД у пробі. У запропонованому нами способі для екстракції гістидинвмісних дипептидів використовують водний розчин хлорної кислоти який потім осаджується у вигляді нерозчинної солі, з подальшим центрифугуванням, в отриманому супернатанті за допомогою кольорової реакції з діазореактивом утворюється забарвлена сполука, кількість якої прямо пропорційна вмісту ГВД у досліджуваному розчині. Розрахунки вмісту ГВД у дослідженій пробі проводять з використанням вбудованої в EXEL функції "ПРЕДСКАЗ". Прилади і реактиви, що використовуються у запропонованому способі: ваги 4 класу точності, центрифуга на 5000 обертів, рН-метр, фотоелектроколориметр КФК-ЗМП, кювети з довжиною оптичного шляху 10 мм, гомогенізатор лабораторний (або порцелянова ступка з товкачиком), 3 3 колба мірна на 100 см , мірна пробірка на 10 см , центрифужні пробірки, великі цукрові пробірки, лід, кислота сульфанілова хімічно чиста (C 6H7NO3S), кислота хлороводнева концентрована хімічно чиста (НСl), кислота хлорна (НСlO 4) молярною концентрацією 0,5 3 моль/дм (ХЧ), свіжоприготовлений розчин натрію нітриту (NaNO 2) з масовою часткою 5 %, розчин калію гідроокису (KОН) з масовою часткою 33 %, розчин натрію карбонату (Nа2СО3) з масовою часткою 10 %, дистильована вода. Дозволяється використовувати інші засоби вимірювальної техніки, допоміжне обладнання, реактиви та матеріали, які за характеристиками і якістю не гірше зазначених. Приготування реактивів. 3 Розчин сульфанової кислоти - 0,9 г сульфанілової кислоти розчиняють в 9 см концентрованої НСl і доводять об'єм дистильованою водою до 100 см. Отриманий розчин 1 UA 112608 U 5 10 15 20 25 30 необхідно тримати на холоді. Розчин діазотованої сульфанілової кислоти - у мірну колбу 3 3 об'ємом 100 см , яка поставлена в льодяну баню, наливають 6 см розчину сульфанілової 3 кислоти, доливають 6 см свіжоприготованого розчину NaNO2, ретельно перемішують і 3 залишають на 5 хв.; після чого доливають ще 24 см розчину NaNC масовою часткою 5 % і 3 через 5 хв. доводять об'єм водою до 100 см . Щоразу готують свіжий розчин. Термін зберігання на льоду 5-6 годин. Реактив вважається правильно приготованим за відсутності утворення бурого газу при додаванні до сульфанілової кислоті натрію нітриту. Виконання цього способу проводять таким чином. Зразок м'яса або м'ясопродукту звільнити від жиру, сполучної тканини і подрібнити, після 3 чого відібрати наважку масою 1 г. Отриману наважку ретельно гомогенізувати з 5 см НСlO4 3 (допускається ретельне розтирання зразка у порцеляновій ступці з 5 см НСlO4). Отриманий гомогенат перенести в центрифужну пробірку і центрифугувати 20 хвилин при 5000 об./хв. Надосадову рідину злити в центрифужну пробірку. 3 До осаду додати і ретельно перемішати ще 1 см НСlO4. Центрифугувати 10 хвилин 5000 об./хв. Надосадову рідину долити до першої частини. До отриманої надосадової рідини додати по краплях KОН, довести рН до 7,0-8,0 (але не нижче 7,0), при цьому випаде білий осад нерозчинного калію перхлорату (KСlО 4). Отриману суміш перенести знову в центрифужні пробірки і центрифугувати 5 хвилин при 3000 об./хв. 3 Супернатант перелити в великі (цукрові) пробірки. Довести обсяг до 10 см дистильованою водою. 3 Додатково приготувати 1 пробірку з холостий пробою - 10 см дистильованої води. 3 Додати в кожну пробірку по 3 см діазореактиву і залишити на 5 хвилин. 3 Потім додати 3 см Na2CO3 і дуже швидко поставити кювету в ФЕК і спостерігати за екстинкцією до максимального значення. Вимірювання проводити при довжині хвилі 490 нм проти холостої проби. Розрахунок вмісту гістидинвмісних дипептидів проводять за попередньо побудованим графіком по гістидину. Для цього необхідно розчинити у воді 0,0027 г гістидину і довести до 3 об'єму 200 см . Потім в 10 пробірок необхідно додати речовини в кількостях, зазначених в таблиці 1. Таблиця 1 Склад робочих розчинів гістидину Об'єм розчину гістидину, см 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 35 40 45 3 Об'єм води, см 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5 7,0 6,5 6,0 5,5 5,0 3 Вміст гістидину, мкг Вміст гістидину, мкмоль 5 0,032 10 0,064 15 0,097 20 0,129 25 0,161 30 0,193 35 0,225 40 0,258 45 0,290 50 0,322 Потім проводять фарбування розчину за описаною вище методикою. За отриманими результатами екстинкції будують графік. Орієнтовно робочий графік може виглядати наступним чином (креслення). Розрахунки проводять з використанням вбудованої в EXEL функції "ПРЕДСКАЗ". Вона обчислює або пророкує майбутнє значення за існуючими значеннями. Отримане значення - це значення Y, відповідне заданому значенню X. Значення X і Y 2 відомі. Нове значення обчислюється з використанням лінійної регресії. Показник R побудованого калібрувального графіка повинен бути більшим або дорівнювати 0,95. У нашому випадку, не зважаючи на те, що одна з "точок" випала, він дорівнює 0,9792. Приклад використання описаної функції для розрахунку вмісту ГСД в підчеревному м'язі свиней показаний на кресленні. Так, отримана екстинція досліджуваного зразка 2,353, згідно з розрахунками, це 3,93 мкмоль гістидинвмісних дипептидів. Джерела інформації: 2 UA 112608 U 5 10 15 20 1. Лисицын А. Теория и практика переработки мяса /А.Лисицын. - М: ВНИИМП, 2006. -391 с. 2. Болдырев А. Гистидин-содержащие дипептиды возбудимых тканей /А. Болдырев. -М.: Биоинформсервис, 2004. - С. 26-41. 3. Бабижаев М.А. Na-ацетилкарнозин - природный гистидин, содержащий дипептид как антиоксидант для офтальмологического применения [Электронный ресурс] /М.А. Бабижаев, В.К Ермакова, Ю.А. Семилетов, A.M. Деев - Режим доступа: www.ethosrussia.ru/pdf/articlelO.pdf (03.03.2013). 4. Беляев М.С. Карнозин как фактор эндоэкологичской защиты организма от повреждений, вызванных окислительным стрессом: автореф. дис. … канд. биол. наук: 03.00.16, 03.00.04 /Михаил Сергеевич Беляев. - М., 2008. -23 с. 5. Qinchum R. Monoclonal antibody-based sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of mammalian meat in meat and feed products: thesis … master of science /Qinchum Rao. Florida, 2004. - 70 p. 6. Аналитическая характеристика карнозина /Д.А. Фадеева [и др.] //Научные ведомости. Серия Медицина. Фармация. - 2010. - № 22 (93). - Выпуск 12. - С. 179-184. 7. Физико-химические и биохимические основы технологии мяса и мясопродуктов. Справочник. -М.: Пищевая промышленность, 1973. - С. 60-99. 8. Храмов В.А. Определение карнозина в мясе и мясных продуктах /В.А. Храмов, Е.Ю. Турина //Мясная индустрия. - 2007. - № 7 (июль). - С. 65-66. 9. Антипова Л.В. Методы исследования мяса и мясных продуктов /Л.В. Антипова, И.А. Глотова, И.А. Рогов. - М.: Колос, 2001. - 376 с. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Спосіб визначення вмісту гістидинвмісних дипептидів (ГВД) у м'ясі та м'ясних продуктах, який відрізняється тим, що після процедури екстракції ГВД розчином хлорної кислоти проби не піддають процедурі випарювання; після додавання розчину натрію карбонату суміш не витримують протягом 10 хв., а дуже швидко переносять в кювету та проводять вимірювання екстинкції до максимального її значення, що значно скорочує час проведення дослідження. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3