Штам бактерій lactobacillus delbrueckii для оброблення бджолиного пилку

Реферат: Винахід стосується штаму бактерій Lactobacillus delbrueckii KKP 1645р та його використання для обробки бджолиного пилку. UA 114350 C2 (12) UA 114350 C2 UA 114350 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Об'єктом даного винаходу є новий штам бактерії Lactobacillus delbrueckii. Винахід використовується у харчовій промисловості. Відомі штами Lactobacillus delbrueckii, які гідролізують цукор, виробляючи молочну кислоту, однак вони не в змозі гідролізувати цукор у суслах з високим осмотичним тиском. Для більшості бактерій більш високий осмотичний тиск є фактором, що стримує ріст. Високий осмотичний тиск медового сусла, так само, як присутність протигрибкових і антибактеріальних композицій, призводить до стримування росту більшості мікроорганізмів. Відповідно до класичної систематики Orla-Jensen, бактерії різновидів Lactobacillus можуть виробляти молочнокислі дисахариди та моносахариди у формі D (-) та L (-) ізомеру. У рівні техніки є потреба в додаткових штамах молочнокислих бактерій, що мають відношення до корисних властивостей певних типів бактерій, що ферментують молочну кислоту, здатних гідролізувати цукор при високому осмотичному тиску, виробляючи молочну кислоту. Мета винаходу полягала в отриманні нового штаму роду Lactobacillus, здатного виживати при високому осмотичному тиску та способу для виробництва бджолиного пилку із використанням штаму, що матиме довгий термін зберігання через наявність молочної кислоти. Першим об'єктом Винаходу є штам бактерії Lactobacillus delbrueckii, депозитований в Колекції Культур Промислових Мікроорганізмів в Інституті Сільськогосподарської та Продовольчої Біотехнології у Варшаві під номером KKP 1645 р. Другим об'єктом винаходу є використання штаму, визначеного у першому об'єкті винаходу, для оброблення бджолиного пилку. Третім об'єктом винаходу є бджолиний пилок, який відрізняється тим, що містить штам бактерії, визначений у першому об'єкті винаходу. Штам бактерії Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р був отриманий шляхом відділення монокультури бактерії з природного бджолиного пилку, витягнутого із рамок вулика на заключних етапах ферментації. Бджолиний пилок був витягнутий із стільників та розміщений у 3 10 см рідини MRS середовища. Він був інкубований 48 годин при 25°C, 30°C і 37°C у жорстко анаеробних та аеробних умовах. Усі перевірені зразки були десятикратно розведені, з чого на тверде живильне середовище агарового MRS були взяті 100 мкл культур бактерій. Вони були інкубовані 24-72 години при 25°C, 30°C і 37°С у жорстко анаеробних та аеробних умовах. Після цього багатократно відбиралися бактерії. Відбирання та наступна адаптація до нових умов росту відбувалася на поживному середовищі із глюкозою, фруктозою, крохмалем та сахарозою як єдиних джерел вуглецю та у медових суслах із щільністю 7, 15, 30, 40, 45 та 50°BIg, Як результат, був отриманий новий штам із наступними характеристиками: - морфологічною - колонії бактерій, вирощені на твердому поживному середовищі MRS агар у строго анаеробних умовах, мають овальну форму, злегка опуклі, молочного кольору з правильними краями й приблизно 1 мм у розмірі; молоді колонії є кремового кольору, а більш старі набувають іржавого відтінку. Під мікроскопом бактерії виглядають у формі поодиноких або груп коротких, зігнутих прутів. Вони не виробляють ендоспор. Вони є Грам +, та каталазанегативними. - фізіологічною та біохімічною - оптимальна температура для росту штаму 30°C-37°C. Ніякого росту не відбувається у порогових температурах 25°C та 45°С. Було визначено, що новий штам, подібно до інших штамів різновидів Lactobacillus delbrueckii, відповідно до тесту bioMerieux API (АРІ 50 CHL) здатен ферментувати наступні цукри: D-глюкозу, D-фруктозу, сахарозу, трегалозу, глюконат. Крім того, несподівано виявилось, що цей штам ферментує крохмаль. Відповідно до прийнятої мети винаходу, новий штам бактерії Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р має дуже високий осмотичний опір, тобто здатність виживати в концентраціях до 50°BIg. Несподівано виявилося, що цей штам гідролізує крохмаль із виробництвом молочної кислоти. Новий штам Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р не має еквіваленту серед відомого роду Lactobacillus, щоб розкладати медове сусло та крохмаль. Ілюстративні застосування винаходу показані на діаграмі, де фіг. 1 показує ріст бактерії Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р при рості на медових суслах, фіг. 2 показує поведінку пилку та контрольне випробування медового сусла в умовах обмеженого доступу кисню й температурі 30°C, фіг. 3 зображує поведінку ходу ферментації пилку з медовим суслом із 50% інокуляту бактерії L. delbrueckii subsp. delbrueckii № 2 KKP 1645 р в умовах обмеженого доступу кисню й температурі 30°C. Приклад 1 Діапазон випробувань включав ріст живої бактерії Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р у рідкому MRS середовищі з 2% фруктозою більш ніж 24 години при 25°С, 30°C, 37°C ί 45°C 1 UA 114350 C2 (таблиця 1). У цьому випробуванні не спостерігалося жодного росту бактерій ферментації молочної кислоти лише при 25°C та 45°С. Таблиця 1 Вплив температури на ріст бактерій Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р Температура інкубації 25°C 30°C 37°C 45°С 5 KKP 1645 + + Приклад 2 Діапазон випробувань включав ріст живої бактерії Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р у рідкому MRS середовищі з 2% фруктозою, що містило різні добавки NaCl (0.5-12%) більш ніж 24 години при температурі 37°C (Таблиця 2). Це випробування не виявило суттєвого впливу NaCl на ріст бактерій, що ферментують молочну кислоту. 10 Таблиця 2 Вплив концентрацій NaCl на штам Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р Концентрація NaCl (%) 0.5 5 3 10 12 15 KKP 1645 + + + + + Приклад 3 Діапазон випробувань включав ріст живої бактерії Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р у рідкому MRS середовищі з 2% фруктозою при рН 4.0, 5.5, 6.5, 7.5, 8.0 більш ніж 24 години при температурі 37°С (Таблиця 3). У цьому випробуванні лише при рН 4,0 не спостерігалося ніякого росту бактерій, що ферментують молочну кислоту. Таблиця 3 Вплив рН, штам Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р рН фактор 4 5.5 6.5 7.5 8 20 25 KKP 1645 + + + + Приклад 4 Ріст живої бактерії Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р у MRS середовищі з 2% фруктозою й витриманої при температурі 37°C 24 години. Здатність виробляти молочну кислоту була визначена шляхом проведення процесу ферментації на рідкому середовищі, що містить глюкозу, фруктозу, сахарозу, крохмаль, лактозу як єдине джерело вуглецю на медових суслах 7°BIg, 15°BIg, 30°BIg при температурі 37°C. На середовища для біосинтезу молочної кислоти були пересаджені 10% культур. Біосинтез молочної кислоти проходить в обертовому шейкері при 150 об/хв у плоскодонних колбах 500 2 UA 114350 C2 3 3 см , що містять 100 см середовища для ферментації. Температура росту була 37°C для 72 годин. Таблиця 4 демонструє результати проведеного біосинтезу молочної кислоти новим штамом Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p. 5 Таблиця 4 Результати проведеного біосинтезу молочної кислоти (72 години) штамом Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р Середовище Фруктоза Глюкоза Сахароза Крохмаль 7° BIg медове сусло 15° BIg медове сусло 30° BIg медове сусло 10 15 20 25 Кількість молочної кислоти в г/100 см рідини D (+) форма L (-) форма 2.9 0.8 3.7 0.3 3.8 0.2 2.1 1.8 4.5 0.14 4.3 0.22 3.9 0.31 3 Зниження цукру виражене в глюкозі [%] 0.1 0.17 0.75 0.1 1.98 2.11 11.62 Приклад 5 У OD (оптична система щільності) було виявлено вплив сусла на ріст бактерій. Поширення 3 бактерій відбувалося після пересадження на рідке середовище для росту 1 см 24 годинних бактерій росту Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p. Було виконано визначення оптичної щільності, щоб визначити ріст бактеріальної клітини на 7, 15, 30, 40, 45 і 50°BIg медового сусла (таблиця 5). Виміри OD були виконані, використовуючи спектрофотометр при довжині хвилі  = 550 нм. Порівнюючи із відомими штамами роду Lactobacillus, ріст біомаси для штаму Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р на медових суслах значно вищий. Новий штам Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р є стійким до більш високих концентрацій цукру - має високу осмотичну стійкість у порівнянні з іншими бактеріями, що ферментують молочну кислоту. Ріст бактерії Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р на медових суслах показаний на фіг. 1. Приклад 6 Визначення антагоністичних властивостей штаму Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 p. Випробування на антагонізм між штамами було виконане крапельним методом (Klewicka E. та ін, 1999. Антагоністична активність бактерії Lactobacillus acidophilus, що ферментує молочну кислоту. Їжа. Наука. Технологія. Якість). Це викликає навіть ріст контрольних та перевірених штамів. Група контрольних мікроорганізмів склала Bacillus cereus KKP 358, Listeria mоnocytogenes KKP 1170, Salmonella sp. KKP 996, Pseudomonas aeruginosa KKP 161, Escherichia coli KKP 364, Serratia liquefaciens KKP 1665, Staphylococcus aureus KKP 1497, Staphylococcus saprophyticus KKP 1493. Ці бактерії походять з Колекції культур Промислових Мікроорганізмів IAFB. Результати випробувань антагоністичних властивостей штаму показані у таблиці 5. 3 UA 114350 C2 Таблиця 5 Антагоністична реакція штаму Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р у порівнянні із контрольною бактерією Контрольний штам Serratia liquefaciens KKP 1665 Escherichia coli KKP 364 Salmonella sp. KKP 996 Listeria monocytogenes KKP 1170 Pseudomonas aeruginosa KKP 161 Staphylococcus aureus KKP 1497 Staphylococcus saprophyticus KKP 1493 Bacillus cereus KKP 358 5 10 Діаметр зони пригнічення (в мм) 19 19 19 23 17 20 17 21 Культури Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р були розміщені на твердому агаризованому поживному середовищі MRS у формі крапель 5 мкл та після 24 годин Інкубації при 37°С поверхня була заповнена газоном, що містив 108 КУО/мл контрольних штамів. Тоді середовище було знов інкубоване 24 години при 37°С, Після інкубації з'явилася зона пригнічення контрольної бактерії навкруги колоній молочнокислої бактерії з її діаметром у мм, прийнятому як вимір антагонізму. Приклад 7 Щоб характеризувати відібрану молочнокислу бактерію Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р, аналіз стійкості до антибіотиків був виконаний тестом KB, використовуючи живильне середовище MRS агар та розчин Blickfeldt з СаСО3 (таблиця 6). Таблиця 6 Результати випробувань антибіотичної резистентності штаму Lactobacillus delbrueckii KKP 1645 р (діаметр зони пригнічення в мм) Антибіотик Ампіцилін Пеніцилін Стрептоміцин Еритроміцин 15 20 25 MRS середовище 40 48 0 34 Середовище Blickfeldt з СаСО3 37 48 17 37 Приклад 8 Щоб перевірити можливість використання штаму бактерії відповідно до винаходу, для оброблення бджолиного пилку із використанням його, було виконано ферментацію, 10% або 50% інокулят штаму у формі 48 год. культур бактерій був доданий до сусла з пилком. Кількість 6 7 бактерій у доданому інокуляті була у межах 10 -10 КУО/мл. У той же час ферментація контрольних зразків відбувалась у суслі із щільністю 7, 14 та 30°BIg, що містило виключно природну мікрофлору пилку. Хід ферментації пилку контрольного зразку зображений на фіг. 2. Усі три зразки із щільністю 2 7, 14 та 30°BIg, відбулося скорочення числа бактерій ферментації молочної кислоти від 10 до 1 10 КУО/г у середовищі із щільністю 14 та 30°BIg та повне пригнічення росту бактерій молочної кислоти у середовищі щільністю 7°BIg. Більша частина молочної кислоти, 1,39 г/100 г, була отримана при щільності 30°Blg, a найменша кількість при 7°BIg. У всіх активних зразках, так само як раніше, було виявлено поступове зростання активності - найбільше у щільності середовища 7°BIg - до 5.5 г молочної кислоти / 100 г. Також кількість цукру у середовищі 4 UA 114350 C2 5 10 незалежно від щільності середовища ферментації, так само, як білку у надосадовій рідині, зменшувалась. Фіг. 3 показує хід ферментації суміші пилку й медового сусла при 14-денній ферментації з 50% інокулятом, що містить штам як описано винаходом. Для того, щоб прищепити 10 середовище, використовувалась щільність інокуляту 10 КУО/мл. У щільності середовища 7, 14°BIg за весь період ферментації кількість молочнокислих бактерій залишалась на подібному рівні. Ясне скорочення бактерій ферментації молочної кислоти було очевидним у середовищі щільністю 30°BIg. Спостерігалося, що збільшення кількості інокуляту від 10% до 50% не збільшувало фінального вмісту молочної кислоти. Подібні показники були отримані тоді, як найбільшими для штаму Lactobacillus delbrueckii subsp, delbrueckii № 2 KKP 1645 (30°BIg) були 2.48 г/ 100 г. Подібно до попередніх ферментацій кількість цукру та білку зменшувалась. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 15 1. Штам бактерій Lactobacillus delbrueckii для оброблення бджолиного пилку, депонований в Колекції культур промислових мікроорганізмів Інституту сільськогосподарської та продовольчої біотехнології у Варшаві під номером KKP 1645р. 2. Застосування штаму за п. 1 для оброблення бджолиного пилку. 3. Бджолиний пилок, який відрізняється тим, що містить штам бактерій за п. 1. 5 UA 114350 C2 6 UA 114350 C2 Комп’ютерна верстка А. Крулевський Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 7