Спосіб одержання бактеріального концентрату прямого внесення для продуктів спеціального призначення

1 Спосіб одержання бактеріального концентрату прямого внесення для продуктів спеціального призначення, який передбачає приготування живильного середовища на молочній основі з додаванням ростових речовин, внесення в нього посівного матеріалу, культивування та відокремлення біомаси, змішування и з захисним середовищем, заморожування і сушіння, який відрізняється тим, що до складу живильного середовища вводять як активатори росту молочнокислих бактерій оцтовокислий натрій і твін 80, як посівний матеріал використовують пробютичні штами бактерій Lactobacillus acidophilus ВКПМ В7771, Lactobacillus casei subsp casei 1MB B-7017, Streptococcus sahvanus ssp thermophilus ВКПМ В733 у співвідношенні 1 1 1, а у захисному середовищі вміст сухих речовин збільшують до 28-30% 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що оцтовокислий натрій та твін 80 додають до живильного середовища перед стерилізацією в КІЛЬКОСТІ Винахід відноситься до біотехнологм і може бути використаний в молочній промисловості для виробництва продуктів спеціального призначення При виробництві продуктів функціональної дії, як заквашувальну культуру, традиційно використовують лактобацили та біфідобактерм, оскільки саме ш належить важлива роль в підтриманні та нормалізації мікробюценозу кишечнику, неспецифічній резистентності макроорганізму, поліпшенні білкового та мінерального обміну Сучасні дослідження показали, що заквашувальна культура Lactobacillus casei, не тільки регулює процеси травлення в кишечнику, а й виявляє протипухлинні та антиппертонічні властивості, тому включення цього виду лактобактерій до складу бакпрепаратів спрямованої біологічної дії є дуже перспективним вища в результаті накопичення молочної кислоти, яка утворюється в процесі культивування Для збільшення оптичної густини заквашувальної культури L casei запропоновано використання перехресно-проточної системи фільтрації для вилучення продуктів метаболізму із живильного середовища Недоліком цього способу є технологічна складність виконання Крім того, за 14 годин культивування вихід клітинної маси з 1л середовища складає всього 4г, що економічно невигідно Відомо спосіб виробництва бактеріального препарату для кисломолочних продуктів, який передбачає культивування Lactobacillus acidophilus в живильному середовищі при періодичному перемішуванні до вмісту 200млн бактеріальних клітин в Імл, змішування одержаної біомаси з захисним середовищем, заморожування та сушіння методом сублімації (Патент України № 11193, А 23 С 21/02, С 12 N 1/20, 1996) Недоліком цього способу є те, що основою живильного середовища для накопичення біомаси є молочна сироватка, освітлена шляхом термокоагуляцм, склад якої може коливатися в широких межах Крім того, накопичення біомаси є тривалим (18 - 24 год ), в технологічному режимі відсутня стадія відокремлення одержаної біомаси, що не дозволяє отримати бактеріальний Відомо спосіб виробництва бактеріального препарату до складу якого залучено молочнокислі палички виду L casei (Kazuhito Hayakawa, Hiroshi Sansava, Teruyuki Nagamune, Isao Endo High density culture of Lactobacillus casei by a cross-flow culture method based on kinetic properties of the microorganism//J Ferment Bioengmeering -1990 -70, N 6 - P 404 - 408) В стаціонарній культурі максимальна густина клітин L casei не перевищує 109 КУО/мл внаслідок сильного підкислення середо 0,5% і 0,1% ВІДПОВІДНО ю 00 СО (О ю 56385 препарат з високою концентрацією клітин Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб одержання заквашувального препарату для йогурта СІ-2, який передбачає приготування живильного середовища на молочній основі з додаванням вуглеводів, лимоннокислого натрію, мікроелементів та стимуляторів росту, культивування посівного матеріалу, відокремлення біомаси, змішування и з захисним середовищем, заморожування та сушіння (ТУ У 46 39 ГО 271-1999 - прототип) Згідно З ЦИМ способом стерилізацію розчину знежиреного молока та вуглеводів (лактози та глюкози) проводять при температурі 121 °С протягом ЗО хвилин Після ЦЬОГО окремо готують стерильні розчини мінеральних солей та активаторів росту, які додають до охолодженої основи В живильне середовище вносять 2,5% культури термофільних стрептококів і по 0,5% культур болгарської та ацидофільної паличок, які культивують для накопичення біомаси протягом 8 - 9 годин при 37°С Одержану бактеріальну масу відокремлюють і змішують у співвідношенні 1 ( 2 - 3 ) зі стерильним водним розчином захисного середовища із вмістом сухих речовин до 18%, та висушують методом сублімаційного сушіння 1г готового бакпрепарату містить 2,0 • 10 1 КУО молочнокислих бактерій Основним недоліком цього способу є трудомісткість приготування живильного середовища для накопичення біомаси, оскільки більшість компонентів вноситься у вигляді стерильних розчинів до стерильної молочної основи, тому що одночасна стерилізація неможлива внаслідок згортання молока В способі не повністю враховані особливості стерилізації кожного з компонентів живильного середовища, зокрема стерилізація глюкози при температурі 121 °С протягом ЗО хвилин веде до часткового руйнування вуглеводу, тому кінцева концентрація його залишається невизначеною Крім того, відомий спосіб не передбачає відбір штамів до складу бактеріальної композиції за вимогами, які висуваються до пробютичних культур Завданням винаходу є оптимізація процесу одержання бакконцентрату та посилення його біологічної активності, що забезпечить виробництво сухих та кисломолочних продуктів спеціального призначення Поставлене завдання вирішується тим, що в способі одержання бактеріального концентрату прямого внесення для продуктів спеціального призначення, який передбачає приготування живильного середовища на молочній основі з додаванням ростових речовин, внесення в нього посівного матеріалу, культивування та відокремлення біомаси, змішування її з захисним середовищем, заморожування і сушіння, згідно з винаходом до складу живильного середовища вводять як активатори росту молочнокислих бактерій оцтовокислий натрій і твін-80, як посівний матеріал використовують пробіотичні штами бактерій Lactobacillus acidophilus ВКПМВ-7771, Lactobacilhs casei subsp casei 1MB B-7017, Streptococcus sahvanm ssp thermophilm ВКПМ B-733 у співвідношенні 1 1 1, а у захисному середовищі вміст сухих речовин збільшують до 28 - 30%, ВІДМІННІСТЮ способу є те, що джерело вуглеводного живлення - глюкоза, а також аскорбінова кислота, яка виконує функцію відновлювача, вносяться одночасно у вигляді окремо стерилізованих розчинів до охолодженої основи Порівняльна характеристика живильного середовища для одержання бакконцентратів за відомим та заявленим способами, наведена в таблиці 1 Порівняно з прототипом, частка сухого знежиреного молока зменшена в 3 рази, а мінеральних солей майже в 10 разів Тим самим було усунуто проблему згортання молока при їх одночасній стерилізації Водночас додатково до складу живильного середовища перед стерилізацією, як активатори росту молочнокислих паличок, вводяться 0,5% оцтовокислого натрію та 0,1% твіну 80 Останній, крім того, ще й запобігає утворенню піни при культивуванні та відокремленні біомаси В способі, що заявляється, враховано вимоги до режимів стерилізації для кожного з компонентів живильного середовища (табл 1) Особливістю способу є використання спеціально відібраної заквашувальної культури, до складу якої залучені пробіотичні штами молочнокислих бактерій Lactobacillus acidophilus ВКПМ В-7771, Lactobacilhs casei subsp casei 1MB B-7017, Streptococcus sahvantis ssp thermophilus ВКПМ B-733 Ця композиція поряд з хорошими органолептичними показниками, надає ферментованому продукту комплекс властивостей, які обумовлюють його позитивний вплив на організм споживача Штами лактобактерій є власними штамами ТІММ, виділеними з природних джерел, і задепонованими в ВКПМ (Росія) та в Національній колекції промислових мікроорганізмів 1MB (Україна) Вони відбиралися на основі ретельних лабораторних досліджень з урахуванням вимог, що висуваються до штамів-пробютиків, а саме висока антагоністична та холестеразна активності, здатність до адгезії в стінках кишечнику, резистентність до жовчі, фенолу та високих концентрацій солей Основні біологічні властивості відібраних штамів наведено в таблиці 2 Як видно з даних таблиці 2, штами є стійкими до продуктів метаболізму травної системи та характеризуються високою адгезивністю Ці властивості забезпечують їм успішний транзит через шлунково-кишковий тракт та закріплення в товстому кишечнику Наявність антагоністичних властивостей є обов'язковою умовою при доборі штамів молочнокислих бактерій для бактеріальних препаратів, особливо для тих, що використовуються в виробництві дієтичних та лікувально-профілактичних продуктів Антагоністичну активність визначали m vitro, використовуючи 18 штамів тест-культур з колекції мікроорганізмів Інституту епідеміологи та інфекційних хвороб їм Л В Громашевського МОЗ України, які належали до слідуючих родів Eschenchia, Citrobacter, Klebsiella, Morganella, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella та Staphylococcus Дослідження антагоністичної активності відібраних молочнокислих бактерій показало, що найактивнішим з них є L acidophilus, який викликає утворення зон затримки росту у 11 із 18 вико 56385 годин Накопичення біомаси в живильному середовищі проводять при 37°С протягом 12 годин, підтримуючи активну кислотність на рівні рН 6,5 Одержану біомасу відокремлюють від культуральної рідини шляхом центрифугування та змішують її в співвідношенні 1 2(3) із стерильним захисним середовищем Спосіб передбачає використання спеціального захисного середовища, в якому збільшено вміст сухих речовин до 30%, що забезпечує високий рівень виживання та активності бактеріальної мікрофлори при заморожуванні, сушінні та зберіганні бактеріального препарату Захисне середовище готують із окремих стерильних розчинів із розраВисокий рівень антагоністичної активності хунку 20% сахарози, 5% лимоннокислого натрію, окремих штамів зберігається і в готовому баккон5% сухого знежиреного молока центраті Аналіз антагоністичної активності сухого препарату показав, що його мінімальна бактериСуспензію бактеріальних клітин в захисному цидна доза складає Юмг, а бактеріостатична середовищі заморожують при мінус (40 ± 2)°С про0,01мг Цей рівень вияву антагонізму з високою тягом 1 6 - 1 8 годин Після ЦЬОГО суспензію висувірогідністю може забезпечити елімінацію небажашують в сублімаційній сушарці при таких режимах ної мікрофлори в кишечнику та санітарний рівень температура на початку сушіння - мінус (25 ± 2)°С, продукту в процесі його виробництва в КІНЦІ - плюс (ЗО ± 2)°С Тривалість сушіння - 18 20 годин Бактеріальний концентрат "ЛТС" характеризується високою біохімічною активністю, надає проВисушену суспензію подрібнюють у дрібнодидуктові дієтичних властивостей, зокрема він утилісперсний порошок та фасують зує 36,5% лактози, збагачує його вільними Застосування цих технологічних прийомів доамінокислотами, в тому числі незамінними Амінозволяє за 12 годин культивування одержати з 1л кислотний склад молока вихідного та ферментосередовища 9,3г сухого концентрату, 1г якого місваного "ЛТС", наведено в таблиці З тить (3,5 - 4,1) • 10 1 життєздатних клітин молочнокислих бактерій Бакконцентрат "ЛТС" також знижує концентрацію холестерину в процесі сквашування молока із Дослідження виживання клітин бакконцентрату вмістом жиру 3,2%, Лабораторними дослідами "ЛТС" при зберіганні показало достатню стабільпоказано, що у ферментованому продукті, виготоність бактерій протягом року (табл 4) Визначено вленому з використанням "ЛТС", на 38 - 40% знитермін зберігання бакконцентрату "ЛТС" , який жено рівень холестерину у порівнянні з його вміссклав 6 МІСЯЦІВ при температурі 4 - 6°С, та 12 МІтом у молочній основі Ця властивість разом зі СЯЦІВ при - мінус 18 - 20°С Бакконцентрат "ЛТС" СТІЙКІСТЮ до жовчі дозволяє з високою вірогідністю застосовується прямим внесенням у підготовлену стверджувати про вплив культури на вміст холесмолочну основу, його активність складає 6 годин терину в людському організмі Приклад 1 Спосіб одержання бактеріального концентрату "ЛТС" Все це вказує нате, що бактеріальний концентрат прямого внесення, створений на основі штаВ 70л водопровідної води відновлюють 700г мів-пробютиків, є високоактивним заквашувальним сухого знежиреного молока, вносять 490г пептону, препаратом, дозволяє одержувати кисломолочний 210г лимоннокислого натрію, 350г оцтовокислого продукт з підвищеним вмістом вільних амінокиснатрію, 14г MgSO4, 35г MnSO4, 700г лактози, 70мл лот, зниженим рівнем лактози і холестерину та твіну 80 Після розчинення в середовищі встановвисокою КІЛЬКІСТЮ корисних мікроорганізмів, стійлюють Рн 8,3 шляхом додавання 40%-ного розчиких до продуктів обміну травної системи, здатних ну гідроксиду натрію, стерилізують при 121 °С продо закріплення та успішного розвитку в кишечнику тягом ЗО хвилин і охолоджують до температури людини Сукупність цих властивостей забезпечить 55°С дієтичну та лікувально-профілактичну спрямоваОкремо готують і вносять до основи стерильні ність продукту, ферментованого за допомогою розчини 700г глюкози, розчиненої в 2л дистильоцього концентрату ваної води, 35г аскорбінової кислоти у 400мл води, стерилізовані при 105°С протягом 15 хвилин, та Спосіб здійснюють таким чином 1,4л дріжджового автолізату, який готують згідно з В живильне середовище, що готують за схевідомою методикою Після внесення всіх компонемою, відображеною в таблиці 1, вносять по 1,65% нтів активна кислотність середовища повинна бути культур S sahvanus ssp thermophilus ВКПМ В-733, на рівні рН 6,5 В підготовлене середовище вноL addophilus ВКПМ В-7771 і L casei ssp casei 1MB сять по 1,2л шокулятів штамів S sahvanus В-7017 Інокуляти S sahvanus ssp thermophilus, ssp thermophilus ВКПМ В-733, Lacidophilus ВКПМ L addophilus готують шляхом внесення у стерильВ-7771 і L casei ssp casei 1MB В-7017 з концентране знежирене молоко по 1% культури і подальшоцією клітин кожного не менше 108 КУО/мл Накого їх нарощування при температурі 31 °С протягом пичення бактеріальної маси проводять при 37°С 16 годин Інокулят L casei ssp casei готують шляпротягом 12 годин з періодичною нейтралізацією хом внесення у стерильне знежирене молоко 5% середовища 25%-ним водним розчином аміаку до культури, вирощеної у середовищі MRS, і подальактивної кислотності рН 6,5 Після закінчення прошого и культивування при 37°С протягом 16 - 18 ристаних тест-культур Найчутливішими до нього були патогенні серотипи кишкової палички, шигели та стафілококи - розмір зони затримки росту коливався в межах 13,5 - 20,2, 17 - 18 і 10,3 - 13,0мм, ВІДПОВІДНО Штам L casei також виявляв високу бактерицидну дію на тест-культури, а антагоністичний вплив термофільних стрептококів був дещо нижчим за інтенсивністю (зони затримки росту не перевищували 14,5мм) та спектром культур, що пригнічувалися Зокрема він був активним по відношенню до стафілококів, протеїв і псевдомонад Позитивним є те, що всі досліджені штами не пригнічували розвиток штаму Е coh M-17, який є представником нормофлори людини 8 56385 цесу культуральну рідину охолоджують і центрифугують на суперцентрифузі при 15000об/хв Одержану біомасу змішують у співвідношенні 1 2 із стерильним захисним середовищем, 1л якого готують з окремих стерильних розчинів із розрахунку 200г сахарози, розчиненої в 400мл дистильованої води і стерилізованої при 105°С протягом 15 хвилин, 50г лимоннокислого натрію - у 100мл дистильованої води та 50г сухого знежиреного молока - у 500мл водопровідної води, стерилізованих при 121 °С протягом ЗО хвилин Суспензію клітин розливають в стерильні кювети шаром не більше 6мм, заморожують при мінус 40°С протягом 16 годин і висушують в сублімаційній сушарці КС-30 при температурі від -25°С до +30°С з масовою часткою вологи в сухому концентраті не більше 5%, тривалість сушіння -18 годин Висушену суспензію подрібнюють у порошок, фасують в стерильну тару та щільно закупорюють 1г сухого бактеріального концентрату містить 4,1 • 10 11 КУО лактобактерій, його активність складає 6 годин Приклад 2 Спосіб одержання бактеріального концентрату "ЛТС" Спосіб здійснюють за прикладом 1, але із складу живильного середовища для накопичення біомаси виключають оцтовокислий натрій та твін 80 1г сухого бактеріального концентрату містить 1 1,4' 10 КУО лактобактерій, його активність складає 10 годин Приклад 3 Виробництво ферментованого молочного продукту з використанням бакконцентрату "ЛТС" 100кг молока пастеризують при 92°С з витримкою 10 хвилин, гомогенізують, охолоджують до 37°С, вносять бакконцентрат (виготовлений за прикладом 1) в КІЛЬКОСТІ 0,5 г, перемішують і витримують при вказаній температурі протягом 8 годин до утворення згустку з кислотністю 70°Т Ферментовану суміш охолоджують та подають на розлив Смак готового продукту приємний кисломолочний, консистенція - однорідна з глянцевою поверхнею Загальна КІЛЬКІСТЬ корисної мікрофло9 ри в 1 г продукту складає 3,5 • 10 КУО Таким чином, спосіб, що заявляється, дозволяє одержати біологічно активний бактеріальний концентрат прямого внесення для виробництва продуктів спеціального призначення з високим вмістом пробютичних культур, вільних амінокислот, в тому числі незамінних, зниженим рівнем лактози та холестерину Ферментовані продукти, виготовлені ВІДПОВІДНО способу, рекомендовано вживати в профілактичних цілях для нормалізації кишкової мікрофлори, обміну холестерину, поліпшення процесів травлення Таблиця 1 Порівняльна характеристика приготування живильного середовища за відомим та заявленим способами Бак концентрат ПОСЛІДОВНІСТЬ внесення компонентів в живильне середовище До стерилізації основи*, концентрація, Після стерилізації основи концентра% Прототип ЛТС Знежирене молоко Лактоза Глюкоза Знежирене молоко Лактоза Лимоннокислий натрій Оцтовокислий натрій MgSO4 MnSO4 Пептон Твін 80 ЦІЯ, % 3,0 1,0 1,0 1,0 1,0 0,3 0,5 Лимоннокислий натрій MgSO4 MnSO4 Пептон Дріжджовий екстракт Глюкоза Аскорбінова кислота Дріжджовий автолізат 0,02 0,005 0,7 0,1 Примітка режим стерилізації *-при температурі 121 °С протягом ЗО хвилин ** - при температурі 121 °С протягом 10-15 хвилин *** - при температурі 105°С протягом 15 хвилин 1,0** 0,2 0,02 0,5 0,1 1,0*** 0,05 2,0 56385 10 Таблиця 2 Фізюлого-бюхімічні властивості штамів, залучених до бакконцентрату "ЛТС" L casei ІМВВ-7017 Розвиток в присутності 30% жовчі 6,5%NaCI 0,5% фенолу Оптимальна температура росту, °С Границя кислотоутворення, °Т Індекс адгезивності (ІА) S thermophilus ВКПМ В-7331 L acidophilus ВКПМ В-7771 + + + 37 ± 1 176 ± 5 7,2 ±0,1 Показники + + + 37 ± 1 110 ± 5 8,3 ±1,7 -*) **\ + 37 ±1 334 ± 5 1,2 ±0,2 *) штам розвивався при 20% жовчі *) штам розвивався при 5% NaCI Таблиця З Амінокислотний склад молока вихідного та ферментованого бакконцентратом "ЛТС", мг/мл Амінокислота Треонін Валін Лейцин Ізолейцин Лізин Метіонін Аспарагінова кислота Глутамшова кислота Серій Гліцин Аланін Аргінін Пролін Гістамін Молоко 0 4,42 0 0 5,31 0 2,93 32,28 0 9,01 3,47 0 0 6,32 Ферментоване молоко 2,19 6,10 7,94 2,80 12,27 4,68 13,62 97,97 6,64 4,44 18,44 12,41 43,59 15,41 Таблиця 4 Стан мікрофлори бакконцентрату "ЛТС" при зберіганні Чисельність бактерій, КУО/г 2 міс А 2,9 4 міс В 6,5 А 2,9 9 міс 6 МІС В 6,5 А 2,8 В 6,2 11 А 2,5 12 міс В 3,2 1ҐІ Примітка, A- Lcasei + S thermophilus (-10 ), В- L acidophilus (-10 ) Підписано до друку 05 06 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24 А 2,1 В 1,2