Молочнокисла бактерія streptococcus thermophilus з модифікованою галактокіназною експресією для текстурування харчових продуктів за рахунок надекспресії екзополісахариду

Реферат: Винахід належить до бактеріальної клітини Streptococcus thermophilus, яка має текстуруючу властивість, та до способу її одержання шляхом введення мутації в ділянку -10 гену GalK штаму, скринінгу штаму мутанта Streptococcus thermophilus що дозволяє отримати більш UA 113270 C2 (12) UA 113270 C2 виражену текстуру або вищу в'язкість молочного субстрату в порівнянні з материнським штамом Streptococcus thermophilus. UA 113270 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ Даний винахід стосується бактеріальної клітини, яка має текстуруючу властивість, заквашувальних культур, що включають клітини, і молочних продуктів, ферментованих із заквашувальною культурою. ПОПЕРЕДНІЙ РІВЕНЬ ТЕХНІКИ У харчовій промисловості використовують множину бактерій, зокрема лактобактерій, для поліпшення смаку і текстури харчових продуктів, але також для продовження терміну придатності цих харчових продуктів. У молочній промисловості лактобактерії інтенсивно використовують для сквашування молока (шляхом ферментації), але також для текстурування продукту, в який вони внесені. Серед лактобактерій, що використовуються в харчовій промисловості, можуть бути вказані роди Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus і Bifidobacterium. Лактобактерії видів Streptococcus thermophilus широко використовують окремо або в комбінації з іншими бактеріями для отримання харчових продуктів, зокрема ферментованих продуктів. Зокрема, їх використовують для отримання ферментів, що використовуються для отримання ферментованого молока, наприклад, йогурту. Деякі з них відіграють домінуючу роль в розвитку текстури ферментованого продукту. Ця характеристика тісно пов'язана з продукуванням полісахаридів. Штами Streptococcus thermophilus можна розділити на текстуруючі і не текстуруючі штами. Для того щоб відповідати вимогам промисловості, необхідно пропонувати нові текстуруючі штами лактобактерій, зокрема, Streptococcus thermophilus. У WO 2007095958 A1 описуються штами Streptococcus thermophilus з текстуруючими властивостями. На Фігурі 1 можна бачити, що штам CHCC8833 (DSM17876), що виявляє найбільші текстуруючі властивості, має показник напруження зсуву близько 59 Па. ВJ Dairy Sci. 92: 477-482 (2009) описується дослідження, в якому показано, що можна підвищити продукування EPS штамами Streptococcus thermophilus генно-інженерними методами за рахунок підвищення GalK активності. Отже, при використанні для отримання йогурту такого штаму в комбінації з Lactobacillus bulgaricus, надпродукція EPS рекомбінантним штамом не є важливою. Таким чином, даний винахід пропонує розв'язання проблеми, забезпечуючи штам лактобактерій з хорошими властивостями для текстурування харчових продуктів, зокрема продуктів, де текстуруючий штам лактобактерій (такий як Streptococcus thermophilus) використовують разом зі штамом видів Lactobacillus. КОРОТКИЙ ОПИС Несподівано автори даного винаходу виявили, що молочнокислі бактерії з мутацією в гені GalK (галактокінази) дозволяють отримати вищу в'язкість ферментованого молока в порівнянні з диким типом (материнським) штаму, зокрема при використанні для ферментації молока разом з бактеріями Lactobacillus. Відповідно до цього несподіваного відкриття даний винахід стосується нових супертекстуруючих штамів молочнокислих бактерій, таким як S. thermophilus, з мутаціями в гені GalK і способу отримання цих штамів, і ферментованих молочних продуктів, отриманих з використанням таких штамів. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС У першому аспекті даний винахід стосується способу отримання молочнокислої бактерії (такої, як бактерія, що дозволяє отримувати вищу в'язкість ферментованого молока в порівнянні з материнським штамом, або такий, як бактерія, що дозволяє отримувати в'язкість ферментованого молока вищу ніж близько 70 Па (наприклад, більше ніж 71 або більше ніж 73 Па, виміряну як напруження зсуву через 12 годин росту при температурі 37 °C), що включає: a) забезпечення штаму молочнокислої бактерії (материнський штам); і b) введення мутацій в ген GalK штаму. Отже, варіанти втілення першого аспекту даного винаходу представляють: спосіб отримання молочнокислої бактерії, що дозволяє отримувати вищу в'язкість ферментованого молока в порівнянні материнським штамом (наприклад, виміряну як напруження зсуву через 12 годин зростання при температурі 37 °C) що включає: a) забезпечення штаму молочнокислої бактерії (материнський штам); і b) введення мутацій в ген GalK штаму. Спосіб отримання молочнокислої бактерії, що дозволяє отримувати в'язкість ферментованого молока більшу ніж близько 70 Па (наприклад, виміряну як напруження зсуву через 12 годин росту при температурі 37 °C), що включає: a) забезпечення штаму молочнокислої бактерії (материнський штам); і 1UA 113270 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 b) введення мутацій в ген GalK штаму. У переважних варіантах втілення даного винаходу в'язкість вимірюють як напруження зсуву через 12 годин зростання при температурі 37 °C і/або вимірюють як в описаному нижче аналізі. Отже, переважний варіант втілення першого аспекту даного винаходу стосується способу отримання молочнокислої бактерії, що дозволяє отримувати в'язкість ферментованого молока більшу ніж близько 70 Па, наприклад, виміряну як напруження зсуву через 12 годин росту при температурі 37 °C, що включає: a) забезпечення штаму молочнокислої бактерії (материнський штам); і b) введення мутацій в ген GalK штаму. Додатково, спосіб за даним винаходом може включати одну або більше додаткових стадій, вибраних з групи, яка складається з: c1) скринінгу штаму мутанта, що дозволяє отримати текстуру, такого як штам, що дозволяє отримати більш виражену текстуру, ніж материнський штам, або що підвищує в'язкість молочного субстрату; і c2) скринінгу штаму мутанта, який має Gal+ фенотип, такий як з поліпшеною руйнуючою/ферментуючою галактозу активністю в порівнянні з материнським штамом. Мутація може бути введена в ділянку промотору гена, таку як область -10 (блок Прібнова) гена. У переважному варіанті втілення способу за даним винаходом мутація приводить до заміщення одного або обох С і G в області -10 дикого типу (TACGAT) нуклеотидом, незалежно вибраним з групи, яка складається з А і Т. Мутація може привести до заміни С в області -10 дикого типу (TACGAT) нуклеотидом, незалежно вибраним з групи, яка складається з А і Т. У одному варіанті втілення даного винаходу мутація приводить до заміни С в ділянці -10 дикого типу (TACGAT) на Т, і/або мутація приводить до того, що ділянка -10 має нуклеотидну послідовність TATGAT, TATTAT або TACTAT. Мутація може бути введена при використанні методів генної інженерії і/або при використанні мутагенезу, наприклад, опроміненням або обробкою хімічними речовинами, необов'язково з подальшим проведенням аналізу гена GalK для підтвердження мутації гена GalK. Бактерії (материнський штам) можуть бути вибрані з роду, що належить групі, яка складається з Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, і Bifidobacterium. Бактерії, які цікавлять, належать виду Streptococcus thermophilus. У іншому аспекті даний винахід стосується молочнокислої бактерії, що отримується способом за даним винаходом. Також даний винахід стосується молочнокислої бактерії, що дозволяє отримувати в'язкість ферментованого молока більшу ніж близько 70 Па (таку як більшу ніж 71 Па або 73 Па), виміряну як напруження зсуву через 12 годин росту при температурі 37 °C; молочнокислої бактерії, яка несе мутацію в області -10 гена GalK (в порівнянні з ділянкою -10 гена (TACGAT)), де мутація приводить до того, що ділянка -10 має нуклеотидну послідовність TATGAT, TATTAT або TACTAT; і молочнокислої бактерії, яка несе мутацію в ділянці -10 гена GalK, де мутація приводить до заміщення С в ділянці -10 дикого типу (TACGAT) нуклеотидом, незалежно вибраним з групи, яка складається з А і T. В переважному варіанті втілення даного винаходу мутація приводить до заміщення С в ділянці -10 дикого типу (TACGAT) на Т. У переважному варіанті втілення даного винаходу молочнокисла бактерія за даним винаходом включає SEQ ID NO:5, або ділянку промотору, включаючи ділянку -35 і ділянку -10. Переважно молочнокисла бактерія належить виду Streptococcus thermophilus. У іншому варіанті втілення даний винахід стосується бактеріального штаму, що належить видам Streptococcus thermophilus, вибраним з групи, яка складається з: CHCC11379 (DSM 22884), CHCC11342, CHCC11976, і мутантів і варіантів будь-якого з них. Додатково, даний винахід стосується всіх нових штамів, вказаних в даній патентній заявці, нарівні з їх мутантами і варіантами. У іншому аспекті даний винахід стосується композиції, що включає молочнокислі бактерії за даним винаходом, такі як бактерії, що належать до штаму CHCC11379. Переважно, щоб така 10 композиція включала щонайменше 10 КУО (колонієутворювальні одиниці) вказаних бактерій. Композиція може включати або як суміш, або як комплект: - штам, що належить видам Lactobacillus, такий як штам L. bulgaricus або L. fermentum; і - штам молочнокислої бактерії за даним винаходом, такий як штам, що належить видам Streptococcus thermophilus. 2 UA 113270 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Переважно, щоб штам, що належить видам Lactobacillus, являв собою штам, що належить до видів Lactobacillus, які продукують полісахарид (такий як гетерополісахарид, гомополісахарид) і/або фруктозилтрансферазний фермент. 10 Композиція може включати щонайменше 10 КУО (колонієутворювальні одиниці) штаму, що 10 належить видам Lactobacillus; і щонайменше 10 КУО штаму, що належить виду Streptococcus thermophilus. Переважно композиція придатна як заквашувальна культура, і знаходиться в замороженій формі, ліофілізованій або рідкій формі. У іншому аспекті даний винахід стосується способу отримання ферментованого молочного продукту/продукту з молока, що включає ферментацію молочного субстрату (такого як коров'яче молоко) з молочнокислою бактерією, штамом або композицією за даним винаходом. Спосіб може додатково включати ферментацію молочного субстрату зі штамом, що належить видам Lactobacillus, таким як штам L. bulgaricus або L. fermentum, наприклад, штам, вибраний з групи, яка складається з LB18, CHCC10019 (DSM19252), DSM22584, або CHCC3984 (DSM19251), і мутантам і варіантам будь-якого з цих штамів. Молочний субстрат може бути ферментований зі штамом або бактерією за будь-яким з попередніх пунктів, таким як штам, що належить видам Streptococcus thermophilus, до, під час або після ферментації зі штамом, що належить видам Lactobacillus. Спосіб може включати додавання ферменту в молочний субстрат до, під час або після ферментації, такого як фермент, вибраний з групи, яка складається з ферменту, здатного перехресно зшивати білки, трансглютамінази, аспарагінової протеази, хімозину і сичужного ферменту. У іншому аспекті даний винахід стосується молочного продукту, такого як ферментований молочний продукт (наприклад, йогурт або пахта) або сир (наприклад, свіжий сир або паста філату), що отримується способом за даним винаходом. Продукт з ферментованого молока може являти собою, наприклад, продукт з порушеним згустком або з непорушеним згустком. Молочний продукт необов'язково включає інгредієнт, вибраний з групи, яка складається з фруктового концентрату, сиропу, пробіотичної бактеріальної культури, барвника, загусника, агента, що надає смак і аромат, і консервуючого агента; і/або який необов'язково має форму продукту з порушеним згустком, з непорушеним згустком або питного продукту. Також даний винахід стосується молочного продукту, отриманого ферментацією молочного субстрату (такого як коров'яче молоко) з молочнокислою бактерією за винаходом (наприклад, штам, що належить виду Streptococcus thermophilus, такий як DSM 22884) і видів молочнокислих бактерій, вибраних з Lactobacillus bulgaricus і Lactobacillus fermentum (такий як CHCC10019 (DSM19252), CHCC3984 (DSM19251) і CHCC2008 (DSM22584)). Переважний молочний продукт за даним винаходом має в'язкість більшу ніж 100 Па (таку як більшу ніж 102 або більшу ніж 104 Па), виміряну як напруження зсуву, наприклад, через 12 годин росту при температурі 37 °C. У переважному варіанті втілення даного винаходу в'язкість складає більшу ніж 100 Па, отримана тільки за рахунок зростання бактеріальних клітин, але вищі показники в'язкості отримані додаванням хімічних сполук, таких як желатин, карагенан і тому подібне. ВИЗНАЧЕННЯ Використовуваний в описі даний патентної заявки термін "молочнокислі бактерії" стосується грампозитивних мікроаерофільних, або анаеробних бактерій, які ферментують цукри з продукуванням кислот, включаючи молочну кислоту як основну продуковану кислоту, оцтову кислоту і пропіонову кислоту. Найбільш використовувані в промисловому виробництві бактерії належать до сімейства "Lactobacillales", яке включає Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. і Propionibacterium spp. Додатково, бактерії, які продукують молочну кислоту, належать до групи облігатних анаеробних бактерій, біфідобактерій, тобто, Bifidobacterium spp., як правило, включають в групу молочнокислі бактерії. Їх часто використовують як харчові культури самі по собі або в комбінації з іншими молочнокислими бактеріями. Молочнокислі бактерії включають бактерії видів Lactobacillus sp. і Streptococcus thermophilus, які, як правило, використовують при виробництві молочних продуктів у вигляді, як заморожених, так і ліофільних культур для вирощування виробничої закваски, або так званих культур "прямого внесення" (DVS), призначених для безпосередньої інокуляції в ферментер або бродильний чан для отримання молочного продукту, такого як продукт з ферментованого молока. Такі культури, як правило, вказуються як "заквашувальні культури" або "закваски". Використовуваний в описі даної патентної заявки термін "молоко" включає в об'єм поняття секрет молочних залоз, отриманий доїнням ссавців, таких як корови, вівці, кози, буйволиці або 3 UA 113270 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 верблюдиці. У переважному варіанті втілення даного винаходу молоко представляє молоко корови. Термін молоко також включає в об'єм поняття розчини білок/жир, отримані з рослинних матеріалів, наприклад, соєве молоко. Використовуваний в описі даний патентної заявки термін "молочний субстрат" може представляти будь-яке сире і/або яке пройшло технологічну обробку молоко, яке може бути ферментоване способом за даним винаходом. Отже, використовуваний молочний субстрат включає без обмеження розчини/суспензію будь-якого молока або молочних продуктів, що включає білок, таких як незбиране молоко або молоко з низьким вмістом жиру, знежирене молоко, пахта, відновлене сухе молоко, концентроване молоко, сухе молоко, сироватка, пермеат сироватки, лактоза, маточна рідина після кристалізації лактози, концентрат сироваткового білка або вершків. Очевидно, що молочний субстрат може бути отриманий від будь-якого ссавця, наприклад, він може представляти по суті чисте молоко ссавців або відновлене сухе молоко. Перед ферментацією молочний субстрат може бути гомогенізований і пастеризований згідно зі способами по попередньому рівню техніки. Використовуваний в описі даний патентної заявки термін "гомогенізація" стосується інтенсивного перемішування з отриманням суспензії або емульсії. У випадку, коли гомогенізацію проводять перед ферментацією, вона може бути проведена, таким чином, щоб зменшити розмір молочного жиру, таким чином, щоб він більше не відділявся від молока. Це може бути досягнуто проштовхуванням молока під тиском через маленькі отвори. Використовуваний в описі даний патентної заявки термін "пастеризація" стосується обробки молочного субстрату для зниження або видалення живих організмів, таких як мікроорганізми. Переважно пастеризація досягається шляхом підтримки певної температури протягом певного періоду часу. Певна температура, як правило, досягається нагріванням. Температура і тривалість можуть бути вибрані таким чином, щоб вбивати або інактивувати певні бактерії, такі як шкідливі бактерії. Потім може йти стадія швидкого охолоджування. Використовуваний в описі даний патентної заявки термін "ферментація" стосується перетворення вуглеводів в спирти або кислоти при впливі мікроорганізмів (таких як молочнокислі бактерії, наприклад, види Lactobacillus sp. і Streptococcus thermophilus). Переважно ферментація в способах за даним винаходом включає перетворення лактози в молочну кислоту. Процес ферментації, використовуваний для отримання продуктів з ферментованого молока, добре відомий, і фахівець в галузі техніки, якої стосується даний винахід, добре знає, як вибрати відповідні технологічні умови, такі як температура, кисень, додавання вуглеводів, кількість і характеристики мікроорганізму(ів) і час обробки. Очевидно, що умови ферментації вибирають, таким чином, щоб сприяти досягненню даного винаходу, тобто, отриманню продукту з ферментованого молока в твердій або рідкій формі (ферментований молочний продукт). Використовується в описі даний патентної заявки термін "продукт з порушеним згустком", зокрема, стосується продукту з ферментованого молока, який піддають механічній обробці після ферментації, з отриманням в результаті зруйнованого і зрідженого згустку, отриманого на стадії ферментації. Як правило, механічну обробку без обмеження проводять перемішуванням, перекачуванням, фільтрацією або гомогенізацією гелю або змішуванням з іншими інгредієнтами. Продукти з порушеним згустком, як правило, без обмеження мають вміст сухих знежирених речовин молока в межах від 9 до 15 %. Використовуваний в описі даний патентної заявки термін "продукт з непорушеним згустком" включає в об'єм поняття продукт на основі молока, інокульований заквашувальною культурою, наприклад, стартовою культурою, і упакований після стадії інокуляції з подальшою ферментацією в упаковці. Використовуваний в описі даний патентної заявки термін "мутант" стосується штаму, отриманому зі штаму за даним винаходом при використанні, наприклад, генної інженерії, обробки випромінюванням і/або хімічної обробки. Переважно мутант представляє функціональний еквівалент мутанта, наприклад, мутант, який по суті має такі ж або поліпшені властивості (наприклад, в'язкість, густина гелю, обволікання ротової порожнини, смак і аромат, посткислотоутворення, швидкість підкислення і/або фагостійкість), як у материнського штаму. Такий мутант є частиною даного винаходу. Зокрема, використовуваний в описі даний патентної заявки термін "мутант" стосується штаму, отриманому обробкою штаму за даним винаходом при використанні будь-якого традиційного способу мутагенної обробки, включаючи обробку хімічним мутагеном, таким як етан метан сульфонат (EMS) або N-метил-N'-нітро-Nнітрогуанідин (NTG), УФ випромінювання або спонтанно виникаючі мутації. Мутант може бути підданий декільком мутагенезам (єдину обробку потрібно розуміти, як одну стадію мутагенезу з 4 UA 113270 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 проведенням подальшої стадії скринінгу/відбору), але переважно проведення не більше ніж 20, або не більше ніж 10, або не більше ніж 5 обробок (або стадій скринінгу/відбору). Переважно в бактеріальному геномі мутанта замінені менше ніж 5 %, або менше ніж 1 % або менше ніж 0,1 % нуклеотидів іншими нуклеотидами або видалені в порівнянні з материнським штамом. Використовуваний в описі даний патентної заявки термін "варіант" стосується штаму, який є функціональним еквівалентом штаму за даним винаходом, наприклад, який по суті має такі ж або поліпшені властивості (наприклад, в'язкість, густина гелю, обволікання ротової порожнини, смак і аромат, посткислотоутворення, швидкість кислотоутворення і/або фагостійкість). Такі варіанти можуть бути визначені при використанні відповідних технологій відбору і є частиною даного винаходу. У описі даний патентної заявки використаний термін "текстура, виміряна як напруження зсуву через 12 годин зростання при температурі 37 °C". Дослідження, яке використовується для аналізу текстури: На наступний день після інкубації ферментоване молоко доводять до температури 13 °C і обережно перемішують при використанні палички із закріпленим на ній диском з отворами до досягнення зразком гомогенності. Реологічні властивості зразка оцінюють при використанні реометра (StressTech, Reologica Instruments, Sweden), забезпеченого C25 коаксіальною вимірювальною системою. Тест на віскозиметрі проводять при градієнті швидкості зсуву, що варіює в межах від 0,27 до 300 1/с в 21 стадію. Градієнт швидкості зсуву спочатку збільшують, а потім знижують і фіксують верхню і нижню точки кривої напруження зсуву і видимої в'язкості. Час затримки і час інтеграції становить 5 секунд і 10 секунд, відповідно. Використовувані в описі даної патентної заявки (зокрема, в прикладеній формулі винаходу) форми однини включають і множину, якщо в контексті ясно не переглядається інше. Використовуване в описі даної патентної заявки дієслово "включати" і його форми потрібно інтерпретувати у відкритому, а не закритому значенні, якщо ясно не вказане інше (тобто, в значення "включаючи без обмеження"), якщо ясно не указано інше. Приведені межі значень приведені, як спосіб стисло показати весь діапазон, тобто кожний окремий показник з цього діапазону, якщо ясно не указано інше. Всі описані в даному винаході способи можуть бути проведені будь-яким відповідним чином, якщо ясно не указано інше, або якщо з контексту ясно не переглядається інше. Використання в описі даної патентної заявки будь-якого прикладу або всіх прикладів або термінів, які вказують на приведення прикладу (наприклад, такий як) приведене для кращого розуміння і ілюстрації і не обмежує об'єм домагань даного винаходу, викладений в прикладеній формулі винаходу. Жодне формулювання в описі не повинне розглядатися, як таке, що вказує на будь-який не викладений в формулі винаходу елемент як суттєвий для здійснення даного винаходу. ФІГУРИ На Фігурі 1 приведене напруження зсуву CHCC11379, виміряне при використанні реометра StressTech. Результати вказують на поліпшену текстуру (напруження зсуву) у молока, коагульованого CHCC11379, після зростання протягом ночі при температурі 43 °C. Кількісну оцінку текстури проводять, вимірюючи напруження зсуву в Паскалях (Pa) при використанні реометра StressTech, як описано в "аналізі текстури ферментованого молока". ПРИКЛАДИ Приклад 1: Отримання галактозапозитивного мутанта штаму Streptococcus. Виділення штаму, який ферментує галактозу Мутанта виділяють, як мутанта штаму S. Thermophilus CHCC6008 (=ST6008, DSM18111), який ферментує галактозу. Клітини CHCC6008 не піддають якому-небудь мутаногенезу впливом мутагенних сполук або впливом УФ променів перед стадією виділення мутанта. Отже, виділені штами подібні до спонтанних галактозапозитивних мутантів CHCC6008. Перед виділенням мутанта CHCC6008 на агарові пластини M17 смугами наносять 2 % галактозу (M17-гал пластини). CHCC6008 не показав зростання на галактозі як єдиному джерелі вуглеводів. Культивовані протягом ночі CHCC6008 потім наносять на пластини M17-гал пластини і виділяють декілька колоній після двох днів зростання при температурі 37 °C. Декілька мутантів очищають на пластинах M17-гал пластини і повторно тестують в бульйоні M17, що містить 2 % галактози як єдиного вуглеводу. У той час як CHCC6008 не значно знижує pH в бульйоні M17-гал, CHCC11379 - один з очищених мутантів змінює pH до 5,3 через10 годин при температурі 37 °C, і отже, вважається ферментуючим галактозу мутантом CHCC6008. Штами CHCC11342 і CHCC11976 виділяють таким же чином. Виділення мутантів при використанні методів генної інженерії 5 UA 113270 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галактозапозитивні мутанти також можуть бути отримані сайт-направленим мутагенезом. Олігонуклеотиди несуть мутований нуклеотид в galK-10 блоці промотору, що використовується для ампліфікації специфічного фрагмента ДНК проведенням ПЛР. Фрагмент ПЛР, який несе задану мутацію, клонують у вектор плазміди і трансформують цільовий штам S. thermophilus, мутацію інтегрують в хромосому і змінюють galK область промотору дикого типу проведенням рекомбінації. Виділення штамів проводять, як указано вище. Аналіз текстури ферментованого молока На наступний день після інкубації ферментоване молоко доводять до температури 13 °C і обережно перемішують при використанні палички із закріпленим на ній диском з отворами до досягнення зразком гомогенності. Реологічні властивості зразка оцінюють при використанні реометра (StressTech, Reologica Instruments, Sweden), забезпеченого C25 коаксіальною вимірювальною системою. Тест на віскозиметрі проводять при градієнті швидкості зсуву, що варіює в межах від 0,27 до 300 1/с в 21 стадію. Градієнт швидкості зсуву спочатку збільшують, а потім знижують і фіксують верхню і нижню точки кривої напруження зсуву і видимої в'язкості. Час затримки і час інтеграції становить 5 секунд і 10 секунд, відповідно. -1 Для подальших досліджень використовують напруження зсуву, яке дорівнює 300 с . Результати дослідження на реометрі показують, що CHCC11379 має напруження зсуву, покращене на 10 % в порівнянні з CHCC6008 (показник напруження зсуву 74,0 Па (паскаль) для CHCC11379 в порівнянні з 67,5 Па для материнського штаму CHCC6008, див. Фігуру 1). Аналіз текстури молока У іншому експерименті CHCC11379 використовують як частину йогуртної закваски, де штам з S. thermophilus спільно культивують в знежиреному молоці при температурі 43 °C зі штамом виду Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus. Відмінність полягає тільки в тому, що при отриманні йогурту використовують CHCC11379 замість дикого типу CHCC6008, напруження зсуву також підвищене на 10 % (105,0 Па для йогуртної закваски, що містить CHCC11379, в порівнянні з 94,7 Па для йогуртної закваски, що містить CHCC6008). Секвенування galK області промотору з CHCC11379 Для виявлення типу мутації для gal позитивного мутанта CHCC11379 секвенують початок гена gaIK (який кодує галактокіназу з S. thermophilus). Для CHCC11379 визначають мутацію області промотору galK (дивіться нижче). Швидше усього, відповідна мутація приведе до більш сильної активності промотору в порівнянні материнським штамом 6088, що пояснює отриманий гал-позитивний фенотип. Це основується на тому факті, що консенсусна послідовність -10-блока промотору представляє "TATAAT", і що мутація 3 нуклеотиду в -10 блоці (області) CHCC6008 ("TATAAT") приводить до того, що -10 блок має вищу схожість з консенсусною послідовністю CHCC11379 ("TATGAT"). AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTATGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGA TACATC SEQ ID NO:5-35-10 RBS CHCC6008 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATA CATC SEQ ID NO:6-35-10 RBS AY704368 AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATA CATC SEQ ID NO:7-35-10 RBS Консенсусна AAAATATTGATTTTCCATGTGAAAGGGGTTACGATTTCAGTATAAACAAAAAGAATAAGTGAGATA CATC SEQ ID NO:8-35-10 RBS Область промотору гена galK з CHCC11379. Точка мутації в CHCC11379 промоторі galk позначена сірим кольором. Опублікована послідовність galK з S. thermophilus ST111 (Genbank каталожний номер AY704368) вказана для порівняння. -35: -35 - область промотору; -10: -10 область промотору; RBS: сайт зв'язування рибосоми. Переважні варіанти втілення даного винаходу включають найкращий спосіб здійснення даного винаходу, відомий його авторам. Варіанти переважних варіантів втілення даного винаходу очевидні для фахівця в галузі техніки, якої стосується даний винахід, при прочитанні опису даний патентної заявки. Автори даного винаходу очікують від фахівця в галузі техніки, якої стосується даний винахід, використання таких варіантів у встановленому порядку, і автори даного винаходу мають на увазі, що даний винахід може бути здійснений іншим способом, ніж приведений в описі даний патентної заявки. Отже, даний винахід включає всі модифікації і еквіваленти предмета домагань, викладеного в прикладеній формулі винаходу. Додатково, будь-яка комбінація вказаних вище елементів у всіх можливих варіантах входить в об'єм 6 UA 113270 C2 5 10 15 20 25 домагань даного винаходу, якщо ясно не вказане інше, або якщо в контексті ясно не переглядається інше. ДЕПОНУВАННЯ І ПРОВЕДЕННЯ ЕКСПЕРТИЗИ Штам Streptococcus thermophilus CHCC11379 депонований 26 серпня 2009 року в DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Німецька колекція мікроорганізмів і культур клітин) GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany) під інвентарним номером DSM22884. Зразок Streptococcus thermophilus (ST) штам ST6008 (який також називається CHCC6008) депонований в DSMZ 29 березня 2006 року під інвентарним номером DSM 18111. CHCC11342 (DSM 22932) і CHCC11976 (DSM 22934) депоновані 8 вересня 2009 в DSMZ. Інші депозити DSMZ: CHCC10019 (DSM19252), CHCC3984 (DSM19251): Дата депонування 3 квітня 2007 року, CHCC2008 (DSM22584): дата депонування 19 травня 2009 року. Штам депонований відповідно до умов Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури. Заявник повідомляє, що зразок вказаного нижче депонованого мікроорганізму може бути доступний тільки експерту, який розглядає дану патентну заявку. ПОСИЛАННЯ Appl. Environ, Microbiol. 71, 7, р. 3659-67 (2005) International Journal of Food Microbiology 113 (2007) 195-200 APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Feb. 2002, р. 784-790 J Dairy Sci 92: 477-482 (2009) WO 2008/040734 A1, WO 2007/025097 A2, US 7241610 B2, WO 2007/144770 A2, WO 2004/085607 А, WO 2008/148561 А Всі посилання в даній патентній заявці приведені в повному об'ємі. 7 UA 113270 C2 8 UA 113270 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 1. Спосіб отримання молочнокислої бактерії Streptococcus thermophilus, який включає: a) забезпечення штаму молочнокислої бактерії Streptococcus thermophilus як материнського штаму; b) введення мутації в ділянку -10 гена GalK штаму, також відому як блок Прібнова; і c) скринінг штаму мутанта Streptococcus thermophilus, що дозволяє отримати більш виражену текстуру або вищу в'язкість молочного субстрату в порівнянні з материнським штамом Streptococcus thermophilus. 2. Спосіб за п. 1, де мутація приводить до заміщення одного або обох з С і G в ділянці -10 дикого типу, що має нуклеотидну послідовність TACGAT (SEQ ID NО: 1), нуклеотидом, незалежно вибраним з групи, яка складається з А і Т. 3. Спосіб за п. 2, де мутація приводить до того, що ділянка -10 має нуклеотидну послідовність TATGAT (SEQ ID NO: 2), ТАТТАТ (SEQ ID NО: 3) або ТАСТАТ (SEQ ID NО: 4). 4. Молочнокисла бактерія Streptococcus thermophilus для отримання більш вираженої текстури в ферментованому молочному продукті, яка несе мутацію в ділянці -10 гена GalK, де мутація приводить до: a) заміщення С в ділянці -10 дикого типу, що має нуклеотидну послідовність TACGAT (SEQ ID NО: 1), нуклеотидом А; або b) заміщення G в ділянці -10 дикого типу, що має нуклеотидну послідовність TACGAT (SEQ ID NO: 1), нуклеотидом Т; або c) заміщення обох з С і G в ділянці -10 дикого типу, що має нуклеотидну послідовність TACGAT (SEQ ID NО: 1), нуклеотидом, незалежно вибраним з групи, яка складається з А і Т; або d) ділянки -10, що має нуклеотидну послідовність ТАТТАТ (SEQ ID NО: 3) або TACTAT (SEQ ID NО: 4). 5. Молочнокисла бактерія Streptococcus thermophilus за п. 4, що включає SEQ ID NО: 5 або її ділянку промотору, включаючи ділянку -35 і ділянку -10. 6. Молочнокисла бактерія Streptococcus thermophilus за будь-яким з пп. 4-5, яка дозволяє отримувати в'язкість ферментованого молока, більшу ніж близько 70 Па, наприклад, виміряну як напруження зсуву через 12 годин росту при температурі 37 °С. 7. Молочнокисла бактерія для отримання вираженої текстури в ферментованому молочному продукті, що належить до штаму Streptococcus thermophilus, вибраного з групи, яка складається з штамів, депонованих в німецькій колекції мікроорганізмів, та клітинних культур під номерами доступу: DSM 22884, DSM 22932, DSM 22934, і їх мутантів, які мають той же ген GalK і текстурні характеристики, що і материнські штами. 9 UA 113270 C2 5 10 15 20 25 30 35 8. Композиція для отримання вираженої текстури в ферментованому молочному продукті, що включає молочнокислу бактерію Streptococcus thermophilus за будь-яким з пп. 4-7, така як композиція, що включає бактерії, які належать до штаму СНСС11379. 9. Композиція для отримання вираженої текстури в ферментованому молочному продукті, що включає або як суміш, або як комплект: - штам молочнокислої бактерії Streptococcus thermophilus за будь-яким з пп. 4-7; і - штам, що належить до виду Lactobacillus. 10. Композиція за п. 9, в якій штам, що належить до виду Lactobacillus, є штамом, який належить до виду Lactobacillus, що продукує полісахарид і/або фруктозилтрансферазний фермент. 10 11. Композиція за будь-яким з пп. 8-10, що включає щонайменше 10 КУО 10 (колонієутворюючих одиниць) штаму, що належить до виду Lactobacillus; і щонайменше 10 КУО штаму, що належить до виду Streptococcus thermophilus. 12. Спосіб отримання ферментованого молочного продукту/продукту з молока, що включає ферментацію молочного субстрату з молочнокислою бактерією Streptococcus thermophilus за будь-яким з пп. 4-7 або композицією за будь-яким з пп. 8-11. 13. Спосіб за п. 12, де молочний субстрат ферментують з молочнокислою бактерією Streptococcus thermophilus за будь-яким з пп. 4-6 до, під час або після ферментації зі штамом, що належить до виду Lactobacillus. 14. Спосіб за п. 13, в якому вказаний вид Lactobacillus є штамом L. bulgaricus або L. fermentum, переважно штамом, вибраним з групи, яка складається з LB18, DSM19252, DSM22584 або DSM19251 і мутантів, що мають той же ген GalK і текстурні характеристики, що і материнські штами. 15. Спосіб за будь-яким з пп. 12-14, що включає додавання ферменту в молочний субстрат до, під час і/або після ферментації, переважно ферменту, вибраного з групи, яка складається з: ферменту, здатного перехресно зшивати білки, трансглютамінази, аспарагінової протеази, хімозину і сичужного ферменту. 16. Молочний продукт, такий як ферментований молочний продукт або сир, який містить молочнокислу бактерію Streptococcus thermophilus за будь-яким з пп. 4-7 і молочнокислу бактерію виду, вибраного з Lactobacillus bulgaricus і Lactobacillus fermentum. 17. Молочний продукт за п. 16, який додатково включає інгредієнт, вибраний з групи, яка складається з: фруктового концентрату, сиропу, пробіотичної бактеріальної культури, барвника, загусника, агента, що надає смак і аромат, і консервуючого агента; і/або який має форму продукту з порушеним згустком, з непорушеним згустком або питного продукту. 18. Молочний продукт за будь-яким з пп. 16-17 з в'язкістю, більшою ніж 100 Па, виміряною як напруження зсуву. Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 10