Спосіб одержання накопичувальної культури морських дріжджів

Спосіб одержання накопичувальної культури морських дріжджів, що включає культивування досліджуваного матеріалу на поживному середовищі, як таке застосовують солодово-дріжджовий 3 Підкислення поживного середовища до рН 3,74,0 дозволяє пригнітити ріст морських бактерій. Для виділення морських дріжджів автори застосовують метод граничних розведень. Розведення роблять у стерильному 0,5 %-ному водному розчині NaCl, розлитому в сухі пробірки. Потім додають досліджуваний матеріал і пробірку ретельно збовтують протягом 5 хв. для відділення бактерій від часточок ґрунту. Це розведення відповідає 1:10. Отриману суспензію активно перемішують, 1 мл отриманого розведення вносять у наступну пробірку з NaCl - це розведення 2 10 . З неї знову відбирають 1 мл суспензії й вносять у третю пробірку. Таким чином одержують відповідні розведення: 1,0; 0,1; 0,01 і т. д. Цю операцію повторюють 3 рази до розведення 1:10000 4 (1:10 ). Така кількість розведень було підібрано експериментально на стадії відпрацьовування методики. Як правило, у п'ятому й більших розведеннях ріст дріжджів не відбувається. Таким чином, з огляду на таку властивість дріжджів, як мікрозональність, можна використовувати метод граничних розведень як селективний метод для виділення дріжджів. Для одержання накопичувальної культури дріжджів відоме поживне середовище, підкислене до рН 3,7-4,0, засівають одержаною суспензією з різних розведень паралельно в трьох повторностях. Після інкубації відповідної суспензії при температурі 22-23 °C у деяких пробірках візуально спостерігають ознаки росту накопичувальної культури: помутніння, осад, дріжджову плівку на поверхні середовища. Експериментально авторами було встановлено, що висівання накопичувальної культури вже через 2 дні дозволяє частково уникнути росту мікроміцетів. Уже другої доби з накопичувальної культури висівали матеріал на дріжджове агаризоване середовище - СДА і залишали в термостаті при температурі 27-28 °C. Через 3-7 днів характерні для дріжджів колонії відсівали в пробірки зі скошеним агаром того ж складу. Після перевірки культури на чистоту, їх переносили на середовище СДБ, на якому і зберігали. Приклад. Для виявлення ролі морських дріжджів у процесах самоочищення як об'єкт були вибрані системи гідробіологічної очистки морських вод (штучні рифи), розташовані в Нафтогавані Севастопольської бухти. На системах сформувалося й функціонувало угруповання обростання, у складі якого переважали мідії. Детальне вивчення морських дріжджів перифітону цих систем не проводилося. До відбору проб попередньо приготували поживне середовище (солодово-дріжджовий бульйон) наступного складу: дріжджовий екстракт 3мл, солодове сусло - 3 мл, пептон - 5 г, глюкоза 10 г на 1 л морської води. Середовище підкислили молочною кислотою до рН 3,7-4,0, потім розливали по пробірках і стерилізували в автоклаві 20 хв. при 121 °C. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 65312 4 Розведення робили в стерильному 0,5 %-ному водному розчині NаСl, який розливали піпеткою по 9 мл у сухі пробірки. В одну з них додавали 1 г перифітону й ретельно збовтували протягом 5 хв. з метою відділення дріжджів від часточок детриту й макроводоростей, одержавши, таким чином, розведення 1:10. Після цього із цієї пробірки відбирали 1 мл суспензії й переносили в наступну про4 бірку, одержавши розведення 1:100 (1:10 ). Цю операцію повторювали 3 рази до розведення 4 1:10000 (1:10 ). Після виконання описаної вище операції з кожної пробірки з відповідним розведенням засівали по 1 мл отриманої суспензії в пробірки з поживним середовищем (СДБ) у трьох повторностях. Одержали 12 пробірок з поживним середовищем, засіяним досліджуваним матеріалом. Вже другої доби спостерігали ознаки росту дріжджових культур: помутніння, плівку на поверхні середовища й на стінках пробірок, осад. Із пробірок з ознаками росту робили висів на агаризоване середовище (солодово-дріжджовий агар) на чашки Петрі. Чашки Петрі поміщали в термостат з температурою 22-23 °C і культивували дріжджові культури протягом 2-7 діб. Вирослі колонії виділяли в пробірки зі скошеним агаром і перевіряли на чистоту. Висів на агаризоване середовище проводили далі після виявлення ознак росту дріжджових культур, при цьому працювали лише з тими пробірками, де не було явних ознак росту вищих грибів. Перевірені на чистоту культури морських дріжджів використовували для одержання експериментальних даних щодо фізіолого-біохімічної активності, а також для ідентифікації виділених культур. У результаті досліджень уперше були виділені 67 культур морських дріжджів з перифітону систем гідробіологічного очищення морської води. Переважали великі, темні, овальні, з однобічним брунькуванням клітини. Всі виділені культури дріжджів могли використовувати нафту або нафтопродукти як єдине джерело вуглецю й енергії. Перевагами способу є те, що він дозволяє одержувати накопичувальні культури морських дріжджів, очищені від культур морських бактерій, а також цілком виключити можливість росту вищих грибів при висіві на агаризовані середовища і, таким чином, зменшити матеріальні витрати на проведені дослідження. Джерела інформації: 1. Prabhakaran N. Hydrocarbon degrading yeasts from Cochin Backwater / N. Prabhakaran, P. Sivadas // J.-Mar.-Biol.-Assoc.-India.-1995-37, № 1-2. - P. 226-230. 2. Zinjarde S. S. Hydrocarbon degraders from tropical marine environments / S. S. Zinjarde, A. A. Pant // Marine Pollution Bulletin.-2002. - V. 44, № 2. P. 118-121. 3. Новожилова М. И. Аспорогенные дрожжи и их роль в водоемах / М. И.Новожилова. - АлмаАта: Наука, 1979.-200 с. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601