Термотолерантний штам дріжджів saccharomyces cerevisiae imb y-5053

Реферат: Винахід належить до термотолерантного штаму дріжджів Saccharomyces cerevisiae ІМВ Y-5053, який продукує етанол на пшеничному суслі при підвищених температурах. UA 106336 C2 (12) UA 106336 C2 UA 106336 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до галузі мікробіологічного отримання етанолу з крохмалевмісної сировини і є новим штамом термотолерантних дріжджів Saccharomyces cerevisiae IMB Y-5053. Для отримання спирту з крохмалевмісної сировини на спиртозаводах України використовується в основному пшеничне та кукурудзяне сусло. Державним концерном "Укрспирт" разом з науково-дослідними установами та підприємствами спиртової галузі розроблені інноваційні енергозаощаджуючі технології, які передбачають, зокрема, підвищення концентрації сухих речовин зернового сусла до 26-29 % та концентрації етанолу у зрілій бразі до 13-15 %, що потребує впровадження на спиртозаводах нових ефективних термотолерантних спиртових штамів дріжджів-сахароміцетів з підвищеною осмо- та етанолотолерантністю. Висока концентрація сухих речовин та етанолу у бразі, різке зростання температури браги під час бродіння пригнічують життєдіяльність дріжджових клітин та знижують їх бродильну активність. За дії цих факторів відбувається ціла низка порушень у метаболізмі клітин, що призводить до неефективного використання вуглеводів сусла, зниження виходу етанолу та зростання собівартості його виробництва, а також до погіршення якості спирту через зростання в ньому кількості побічних продуктів (сивушного масла, органічних кислот, альдегідів і ін.). Донедавна на спиртозаводах України при зброджуванні зернового сусла застосовувались раси дріжджів-сахароміцетів XII, II, XV, М, В, К-81, Schizosaccharomyces pombe 80, які є недостатньо ефективними для виробництва спирту при високому вмісті сухих речовин у суслі. На сьогодні почали використовуватися імпортні штами сухих спиртових дріжджів-сахароміцетів "Ферміол" (Данія). "Tega Yeast" (Австрія), "Quickferm Super" (ФРН), "Angel" (Китай) та ін. з покращеними біотехнологічними характеристиками. Їх використання дозволяє отримувати зрілу брагу з вищим вмістом етанолу, що підвищує рентабельність спиртового виробництва. Великою перевагою використання цих дріжджів є також те, що при цьому можна легко збільшувати концентрацію клітин при засіві сусла і таким способом скорочувати тривалість процесу бродіння. Покращені промислові штами спиртових дріжджів - це основа ресурсо- та енергозберігаючих технологій, спосіб зниження собівартості етилового спирту та підвищення рентабельності його виробництва. Важливим для вирішення цієї проблеми є створення колекції штамів з корисними для спиртового виробництва біотехнологічними властивостями, що були виділені з різних екологічних ніш. Такі штами з великою ймовірністю маючи подібні фенотипи можуть мати оригінальні генотипи, Вони могли б бути цінним генетичним матеріалом при конструюванні штамів спиртових дріжджів з підвищеною осмо-, етаноло- та термотолерантністю за допомогою методів класичної генетики та метаболічної інженерії. Об'єктом даного винаходу є штам S. cerevisiae IMB Y-5053, виявлений серед ізолятів дріжджів сахароміцетів з екстремальної природної ніші - Еволюційного Каньйону в Ізраїлі. Він характеризується добрим ростом і бродильною активністю на пшеничному суслі при 34-37 °C, а також підвищеними термо-, осмо- та етанолотолерантністю на цьому середовищі. Штам зберігається в депозитарії Інституту мікробіології та вірусології НАН України. Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні особливості штаму S. cerevisiae IMB Y5053. Вегетативні клітини штаму IMB Y-5053, вирощені в рідкому YPD середовищі при 30 °C протягом 3 діб, мають круглу або овальну форму і розташовані поодиноко. Середній розмір клітин становить 4-5 мкм, максимальний розмір - до 8 мкм. На агаризованому YPD середовищі колонії віком 7 діб округлої форми, діаметром 5-6 мм, пастоподібні, матові, кремового кольору, профіль конусоподібний, структура однорідна, край рівний, поверхня гладка. На скошеному сусло-агарі тридобовий штрих - пастоподібний, гладкий, однорідний, матовий, кремового забарвлення. Клітини штаму IMB Y-5053 асимілюють сахарозу, глюкозу, фруктозу, арабінозу, галактозу, мальтозу, маннозу, меліцитозу, етанол, слабоінулін та трегалозу. Не ростуть на дульциті, ксилозі, лактозі, рамнозі, рибозі, сорбозі, целобіозі, крохмалі, рідкому парафіні, метанолі. Клітини штаму IMB Y-5053 зброджують сахарозу, глюкозу, фруктозу, мальтозу, манозу, галактозу. Арабінозу, інулін, меліцитозу, трегалозу штам не зброджує. Як джерело азоту клітини використовують сульфат амонію, діамоній фосфат, сечовину, але не нітрат натрію. Штам S. cerevisiae IMB Y-5053 належить до факультативних анаеробів, добре росте при температурі 20-37 °C, оптимум температури становить 30-34 °C, оптимум рН середовища - 4-6. Виділений штам пройшов лабораторні дослідження. Бродильну активність заявленого штаму ІМВ-5053 і штаму прототипу "Quickferm Super" досліджували на промисловому пшеничному суслі однієї партії і за однакових умов вирощування. Бродіння проводили протягом 1 UA 106336 C2 5 10 4 діб при 34 °C. Густота засіву сусла - 10 млн. кліт./мл. Етанол у зрілій бразі визначали за допомогою алкогольоксидазно-пероксидазнго методу з використанням набору "Алкотест". 30 Коефіцієнт етанолотолерантності штамів ЕТ (14/2) визначали як співвідношення біомаси на промисловому пшеничному суслі, що містило 14 % екзогенно доданого етанолу, до біомаси на цьому ж суслі, що містило 2 % етанолу після 3 діб вирощуваня при 30 °C. Коефіцієнт 30 осмотолерантності ОТ (40/2) визначали як співвідношення біомаси на промисловому пшеничному суслі, що містило 40 % екзогенно доданої глюкози, до біомаси на цьому ж суслі, що містило 2 % глюкози після 3 діб вирощуваня при 30 °C. Коефіцієнт термотолерантності ТТ(37/30) визначали як співвідношення біомас, отриманих після вирощування дріжджів на промисловому пшеничному суслі при 37 та 30 °C. Сивушні масла визначали у зразках дистилятів, отриманих після простої перегонки зрілої браги, на хроматографі "Кристал 200 М". Отримані біотехнологічні показники для штаму прототипу та заявленого штаму представлено у таблиці: Показники Вміст спирту у бразі, % 30 ET (14/2) 30 OT (40/2) ТТ(37/30) Біомаса, мг/мл, (30 °C) Біомаса, мг/мл, (34 °C) Біомаса, мг/мл, (37 °C) Сивушні масла, мг/л Плоїдність "Quickferm Super" (прототип) 9,3 0,60 0,54 0,62 6,2 4,6 3,9 4117 2n Y-5053 (заявлений штам) 8,5 0,61 0,55 0,81 6,2 5,7 5,0 2624 n 15 20 25 Заявлений штам при 34 °C продукує на промисловому пшеничному суслі етанолу менше, ніж штам прототип (8,5 % проти 9,3 %). За коефіцієнтами етанолотолерантності та осмотолерантності заявлений штам не відрізняється від штаму прототипу, а за термотолерантністю суттєво переважає його (0,81 проти 0,62). Заявлений штам також суттєво переважає штам прототип за ростом при підвищених температурах (5,7 мг/мл проти 4,8 мг/мл при 34 °C та 5,0 мг/мл проти 3,9 мг/мл при 37 °C). У дистилятах зрілих бражок заявленого штаму, отриманих внаслідок зброджування ним промислового пшеничного сусла при 34 °C, було виявлено на 36 % менше сивушного масла, ніж для штаму прототипу. Таким чином, заявлений штам порівняно зі штамом прототипом характеризується кращим ростом на промисловому пшеничному суслі при підвищених температурах та суттєво вищою термотолерантністю і не поступається йому за етаноло- та осмотолерантністю. Штам є гаплоїдом, добре схрещується зі штамами протилежного типу спарювання і може бути використаний як генетичний матеріал для конструювання дріжджів з покращеними біотехнологічними характеристиками для спиртової промисловості. 30 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Термотолерантний штам дріжджів Saccharomyces cerevisiae ІМВ Y-5053 як продуцент етанолу на пшеничному суслі при підвищених температурах. 35 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2