Соєвий білковий продукт, що має змінені характеристики

Реферат: UA 102533 C2 (12) UA 102533 C2 Винахід належить соєвому білковому продукту, отриманому з високоолеїнової сої, де вказаний продукт має щонайменш одну характеристику, вибрану з групи, що включає поліпшену білизну, зменшену міцність гелю та зменшену в'язкість, у порівнянні з соєвим білковим продуктом, отриманим з продовольчої сої із застосуванням того ж способу, як для отримання соєвого білкового продукту з високоолеїнової сої. В соєвому білковому продукті показник білизни підвищений, щонайменш, на 3 % або міцність гелю зменшена щонайменш на 25 %, або в'язкість негідролізованого соєвого білкового продукту зменшена щонайменш на 9 %. Винахід належить також способу покращення здатності висихання соєвого білкового продукту. UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь винаходу Даний винахід стосується соєвих білкових продуктів, отриманих із високоолеїнової сої, де білковий продукт(и) має поліпшену білизну, зменшену в'язкість і зменшену міцність гелю. Передумови винаходу Соя має найвищий вміст білка серед зернових і бобових. Зокрема, соя має близько 40 % білка, тоді як інші бобові мають 20-30 %, а зернові мають близько 8-15 % білка. Соя також включає близько 20 % олії з залишковою сухою вагою головним чином карбогідрату (35 %). На вологій основі (як є) соя включає близько 35 % білка, 17 % олії, 31 % карбогідратів і 4,4 % золи. Запасний білок сої та ліпідні тіла містяться в придатній для вживання м'якоті сої, що зветься сім'ядоля. Комплекс карбогідрату (або дієтична клітковина) також міститься в клітинних стінках сім'ядолі. Зовнішній шар клітин (що називають насіннєва оболонка) складає близько 8 % загальної ваги сої. Сира, полущена соя являє собою, в залежності від сорту, приблизно 18 % олії, 15 % нерозчинних карбогідратів, 14 % вологи та золи та 38 % білка. Рослинні білкові матеріали застосовують як функціональні інгредієнти харчових продуктів та широко застосовуються для підвищення бажаних характеристик харчових продуктів. Соєві білкові матеріали, зокрема, широко застосовуються як функціональні інгредієнти харчових продуктів. Соєві білкові матеріали застосовують як емульгуючу речовину в м'ясних продуктах для зв'язування м'яса і надання м'ясу доброї консистенції та твердості шматка. Іншим звичайним застосуванням соєвих білкових матеріалів як функціональних інгредієнтів харчових продуктів є застосування в якості згущувача для забезпечення в'язкості харчового продукту до консистенції вершків. Взагалі, соєві білкові матеріали включають соєві пластівці, соєву крупу, соєве борошно грубого помелу, соєве борошно, соєві білкові концентрати і соєві білкові ізоляти з головною відміною цих матеріалів у ступіні подрібнення відносно цільної сої. Окрім вмісту соєвого білка, смак, міцність гелю, показник білизни і в'язкість соєвого білкового матеріалу є також відповідними критеріями для вибору соєвого білкового матеріалу як функціональних інгредієнтів харчових продуктів. Звичайний соєвий білковий матеріал може мати стійкий присмак бобу, гіркий смак і запах через присутність деяких летючих сполук та/або небажаний зовнішній вид через присутність інших сполук відносно низької молекулярної ваги в соєвому білковому матеріалі. Даний опис в основному стосується соєвої композиції, що включає білок, що має зменшену міцність гелю, зменшену в'язкість і поліпшену білизну. Патент США № 6599556 B2, виданий Stark et al. 29 липня 2003, описує кондитерські продукти, що мають модифікований матеріал олійного насіння з високим вмістом білка. Патент США № 6716469 B2, виданий Stark et al. 6 квітня, 2004, описує заморожені десертні продукти, що мають модифікований матеріал олійного насіння з високим вмістом білка. Патент США № 6720020 B2, виданий Karleskind et al. 13 квітня 2004, описує композиції напою, що мають модифікований матеріал олійного насіння з високим вмістом білка. Патент Японії № 5168416 A1, виданий Takeshi et al. 2 липня 1993, описує отримання концентрованої сої, що має поліпшений присмак, смак і відтінок кольору та придатна як харчовий матеріал та ін., простою операцією при низькій собівартості без зміни природи білка шляхом промивання сої та ін., водомістким спиртом в умовах слабкої кислоти в присутності кислоти. Патент Японії № 4207159 A1, виданий Hiroko et al 29 липня 1992, описує сировинний матеріал, що має яскравий і білий відтінок кольору та придатний для морських і замішаних диспергованих водою рідин осадженого кислотою соєвого білка з гідроксидом лужного металу для регулювання pH. WO 2007013146A1, опублікована 1 лютого 2007, описує композиції для оброблених соєвих білкових харчових продуктів. Короткий опис винаходу В першому варіанті здійснення даний винахід стосується соєвого білкового продукту, отриманого з високоолеїнової сої, де вказаний продукт має, щонайменш, одну характеристику, вибрану з групи, що складається з поліпшеної білизни, зменшеної міцності гелю і зменшеної в'язкості у порівнянні з соєвим білковим продуктом, отриманим з продовольчої сої із застосуванням того ж способу, що й для отримання соєвого білкового продукту з високоолеїнової сої. У другому варіанті здійснення даний винахід стосується соєвого білкового продукту, отриманого з високоолеїнової сої, що має, щонайменш, 3 % підвищення показника білизни в порівнянні з соєвим білковим продуктом, отриманим з продовольчої сої із застосуванням того ж способу, що й для отримання соєвого білкового продукту з високоолеїнової сої. 1 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В третьому варіанті здійснення даний винахід стосується негідролізованого соєвого білкового продукту, отриманого з високоолеїнової сої, що має зниження в'язкості, щонайменш, 9 % в порівнянні з соєвим білковим продуктом, отриманим з продовольчої сої із застосуванням того ж способу, що й для отримання соєвого білкового продукту з високоолеїнової сої. В четвертому варіанті здійснення даний винахід стосується соєвого білкового продукту, отриманого з високоолеїнової сої, що має зниження міцності гелю, щонайменш, 25 % в порівнянні з соєвим білковим продуктом, отриманим з продовольчої сої із застосуванням того ж способу, що й для отримання соєвого білкового продукту з високоолеїнової сої. В п'ятому варіанті здійснення даний винахід стосується соєвих білкових продуктів, вибраних з групи, що включає соєвий білковий ізолят, соєвий білковий концентрат, соєве борошно грубого помелу, повножирне борошно, знежирене борошно, сухе соєве молоко, соєве молоко, текстуровані білки, текстуроване борошно, текстуровані концентрати та текстуровані ізоляти. В шостому варіанті здійснення даний винахід стосується способу покращення здатності висихати соєвого білкового продукту, що включає подачу, щонайменш, одного соєвого білкового продукту, отриманого з насіння високоолеїнової сої при більш високій подачі твердих речовин до пастеризатора або сушильного апарату в порівнянні з подачею, щонайменш, одного соєвого білкового продукту, отриманого з продовольчої сої. В сьомому варіанті здійснення даний винахід стосується способу покращення здатності висихати соєвого білкового продукту, що включає подачу, щонайменш, одного соєвого білкового продукту, отриманого з насіння високоолеїнової сої при не менш ніж 14 % подачі твердих речовин до пастеризатора або сушильного апарату. Додаткові варіанти здійснення даного винаходу включають соєві білкові продукти з, щонайменш, 40 %, 65 % або 90 % білка (N x 6,25) на сухій основі. В інших аспектах соєві білкові продукти даного винаходу застосовують в харчових продуктах, напоях і кормах для тварин, що включають соєвий білковий продукт даного винаходу. Короткий опис графічних матеріалів і списків послідовностей Даний винахід можна краще зрозуміти з наступного детального опису та прикладених графічних матеріалів та Списку послідовностей, що складають частину даної заявки. Фіг. 1 показує плазміду pKS210. Фіг. 2 показує плазміду PHP17731. Фіг. 3 показує плазміду PHP17064. Фіг. 4 показує фрагмент PHP19340A. Фіг. 5 показує фрагмент PHP17752A. Фіг. 6 показує плазміду PHP19340. Фіг. 7 показує плазміду PHP17752. SEQ ID NO:1 викладає послідовність фрагмента рекомбінантної ДНК PHP21676A SEQ ID NO:2 викладає послідовність 1533 полінуклеотидного фрагмента, що включає 470 нуклеотидів з гена FAD2-2 сої, 420 нуклеотидів з гена FAD2-1 сої, 643 нуклеотидів з гена FAD3 сої. SEQ ID NO:3 викладає нуклеотидну послідовність олігонуклеотидного праймера BM35, що застосовують для ампліфікування фрагмента приблизно 0,9 тисяч пар основ з фрагментного KSFAD2-гібриду рекомбінантної ДНК. SEQ ID NO:4 викладає нуклеотидну послідовність олігонуклеотидного праймера BM39, що застосовують для ампліфікування фрагмента приблизно 0,9 тисяч пар основ з фрагментного KSFAD2-гібриду рекомбінантної ДНК. SEQ ID NO:5 викладає нуклеотидну послідовність олігонуклеотидного праймера BM40, що застосовують для ампліфікування приблизно 0,65 тисяч пар основ фрагмента ДНК з плазміди XF1. SEQ ID NO:6 викладає нуклеотидну послідовність олігонуклеотиду плазміди BM41, що застосовують для ампліфікування фрагмента ДНК приблизно 0,65 тисяч пар основ з плазміди pXF1. SEQ ID NO:7 викладає нуклеотидну послідовність фрагментного KSFAD2-гібриду рекомбінантної ДНК, що включає близько 470 нуклеотидів з гена FAD2-2 сої та 420 нуклеотидівз гена FAD2-1 сої. SEQ ID NO:8 викладає нуклеотидну послідовність олігонуклеотидного праймера KS1, що застосовують для ампліфікування близько 470 нуклеотидів з гена FAD2-2 сої. SEQ ID NO:9 викладає нуклеотидну послідовність олігонуклеотидного праймера KS2, що застосовують для ампліфікування близько 470 нуклеотидів з гена FAD2-2 сої. SEQ ID NO:10 викладає нуклеотидну послідовність олігонуклеотидного праймера KS3, що 2 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосовують для ампліфікування близько 420 нуклеотидів з гена FAD2-1 сої. SEQ ID NO:11 викладає нуклеотидну послідовність олігонуклеотидного праймера KS4, що застосовують для ампліфікування близько 420 нуклеотидів з гена FAD2-1 сої. SEQ ID NO:12 викладає нуклеотидну послідовність касети, що приглушує експресію специфічного до насіння гена, з pKS133, що включає нуклеотиди для Kti3 промотору та термінатору, що обмежує ланцюг нуклеотидів, що викликають формування стовбурової структури, яка оточує унікальний сайт ендонуклеази рестрикції Not I. SEQ ID NO:13 викладає нуклеотидну послідовність плазміди pKS210. SEQ ID NO:14 викладає нуклеотидну послідовність плазміди PHP17731. SEQ ID NO:15 викладає нуклеотидну послідовність фрагмента рекомбінантної ДНК PHP17731A. SEQ ID NO:16 викладає нуклеотидну послідовність фрагмента рекомбінантної ДНК селективного маркера ALS. Цей фрагмент рекомбінантної ДНК включає промотор, функціонально зв'язаний з нуклеотидним фрагментом, що кодує ацетолактатсинтазу сої, до якої можуть бути введені мутації, щоб зробити їх стійкими до обробки сульфонілсечовинними гербіцидами. SEQ ID NO:17 викладає амінокислотну послідовність стійкої до гербіцидів ALS сої, що включає мутації в послідовностях B і F. SEQ ID NO:18 є амінокислотною послідовністю дикого типу консервативної "підпослідовності B" ALS, що описана в патенті США № 5013659. SEQ ID NO:19 викладає амінокислотну послідовність дикого типу консервативної "підпослідовності F" ALS, що описана в патенті США № 5013659. SEQ ID NO:20 викладає амінокислотну послідовність п'яти додаткових амінокислот, введених під час клонування на амінокінці ALS сої. SEQ ID NO:21 викладає нуклеотидну послідовність плазміди PHP17064 SEQ ID NO:22 викладає нуклеотидну послідовність фрагмента рекомбінантної ДНК PHP17064A. SEQ ID NO:23 викладає нуклеотидну послідовність фрагмента PHP19340A. SEQ ID NO:24 викладає нуклеотидну послідовність фрагмента PHP17752A. SEQ ID NO:25 викладає нуклеотидну послідовність плазміди PHP19340. SEQ ID NO:26 викладає нуклеотидну послідовність плазміди PHP17752. Список послідовностей включає однолітерний код для символів нуклеотидної послідовності та трилітерні коди для амінокислот, як визначено відповідно до IUPAC-IUBMB стандартів, описаних в Nucleic Acids Res. 13:3021-3030 (1985) і в Biochemical J. 219 (№ 2):345-373 (1984), які представлені тут посиланням. Символи і формат, що застосовують для даних нуклеотидної та амінокислотної послідовності відповідають правилам, викладеним в 37C.F.R. (Кодекс федеральних правил) §1.822. Детальний опис данного винаходу Всі патенти, патентні заявки та публікації, наведені тут, включені посиланням в їхньому повному обсязі. В контексті даного опису буде використана велика кількість термінів. Як застосовують тут, "соя" відноситься до видів Glycine max, Glycine soja або будь-яких видів, які перехресно сумісні з Glycine max. "Лінія" представляє собою групу рослин подібного походження, які показують або ні невелику генетичну відмінність, щонайменш, однієї характерної риси між індивідами. Такі лінії можуть бути створені за допомогою одного або більше покоління самозапилення і селекції, або вегетативного розмноження від одного батька, що включають техніки із застосуванням тканин або культури клітин. "Агрономічно елітна лінія" або "елітна лінія" відносяться до лінії з бажаною агрономічною продуктивністю, що може або не може бути застосована в промислових масштабах. "Сорт", "культивар", "елітний сорт", або "елітний культивар" відносяться до агрономічно кращої елітної лінії, яку широко випробовували, і застосовують або застосовували для промислового виробництва сої. "Мутація" відноситься до виявляємої та успадкованої генетичної зміни (або спонтанної або викликаної), що не викликана за допомогою виділення або генетичної рекомбінації. "Мутант" відноситься до індивіда, або ряду поколінь індивідів, які мають мутації. "Показник білизни" соєвого білкового продукту відноситься до кольору композиції, що включає соєвий білок. Багато харчових композицій, що включають соєвий білок, будуть мати, до різних ступенів, жовтуватий або коричневий колір. Взагалі, колір даних композицій може бути "поліпшений, » тобто, "показник білизни" продукту може бути підвищений за допомогою способу даного винаходу. Взагалі, показник білизни визначають із застосуванням колориметру, який забезпечує L, a, і b величини кольору для композиції, за допомогою яких показник білизни може 3 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 бути розрахований із застосуванням стандартного виразу показника білизни (WI), WI=L-3b. L складова частина в основному вказує на білизну або, "яскравість", зразка; L значення близько 0 вказують на чорний зразок, тоді як L значення близько 100 вказують на білий зразок. Значення b вказує на жовті і блакитні кольори, присутні в зразку; позитивні значення b вказують на присутність жовтих кольорів, тоді як негативні значення b вказують на присутність блакитних кольорів. Значення a, яке можна застосовувати в інших вимірах кольору, вказує на червоні і зелені кольори; позитивне значення величини вказує присутність червоних кольорів, тоді як негативні значення вказують на присутність зелених кольорів. Для значень b і a абсолютне значення виміру підвищується безпосередньо з підвищенням інтенсивності відповідного кольору. В основному, колориметр стандартизують із застосуванням білої стандартної плитки, що надається з колориметром. Зразок потім поміщають в скляну камеру, яку вводять до колориметру. Камеру зі зразком накривають непрозорою кришкою для мінімізації можливості проходження зовнішнього світла до детектора крізь зразок і служить як постійна під час вимірювання зразка. Після зчитування камеру зі зразком спорожняють і зазвичай повторно наповнюють так, як в основному вимірюють багатократні зразки подібного матеріалу і показник білизни матеріалу виражають як середнє вимірів. Придатні колориметри в основному включають вироблені HunterLab (Reston, VA), що включають, наприклад, модель # DP-9000 з оптичним датчиком D 25. Вимірювання індексу білизни 5 % за вагою зразка твердих речовин суспензії до і після обробки визначають із застосуванням HunterLab DP-9000 колориметру, що включає оптичний датчик D-25, обидва вироблені Hunter Associates Laboratory (HunterLab) (Reston, VA). Для вимірювання показника білизни в позиції великомасштабного виробництва, білкові зразки диспергують на 5 % вага/вага основі: (5,25 г) додають до деіонізованої води (100 мл). Для вимірювання показника білизни в позиції великомасштабного виробництва, 1 г білкового зразка диспергують в 19 мл деіонізованої води на вага/об'єм основі. Результати, отримані із застосуванням Hunter колориметру наведені в одиницях L, a, і b. Показник білизни розраховують з L і b значень поділу із застосуванням наступного: показник білизни = L – 3b. Додатково до поліпшеного кольору соєвий білковий продукт, виготовлений за допомогою способів в даному описі, може мати зменшену в'язкість. В'язкість, загущення й інші показники формування структури представляють собою важливі властивості соєвих білків, так як вони сприяють загальній корисності продукту при застосуванні. Білки сприяють твердості й еластичності продуктів за допомогою формування тривимірної сітки поєднаних білкових молекул, що затримують воду. Іноді необхідно мати такі властивості, наприклад, у випадку м'ясоподібних продуктів, або може бути бажаним мати меншу функціональність, наприклад при застосуванні як напоїв. Для застосування як напоїв, нижча в'язкість може бути необхідною для чутливості, смакового відчуття і текстурних властивостей напоїв. Композиції з нижчою в'язкістю, що включають соєвий білок, можуть бути призначені для застосування в рідких продуктах (тобто, напоях); і додатково, в деяких варіантах здійснення, композиції з нижчою в'язкістю, що включають соєвий білок, можуть бути необхідні для застосування в м'ясних продуктах. Як застосовують тут, вираз "в'язкість" означає видиму в'язкість водної зависі або розчину, як виміряли за допомогою віскозиметра з обертовим шпинделем із застосуванням великого кільцевого простору, де особливо переважним віскозиметром з обертовим шпинделем є віскозиметр Brookfield. В іншому варіанті здійснення видиму в'язкість можна визначити із застосуванням віскозиметра Rapid Visco Analyzer (RVA) або реометра AR-1000. Взагалі вираз в'язкість відноситься до видимої в'язкості зависі або розчину, як виміряли за допомогою віскозиметра з обертовим шпинделем із застосуванням великого кільцевого простору, де особливо переважним віскозиметром з обертовим шпинделем є Brookfield віскозиметр. Видиму в'язкість соєвого білкового матеріалу можна виміряти, наприклад, за допомогою зважування зразка соєвого матеріалу та води для отримання відомого співвідношення соєвого матеріалу до води (переважно 1 частина соєвого матеріалу до 9 частин води, за вагою), поєднання та змішування соєвого матеріалу і води в змішувачі або апараті для змішування для формування гомогенної зависі соєвого матеріалу та води при температурі зовнішнього середовища та нейтральному pH, і вимірюванні видимої в'язкості зависі за допомогою віскозиметра з обертовим шпинделем із застосуванням великого кільцевого простору, що працює при приблизно 60 обертів на хвилину і при обертаючому моменті від 30 до 70 %. Іншою важливою функціональною характеристикою є властивість формування гелю білка. Загущення білка важливе для отримання необхідної чутливості та текстурних структур в харчових продуктах. 4 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 Формування білкового гелю представляє собою двоетапний процес, який починається з часткової денатурації білкових молекул. У міру того як денатурують білки, підвищується в'язкість зависі як результат підвищення молекулярних змін, пов'язаних з розгортанням білків. Впродовж другої частини процесу спостерігається велике підвищення в'язкості, обумовлене білковим об'єднанням і розвитком молекулярної сітки. Феномен загущення потребує рушійної сили для розгортання нативної структури білка, за подальшим збиранням, підтримуючи певний рівень порядку формування матриці об'єднанням білкових ланцюгів. Загущення білка традиційно досягалось нагріванням, але деякі фізичні та хімічні процеси формують білкові гелі шляхом, аналогічним індукції теплом. Фізичні означають, окрім тепла, високий тиск. Хімічні означають окислення, ферментативне перехресне зшивання та застосування солей і сечовини, викликаючи зміни у взаємодіях білок-білок і білоксередовище. Характеристики кожного гелю різні та залежать від факторів як концентрація білка, ступінь денатурації, викликаний pH, температурою, іонною силою і/або тиском. Вираз "міцність гелю" відноситься до здатності або міри білка для формування гелів. Вираз "жирні кислоти" відноситься до довголанцюгових аліфатичних кислот (алканові кислоти) різної довжини ланцюга, від близько C12 до C22 (хоча відомі кислоти і з довшим і з коротшим ланцюгом). Переважною довжиною ланцюга є від C16 до C22. Структура жирних кислот представлена простою системою позначень "X:Y", де X представляє собою загальну кількість C атомів в конкретній жирній кислоті, а Y представляє собою кількість подвійних зв'язків. В основному, жирні кислоти класифікують як насичені або ненасичені. Вираз "насичені жирні кислоти" відноситься до тих жирних кислот, що не мають "подвійних зв'язків" в їхньому вуглецевому скелеті. На відміну від цього, "ненасичені жирні кислоти" мають "подвійні зв'язки" вдовж їхніх вуглецевих скелетів (які в основному знаходяться в цис-конфігурації). "Мононенасичені жирні кислоти" мають тільки один "подвійний зв'язок" вдовж вуглецевого скелету (наприклад, зазвичай між 9-им і 10-им атомом вуглецю в пальмітолеїновій кислоті (16:1) і олеїновій кислоті (18:1)), тоді як "поліненасичені жирні кислоти" (або "ПННЖКи") мають, щонайменш, два подвійних зв'язки вдовж вуглецевого скелету (наприклад, між 9-им і 10-им, і 12-им і 13-им атомами вуглецю в лінолевій кислоті (18:2); і між 9-им і 10-им, 12-им і 13-им, і 15им і 16-им в α-ліноленовій кислоті (18:3)). Вираз "загальний вміст жирної кислоти" відноситься до суми п'яти основних складових частин жирної кислоти, що знаходяться в соєвих бобах, а саме C16:0, C18:0, C18:1, C18:2 і C18:3. Вираз "загальний вміст поліненасичених жирних кислот" відноситься до загального вмісту C18:2 плюс C18:3. Для цілей даного опису застосовують омега-систему відліку для вказування номеру атомів вуглецю, кількості подвійних зв'язків і положення подвійного зв'язку, найближчого до омега атому вуглецю, що відліковується від омега атому вуглецю (який є кінцевим вуглецем аліфатичного ланцюга і нумерується 1 для даної цілі). Ця номенклатура показана нижче в таблиці 1, в колонці під назвою "Скорочене позначення". 40 Таблиця 1 Номенклатура поліненасичених жирних кислот Загальна назва Лінолева α-Ліноленова 45 50 Абревіатура LA αLIN Хімічна назва цис-9,12-октадекадієнова цис-9,12,15-октадекатриєнова Скорочене позначення 18:2 ω-6 18:3 ω -3 Вираз "десатураза" відноситься до поліпептиду, який може зменшувати насиченість, тобто, вводити подвійний зв'язок, в одну або більше жирних кислот для виготовлення моно- або поліненасиченої жирної кислоти або попередника інтересу. Незважаючи на застосування омегасистеми відліку в описі стосовно специфічних жирних кислот, зручніше вказувати активність десатурази за допомогою відліку від карбоксильного кінця субстрату із застосуванням Δсистеми. Вирази "FAD" і десатураза жирної кислоти застосовують рівнозначно та відносно до десатураз мембранозв'язаного мікросомального олеоїл- і лінолеоїл-фосфатидилхоліну, що перетворює олеїнову кислоту до лінолевої кислоти та лінолеву кислоту до ліноленової кислоти, відповідно, в реакціях, що відновлюють молекулярний кисень до води та потребують присутності НАДН. 5 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вираз "високоолеїнова соя" відноситься до насіння сої, що має вміст олеїнової кислоти, щонайменш, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % і 95 % насіння за вагою. Переважний вихідний олійний матеріал високоолеїнової сої описаний в міжнародній патентній публікації WO94/11516, опис якої представлений тут посиланням. Вираз "активність" ферменту відноситься до здатності ферменту перетворювати субстрат на продукт. Вирази "полінуклеотид", "полінуклеотидна послідовність", "послідовність нуклеїнової кислоти", "фрагмент нуклеїнової кислоти" і "фрагмент виділеної нуклеїнової кислоти" застосовують рівнозначно. Ці вирази охоплюють нуклеотидні послідовності та подібне. Полінуклеотид може бути полімером РНК або ДНК, що є одно- або дволанцюговим, який необов'язково включає синтетичні, які не зустрічаються в природі або змінені нуклеотидні основи. Полінуклеотид у формі полімеру ДНК може включати один або більше відрізків кДНК, геномної ДНК, синтетичної ДНК або їх комбінацій. Нуклеотиди (зазвичай зустрічаються у формі їх 5’-монофосфату) називають за допомогою окремого літерного позначення наступним шляхом: "A" аденілат або дезоксіаденілат (для РНК або ДНК, відповідно), "C" цитидилат або дезоксицитидилат, "G" гуанілат або дезоксигуанілат, "U" уридилат, "T" для дезокситимідилат, "R" пурини (A або G), "Y" пиримідини (C або T), "K" -G або T, "H" - A або C або T, "I" -інозин і "N" будь-який нуклеотид. Вирази "субфрагмент, який є функціонально еквівалентним" і "функціонально еквівалентний субфрагмент" застосовують рівнозначно. Ці вирази відносяться до частини або підпослідовності фрагмента виділеної нуклеїнової кислоти, в якому зберігається здатність змінювати експресію гена або продукувати певний фенотип незалежно від того, кодує чи ні фрагмент або субфрагмент активний фермент. Наприклад, фрагмент або субфрагмент застосовують при конструюванні химерних генів для виготовлення бажаного фенотипу в трансформованій рослині. Химерні гени можуть бути сконструйовані для застосування в супресії за допомогою з'єднання фрагмента нуклеїнової кислоти або її субфрагмента, незалежно від того, кодує чи ні він активний фермент, в смисловій або антисмисловій орієнтації відносно послідовності промотору рослини. Вирази "гомологія", "гомологічний", "значно подібний" і "значно відповідний" застосовують рівнозначно. Вони відносяться до фрагментів нуклеїнової кислоти, де зміни в одній або більше нуклеотидних основах не впливають на здатність фрагмента нуклеїнової кислоти опосередковувати експресію гена або продукувати певний фенотип. Ці вирази також відносяться до модифікацій фрагментів нуклеїнової кислоти даного винаходу, таких як делеція або вставка одного або більше нуклеотидів, які значно не змінюють функціональні властивості отриманого фрагмента нуклеїнової кислоти відносно початкового, немодифікованого фрагмента. Таким чином зрозуміло, як оцінить спеціаліст даної галузі техніки, що даний винахід охоплює більше, ніж специфічні типові послідовності. "Ген" відноситься до фрагмента нуклеїнової кислоти, що експресує специфічний білок, що включає регуляторні послідовності, що передують (5’ некодуючі послідовності) і слідують за (3’ некодуючі послідовності) кодуючою послідовністю. "Нативний ген" відноситься до гена, який знаходиться в природі з власними регуляторними послідовністями. "Химерний ген" відноситься до будь-якого гена, який не є нативним геном, що включає регуляторні і кодуючі послідовності, які не знаходяться разом в природі. Отже, химерний ген може включати регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, отримані з різних джерел, або регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, отримані з одного джерела, але розташовані іншим чином, ніж знаходиться у природі. "Чужорідний" ген відноситься до гена, що звичайно не знаходиться в організмі-хазяїні, але який введений в організм-хазяїн за допомогою переносу генів. Чужорідні гени можуть включати нативні гени, вставлені в нерідний організм, або химерні гени. "Трансген" представляє собою ген, який введено в геном за допомогою процедури трансформації. "Алель" представляє собою одну з декілька альтернативних форм гена, який займає заданий локус в хромосомі. Коли всі алелі, присутні в заданому локусі в хромосомі, однакові, рослина є гомозиготною за цим локусом. Якщо алелі, присутні в заданому локусі в хромосомі, різні, рослина є гетерозиготною за цим локусом. "Кодон-оптимізований ген" представляє собою ген, що має свою частоту застосування кодону, сконструйований для імітування частоти переважного застосування кодону клітини-хазяїна. "Кодуюча послідовність" відноситься до ДНК послідовності, що кодує специфічну амінокислотну послідовність. "Регуляторні послідовності" відносяться до нуклеотидних 6 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 послідовностей, розташованих вище (5’ некодуючі послідовності), в межах, або нижче (3’ некодуючі послідовності) кодуючої послідовності, й які впливають на транскрипцію, процесинг або стабільність РНК, або трансляцію асоційованих кодуючих послідовностей. Регуляторні послідовності можуть включати, але не обмежені цим, промотори, трансляційні лідерні послідовності, інтрони та послідовності розпізнавання поліаденілювання. "Промотор" відноситься до області ДНК, здатної контролювати експресію кодуючої послідовності або функціональної РНК. Промоторна послідовність включає проксимальні та найбільш дистальні вище розташовані елементи. Ці елементи, розташовані вище, часто називають енхансери. Отже, "енхансер" представляє собою послідовність ДНК, яка може стимулювати активність промотору і може бути природним елементом промотору або гетерологічним елементом, вставленим для підвищення рівню або тканинної специфічності промотору. Промотори можуть бути отримані в їхньому повному обсязі з нативного гена, або складені з різних елементів, отриманих з різних промоторів, що знаходяться в природі, або навіть включати сегменти синтетичної ДНК. Спеціалісту даної галузі техніки буде зрозуміло, що різні промотори можуть керувати експресією гена в різних тканинах або типах клітин або на різних стадіях розвитку, або у відповідь на різні умови оточуючого середовища. Далі буде очевидно, що через те, що в більшості випадків не повністю визначені точні межі регуляторних послідовностей, фрагменти ДНК деяких різновидів можуть мати ідентичну промоторну активність. Промотори, що викликають експресію гена в більшості типів клітин, в більшості випадків звичайно називають "конститутивні промотори". Безперервно відкривають нові промотори різних типів, що застосовують в рослинних клітинах; велику кількість прикладів можна знайти в збірнику Okamuro and Goldberg (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82. Будь-який специфічний для насіння промотор застосовують згідно зі способом даного винаходу. Таким чином, походження промотору, обраного для керування експресією фрагмента рекомбінантної ДНК не є вирішальним доки він здатен здійснювати даний винахід шляхом транскрибування достатньої кількості РНК з бажаного фрагмента(ів) нуклеїнової кислоти в насінні. Багато промоторів описано в WO 00/18963, опублікованій 6 квітня, 2000, опис якої представлений тут посиланням. Приклади специфічних для насіння промоторів включають, і не обмежені цим, промотор для інгібітору трипсину сої Kunitz (Kti3, Jofuku and Goldberg (1989) Plant Cell 1:1079-1093) β-конгліциніну (Chen et al. (1989) Dev. Genet. 10: 112-122), napin промотор і phaseolin промотор. Специфічні приклади промоторів, які можуть бути придатні для експресії фрагментів нуклеїнової кислоти даного винаходу, включають, але не обмежені цим, промотор синтази SAM (міжнародна публікація WO00/37662, опублікована 29 червня, 2000), CaMV 35S (Odell et al (1985) Nature 313:810-812) і промотор, описаний в міжнародній публікації WO02/099063, опублікованій 12 грудня, 2002. "Трансляційна лідерна послідовність" відноситься до полінуклеотидної послідовності, розташованої між промоторною послідовністю гена та кодуючою послідовністю. Трансляційна лідерна послідовність присутня в повністю процесованій мРНК вище послідовності початку трансляції. Трансляційна лідерна послідовність може впливати на процесинг первинного транскрипту в мРНК, стабільність мРНК або ефективність трансляції. Описано приклади трансляційних лідерних послідовностей (Turner, R. і Foster, G. D. Mol. Biotech. 3:225 (1995)). "3’ некодуючі послідовності" або "послідовності термінації/термінатору транскрипції" відносяться до ДНК-послідовностей, розташованих нижче кодуючої послідовності та включають послідовності розпізнавання поліаденілювання та інші послідовності, що кодують регуляторні сигнали, здатні впливати на процесинг мРНК або експресію гена. Сигнал поліаденілювання зазвичай характеризується впливанням на додавання ділянок поліаденілової кислоти до 3’ кінця попередника мРНК. Застосування різних 3’некодуючих послідовностей наведено в Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cells 1:671-680. "Інтрон" представляє собою проміжну послідовність в гені, яка не кодує частину білкової послідовності. Таким чином, такі послідовності транскрибуються в РНК, але потім вирізаються та не транслюються. Вираз також застосовують для вирізаних РНК послідовностей. "Екзон" представляє собою частину послідовності гена, яка транскрибована і знаходиться в зрілій матричній РНК, отриманій з гена, але не обов'язково є частиною послідовності, що кодує кінцевий продукт гена. "РНК транскрипт" відноситься до продукту, отриманого транскрипцією, що каталізується РНК-полімеразою, ДНК послідовності. Якщо РНК-транскрипт представляє собою повністю комплементарну копію ДНК послідовності, його називають первинний транскрипт. РНК транскрипт називають зрілою РНК, якщо він представляє собою РНК послідовність, отриману 7 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пост-транскрипційним процесингом первинного транскрипту. "Матрична РНК (мРНК)» відноситься до РНК, що не має інтронів і що може бути трансльована в білок клітиною. "кДНК" відноситься до ДНК, що є комплементарною до та синтезованою з матриці мРНК із застосуванням ферменту зворотної транскриптази. КДНК може бути одноланцюговою або перетвореною в дволанцюгову форму із застосуванням фрагмента Кльонова ДНК полімерази I. "Смислова" РНК відноситься до РНК транскрипту, що включає мРНК і може бути трансльований в білок в клітині або in vitro. "Антисмислова РНК" стосується транскрипту РНК, що є комплементарним до всього або частини цільового первинного транскрипта або мРНК, і який блокує експресію цільового виділеного фрагмента нуклеїнової кислоти (патент США № 5107065). Комплементарність антисмислової РНК може бути з будь-якою частиною специфічного транскрипту гена, тобто в 5'-некодуючої послідовності, 3'-некодуючої послідовності, інтронах або кодуючої послідовності. "Функціональна РНК" відноситься до антисмислової РНК, рибозимної РНК або іншої РНК, яка не може бути трансльована, але все ще впливає на клітинні процеси. Вирази "комплемент" і "зворотній комплемент" застосовують рівнозначно відносно мРНК транскриптів і з метою визначення антисмислової РНК одиниці генетичного коду. Вираз "функціонально зв'язаний" стосується з'єднання послідовностей нуклеїнових кислот на одному фрагменті нуклеїнової кислоти так, щоб функція одного регулювалася функцією іншого. Наприклад, промотор функціонально зв'язаний із кодуючою послідовністю, коли вона здатна регулювати експресію даної кодуючої послідовності (тобто, кодуюча послідовність знаходиться під транскрипційним контролем промотору). Кодуючі послідовності можуть бути функціонально зв'язані з регуляторними послідовностями в смисловій або антисмисловій орієнтації. В іншому прикладі області комплементарної РНК даного винаходу можуть бути функціонально зв'язані або безпосередньо, або опосередковано, 5" кінцем з цільовою мРНК, або 3" кінцем з цільовою мРНК, або в межах цільової мРНК, або перша комплементарна область є 5" кінцем і її комплемент є 3" кінцем до цільової мРНК. Вираз "ендогенна РНК" відноситься до будь-якої РНК, яка кодована будь-якою послідовністю нуклеїнової кислоти, присутньою в геномі хазяїна до трансформації рекомбінантним конструктом даного винаходу, не залежно від того, чи зустрічається або ні в природі, тобто, введений рекомбінантними засобами, мутагенезом та ін. Вираз "не зустрічається в природі" означає штучний, не пов'язаний з тим, що за нормальних умов знаходиться в природі. Стандартна рекомбінантна ДНК і техніки молекулярного клонування, що застосовують тут добре відомі в техніці й описані більш повно в Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989. Способи трансформації добре відомі спеціалісту даної галузі техніки й описані нижче. "ПЛР" або "полімеразна ланцюгова реакція" представляє собою техніку синтезу великої кількості сегментів специфічної ДНК, включає серії повторюваних циклів (Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, CT). Зазвичай, дволанцюгова ДНК денатурують нагріванням, два праймери, комплементарні до 3’ кінців цільової ділянки обпалюють при низькій температурі та потім подовжують при проміжній температурі. Один набір цих трьох послідовних етапів називають цикл. Вираз "рекомбінантний" стосується штучної комбінації двох сегментів послідовності, інакше відділених один від одного, наприклад, за допомогою хімічного синтезу або маніпуляцією з виділеними сегментами нуклеїнових кислот за допомогою методів генної інженерії. Вирази "плазміда", "вектор" і "касета" відносяться до позахромосомного елементу, який часто несе гени, які не є частиною центрального метаболізму клітини, і зазвичай у формі фрагментів кільцевої дволанцюгової ДНК. Такі елементи можуть бути послідовностями, що автономно реплікуються, послідовностями, що інтегруються в геном, фаговими або нуклеотидними послідовностями, лінійними або кільцевими, одно- або дволанцюговою ДНК або РНК, що отримані з будь-якого джерела, в якому велика кількість нуклеотидних послідовностей приєднана або рекомбінована в унікальну конструкцію, яка здатна вводити фрагмент промотору та послідовність ДНК для обраного продукту гена разом із придатною 3'-нетрансльованою послідовністю в клітину. "Касета для трансформації" відноситься до специфічного вектору, що включає чужорідний ген і має елементи додатково до чужорідного гена, які полегшують трансформацію конкретної клітини-хазяїна. "Експресуюча касета" відноситься до специфічного вектору, щовключає чужорідний ген і має елементи додатково до чужорідного гена, які передбачають підвищену експресію гена в чужорідному хазяїні. Вирази "рекомбінантний конструкт", "експресуючий конструкт", "химерний конструкт", "конструкт", і "рекомбінантний ДНК-конструкт" застосовують рівнозначно. Рекомбінантний 8 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 конструкт включає комбінацію фрагментів нуклеїнової кислоти, яка не зустрічається в природі, наприклад, регуляторні та кодуючі послідовності, які не знаходяться разом в природі. Наприклад, химерний конструкт може включати регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, отримані з різних джерел, або регуляторні послідовності та кодуючі послідовності, отримані з одного джерела, але розташовані таким чином, що відрізняється від такого, що знаходиться у природі. Такий конструкт можна застосовувати самого по собі або можна застосовувати разом з вектором. Якщо застосовують вектор, тоді вибір вектору залежить від способу, який застосовують для трансформації клітин-хазяїнів, які добре відомі спеціалісту даної галузі техніки. Наприклад, можна застосовувати плазмідний вектор. Спеціаліст даної галузі добре знає генетичні елементи, які мають бути присутні на векторі для успішної трансформації, селекції та розмноження клітин-хазяїнів, що включають будь-які фрагменти виділеної нуклеїнової кислоти даного винаходу. Спеціаліст даної галузі також дізнається, що різні незалежні події трасформації призведуть до різних рівней і моделей експресії (Jones et al., (1985) EMBO J. 4:2411-2418; De Almeida et al., (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78-86) і, таким чином, що множинні події мають бути піддані скринінгу з метою отримання ліній, що демонструють бажаний рівень і модель експресії. Такий скринінг може бути виконаний за допомогою Саузерн-аналізу ДНК, Нозерн-аналізу експресії мРНК, імуноблотингового аналізу експресії білка або, серед інших, фенотипічного аналізу. Вираз "експресія", як застосовують, тут стосується продукування функціонального кінцевого продукту, наприклад, мРНК або білка (попередника або зрілого). Вираз "експресуюча касета" як застосовують тут, відноситься до роздільного фрагмента нуклеїнової кислоти, до якого можуть бути переміщені послідовність нуклеїнової кислоти або фрагмент. "Зрілий" білок стосується поліпептиду, підданому посттрансляційному процесингу; тобто поліпептиду, з якого вилучені будь-які пре- і пропептиди, що були присутніми у первинному продукті трансляції. Білок "попередник" стосується первинного продукту трансляції мРНК; тобто з усе ще присутніми пре- і пропептидами. Пре- і пропептиди можуть бути, без обмеження, сигналами внутрішньоклітинної локалізації. "Косупресія" стосується отримання смислових транскриптів РНК, здатних супресувати експресію ідентичних або значно подібних нативних генів (патент США № 5231020, виданий Jorgensen et al. 27 липня, 1999). Конструкти косупресії в рослинах були попередньо сконструйовані, фокусуванням на надекспресії послідовності нуклеїнової кислоти, що має гомологію з нативною мРНК, в смисловій орієнтації, яка призводить до зниження всієї РНК, що має гомологію зі надекспресованою послідовністю (дивись Vaucheret et al. (1998) Plant J. 16:651659; і Gura (2000) Nature 404:804-808. "Антисмислове інгібування" стосується отримання антисмислових транскриптів РНК, здатних супресувати експресію цільового білка. Можна використовувати послідовності рослинних вірусів для напрямку супресії проксимальних кодуючих мРНК послідовностей (РСТ публікація WO 98/36083, опублікована 20 серпня 1998 р.). Раніше описано використання структур "шпильки", що включають усю послідовність мРНК, що кодує, або її частину, у комплементарній орієнтації, що приводить до потенційної структури "стебло-петля" для експресованої РНК (РСТ публікація WO 99/53050, опублікована 21 жовтня 1999 р.). У даному випадку стебло формується полінуклеотидами, що відповідають гену, що представляє інтерес, що вставлені або в смисловій, або в антисмисловій орієнтації стосовно промотору, а петля формується декількома полінуклеотидами гена, що представляє інтерес, що не мають комплемента в конструкті. Це підвищує частоту косупресії або сайленсингу в регенерованих трансгенних рослинах. Огляд шпилькової супресії дивись в Wesley, S.V. et al. (2003) Methods in Molecular Biology, Plant Functional Genomics: Methods and Protocols 236:273286. Конструкт, у якому стебло формується, щонайменш, 30 нуклеотидами з гена, що повинний супресуватися, і петля формується випадковою нуклеотидною послідовністю, також ефективно використовувався для супресії (публікація РСТ WO 99/61632, опублікована 2 грудня 1999 р.). Також описане використання послідовностей полі-Т і полі-А для генерування стебла в структурі "стебло-петля" (РСТ публікація WO 02/00894, опублікована 3 січня 2002 р.). Ще один варіант включає використання синтетичних повторів для промотування формування стебла в структурі "стебло-петля". Трансгенні організми, отримані з такими фрагментами рекомбінантної ДНК, як показано, мають знижені рівні білка, що кодується нуклеотидним фрагментом, що утворить петлю, як описано в РСТ публікації WO 02/00904, опублікованої 3 січня 2002 р. Також описане застосування конструктів, які призводять до длРНК (дволанцюгова РНК). В цих конструктах конвергентні промотори керують транскрипцією ген-специфічної смислової й антисмислової РНК, індукуючи супресію гена (дивись, наприклад, Shiet al. (2000) RNA 6:1069-1076; Bastinet al. (2000) J. Cell Sci. 113:3321-3328; Giordanoet al. (2002) Genetics 160:637-648; LaCount and 9 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Donelson. Заявка на патент США № 20020182223, опублікована 5 грудня, 2002;Tranet al. (2003) BMC Biotechnol. 3:21; і попередня заявка на патент США № 60/578,404, подана 9 квітня, 2004). Інші способи супресії ферменту включають, але не обмежені цим, застосування полінуклеотидів, які можуть формувати каталітичну РНК або можуть мати рибозимну активність (патент США № 4987071, виданий 22 січня, 1991), і мікро РНК (що також звуться міРНК) інтерференцію (Javier et al. (2003) Nature 425:257-263). МікроРНК (міРНК) представляють собою малі регуляторні РНК, що контролюють експресію гена. МіРНК зв'язані з областями цільових РНК і інгібують їх трансляцію і, таким чином, перешкоджають продукуванню поліпептиду, що кодується цільовою РНК. МіРНК можуть бути сконструйовані так, що бути комплементарними до будь-якої області цільової послідовності РНК, що включає 3" область, що не транслюється, кодуючу область та ін. МіРНК процесовані з високо структурованих попередників РНК, які процесовані дією рибонуклеази III, яка зветься DICER. Тоді як механізм дії міРНК не відомий, виявляється, що вони функціонують для регулювання експресії цільового гена. Дивись, наприклад, публікацію патенту США № 2004/0268441 Al, опубліковану 30 грудня, 2004. Вираз "експресія", як застосовують тут, відноситься до продукування функціонального кінцевого продукту, будь то мРНК або трансляції мРНК в поліпептид. "Антисмислове інгібування" відноситься до продукування антисмислових транскриптів РНК, здатних супресувати експресію цільового білка. "Косупресія" стосується продукування смислових транскриптів РНК, здатних супресувати експресію ідентичних або значно подібних чужорідних або ендогенних генів (патент США № 5231020). "Надекспресія" відноситься до продукування функціонального кінцевого продукту в трансгенних організмах, що перевищує рівні продукування в порівнянні з експресією функціонального кінцевого продукту в нормальному, дикого типу або нетрансформованому організмі. "Стабільна трансформація" стосується введення фрагмента нуклеїнової кислоти в геном організму-хазяїна, що включає і геном ядра і геном органел, і приводить до генетично стабільного спадкування. На відміну від цього, "нестійка трансформація" стосується введення фрагмента нуклеїнової кислоти в ядро, або ДНК-утримуючу органелу, організму-хазяїна, що приводить до експресії гена без інтеграції або генетично стабільного спадкування. Організмихазяїни, які включають трансформовані фрагменти нуклеїнової кислоти, називають "трансгенні" організми. Стандартна рекомбінантна ДНК і методи молекулярного клонування, що застосовують тут, добре відомі в техніці і описані Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989); by Silhavy et al.,Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984); і Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, опублікована Greene Publishing Assoc. і Wiley-Interscience (1987). Як тільки рекомбінантний конструкт зроблено, він потім може бути введений в рослинну клітину або дріжджову клітину на вибір за допомогою способів, добре відомих спеціалісту даної галузі техніки, що включають, наприклад, трансфекцію, трансформацію і електропорацію (дивись нижче). Рослинні клітини олійного насіння є переважними рослинними клітинами. Трансформовані рослинні клітини потім культивують і вирощують в придатних умовах, дозволяючи експресію рекомбінантного конструкту, який потім виділяють і очищують. Рекомбінантні конструкти можуть бути введені в одну рослинну клітину або, альтернативно, конструкт може бути введений в окремі рослинні клітини. Експресія в рослинній клітині може бути виконана нестійким або стабільним чином, як описано вище. Частини рослин включають диференційовані і недиференційовані тканини, що включають, але не обмежені цим: коріння, стеблини, пагони, листя, пилок, насіння, пухлинну тканину та різноманітні форми клітин і культури, такі як окремі клітини, протопласти, зародки і тканина калюсу. Рослинна тканина може бути в рослині або в органі, тканині або культурі клітин. Вираз "орган рослини" відноситься до тканини рослини або групи тканин, які складають морфологічно та функціонально відмінні частини рослини. Вираз "геном" відноситься до наступного: 1. Весь комплемент генетичного матеріалу (гени і некодуючі послідовності), присутній в кожній клітині організму, або вірусі або органелі. 2. Повний набір хромосом, успадкований як (гаплоїд) одиниця від одного батька. Вираз "стабільно інтегрований" відноситься до переміщення фрагмента нуклеїнової кислоти в геном організму-хазяїна або клітини, призводячи до генетично стабільного успадкування. Способи трансформації дводольних, головним чином із застосуванням Agrobacterium tumefaciens, і отримання трансгенних рослин опубліковані, серед інших, для бавовнику (патент 10 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 США № 5004863, патент США № 5159135); сої (патент США № 5569834, патент США № 5416011); Brassica (патент США № 5463174); арахісу (Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep. 15:653-657, McKently et al. (1995) Plant Cell Rep. 14:699-703); папайї (Ling et al. (1991) Bio/technology 9:752-758); і гороху (Grant et al. (1995) Plant Cell Rep. 15:254-258). Для огляду інших загальновживаних способів трансформації рослин дивись Newell (2000) Mol. Biotechnol. 16:53-65. Один з цих способів трансформації застосовує Agrobacterium rhizogenes (Tepfler, and Casse-Delbart (1987) Microbiol. Sci. 4:24-28). Трансформація сої із застосуванням прямої доставки ДНК опубліковано із застосуванням ПЕГ (поліетиленгліколь) злиття (міжнародна публікація WO 92/17598), електропорації (Chowrira et al. (1995) Mol. Biotechnol. 3:17-23; Christou et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:3962-3966), мікроін'єкції або бомбардування частинками (McCabe et. al. (1988) Bio/Technology 6:923; Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671-674). Існує безліч способів регенерації рослин з рослинної тканини. Конкретний спосіб регенерації буде залежати від вихідної рослинної тканини та конкретних видів рослин, що необхідно регенерувати. У даній галузі добре відомі регенерація, розвиток і культивація рослин з окремих трансформантів протопласта рослин або з різних трансформованих експлантатів (Weissbach і Weissbach, In: Methods for Plant Molecular Biology, (Eds.), Academic Press, Inc. San Diego, CA, (1988)). Даний процес регенерації та росту звичайно включає стадії відбору трансформованих клітин, культивування цих індивідуалізованих клітин на звичайних етапах зародкового розвитку та кореневого сходу. Трансгенні зародки та насіння регенерують подібним способом. Отримані в результаті трансгенні кореневі пагони потім висаджують у відповідне середовище для росту рослини, таке як ґрунт. Переважно, регенеровані рослини є самозапильними для забезпечення гомозиготних трансгенних рослин. Інакше, пилок, отриманий від регенерованих рослин, схрещується з вирощеними з насінь рослинами агрономічно важливих ліній. І навпаки, пилок рослин цих важливих ліній використовується для запилення регенерованих рослин. Трансгенна рослина даного винаходу, що містить бажаний поліпептид, культивується з використанням способів, добре відомих фахівцям у даній галузі. На додаток до вищевказаних процедур, спеціалісти-практики знайомі зі матеріалами стандартних ресурсів, які описують специфічні умови і процедури конструювання, маніпуляції та виділення макромолекул (наприклад, молекул ДНК, плазмід, та ін.), отримання фрагментів рекомбінантної ДНК і рекомбінантних експресуючих конструктів і скринінг і виділення клонів, (дивись наприклад, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor: NY; Maliga et al. (1995) Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor: NY; Birren et al. (1998) Genome Analysis: Detecting Genes, 1, Cold Spring Harbor: NY; Birren et al. (1998) Genome Analysis: Analyzing DNA, 2, Cold Spring Harbor:NY; Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer: NY (1997)). В одному аспекті даний винахід включає білкові продукти, отримані з високоолеїнової сої. Даний винахід включає білковий продукт, отриманий з високоолеїнової сої, де вказаний продукт має, щонайменш, одну характеристику, вибрану з групи, що включає поліпшену білизну, зменшену міцність геля і зменшену в'язкість у порівнянні з соєвим білковим продуктом, отриманим з продовольчої сої із застосуванням того ж способу, що й для отримання соєвого білкового продукту з високоолеїнової сої. Інший варіант здійснення стосується білкового продукту, отриманого з високоолеїнової сої, де показник білизни підвищений на, щонайменш, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 % або 50 % у порівнянні з соєвим білковим продуктом, отриманим з продовольчої сої із застосуванням того ж способу, що й для отримання соєвого білкового продукту з високоолеїнової сої. Додатковий варіант здійснення стосується білкового продукту, отриманого з високоолеїнової сої, де міцність гелю зменшена на, щонайменш, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %. 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % або 60 % у порівнянні з соєвим білковим продуктом, отриманим з продовольчої сої із застосуванням того ж способу, що й для отримання соєвого білкового продукту з високоолеїнової сої. Додатковий варіант здійснення стосується негідролізованого білкового продукту, отриманого з високоолеїнової сої, де міцність гелю зменшена у порівнянні з соєвим білковим продуктом, отриманим з продовольчої сої із застосуванням того ж способу, що й для отримання соєвого білкового продукту з високоолеїнової сої. 11 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Додатковий варіант здійснення стосується негідролізованого білкового продукту, отриманого з високоолеїнової сої, де міцність гелю зменшена на, щонайменш, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %,40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 % або 60 % у порівнянні з соєвим білковим продуктом, отриманим з продовольчої сої із застосуванням того ж способу, що й для отримання соєвого білкового продукту з високоолеїнової сої. Ще один варіант здійснення стосується білкового продукту, отриманого з високоолеїнової сої, де в'язкість зменшена на, щонайменш, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %,25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 %, 30 %, 31 %, 32 %, 33 %, 34 %, 35 %, 36 %, 37 %, 38 %, 39 %, 40 %, 41 %,42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 58 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 % або 87 % у порівнянні з соєвим білковим продуктом, отриманим з продовольчої сої із застосуванням того ж способу, що й для отримання соєвого білкового продукту з високоолеїнової сої. Однією перевагою наявності зменшеної в'язкості є те, що вона покращує здатність висихати. В даний час, що стосується продовольчої сої, існує обмеження в концентрації твердих речовин, що подаються, які можуть бути подані до сушки в результаті в'язкості та схильності з'єднуватися і формувати гель в результаті впливу тепла. Якщо продовольча соя повинна бути висушена при високому вмісті твердих речовин, доцільно підвищувати температуру подачі твердих речовин для запобігання з'єднання білка з одержуваним гелеутворенням; це підвищене тепло є дорогим і призводить до значного пошкодження розчинності білка. Зменшена в'язкість і властивості гелю дозволяють оператору значно підвищувати концентрацію твердих речовин, що подаються, тому що завись може бути легко накачана за допомогою обладнання при нормальних температурах без утворення гелю. Це означає, що впродовж процесу сушки треба видалити менше води на кожний фунт, що подається до сушки. Це призводить до зменшеного вживання енергії і більшої кількості твердих речовин, які можуть бути висушені за годину, що приводить до більшої кількості білкового продукту, який можна збути. Інший варіант здійснення даного винаходу стосується соєвого білкового продукту, вибраного з групи, що включає соєвий білковий ізолят, соєвий білковий концентрат, соєве борошно грубого помелу, повножирне борошно, знежирене борошно, соєве молоко, текстуровані білки, текстуроване борошно, текстуровані концентрати та текстуровані ізоляти. Як застосовують тут, "соєве молоко" відноситься до водної суміші будь-якого одного або більше з наступного: дрібно подрібненої сої, соєвого борошна, соєвих пластівців, соєвого концентрату, виділеного соєвого білка, білка соєвої молочної сироватки, і водних екстрактів будь-якого одного або більше з наступного: сої, соєвих пластівців і соєвого борошна, де нерозчинний матеріал видалений. Соєве молоко може включати додаткові складові частини, що включають, але не обмежені цим, жири, карбогідрати, підсолоджувачі, барвники, стабілізатори, загущувачі, ароматизатори, кислоти, основи. Один шлях отримання соєвого молока описаний нижче. Стабілізатори (карбоксиметилцелюлоза і карагінан) змішують сухим змішуванням з деякою кількістю цукру і добавляють до 90 % води. Суміш збовтують з величиною зсуву від помірної до високої впродовж однієї хвилини або доки не спостерігалося грудок. Засоби, що підсилюють екскрецію (цитрат калію, гексаметафосфат натрію та фосфат калію) додавали, перемішуючи, впродовж однієї хвилини. Білок додають і добре диспергують. Завись нагрівають до 170 °F і тримають впродовж 10 хвилин. Залишкові сухі інгредієнти додають до білкової зависі та перемішують протягом 5 хвилин. Соєву олію додають з постійним збовтуванням і перемішують протягом трьох хвилин. Суміш вітамінів і мінералів диспергують в 10 % води, добавлених до білкової зависі та перемішують протягом 5 хвилин. РН зависі доводять при потребі до 7,0-7,2 із застосуванням NaOH. Завись гомогенізують при 500 psi (фунтів на квадратний дюйм) (другий етап) і 2500 psi (фунтів на квадратний дюйм) (перший етап). Завись пастеризують за допомогою обробки дуже високою температурою (UHT) при 141 °C (286 °F) протягом 6 секунд. Суміш охолоджують до 31 °C (88 °F) і упаковують в стерилізовані пляшки. Продукт зберігають при температурі охолодження. Як застосовують тут, "сухе соєве молоко" відноситься до зневодненого соєвого молока. Соєве молоко може бути зневоднене за допомогою багатьох способів, які включають, але не обмежені цим, розпилювальну сушку, лоткову сушку, тунельну сушку і сублімацію. Інший варіант здійснення даного винаходу стосується способу покращення здатності висихати соєвого білкового продукту, що включає подачу, щонайменш, одного соєвого 12 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 білкового продукту, отриманого з насіння високоолеїнової сої, при більш високій подачі твердих речовин до пастеризатора або сушильного апарату в порівнянні з подачею, щонайменш, одного соєвого білкового продукту, отриманого з продовольчої сої, до пастеризатора або сушильного апарату. Додатковий варіант здійснення даного винаходу стосується способу покращення здатності висихати, що включає подачу високоолеїнових соєвих білкових продуктів до пастеризатора або сушильного апарату при не менш ніж 14 %, 15 %, 15 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 %, 23 %, 24 %, 25 %, 26 %, 27 %, 28 %, 29 % або 30 % подачі твердих речовин в порівнянні з подачею продовольчих соєвих білкових продуктів із застосуванням того ж способу, що й для отримання соєвого білкового продукту з високоолеїнової сої. Соєві білкові продукти поділяють на три основні групи. Ці групи основані на вмісті білка, що знаходиться в діапазоні від 40 % до понад 90 %. Всі три основні групи соєвого білкового продукту (окрім повножирного борошна) отримані зі знежирених пластівців. Вони представляють собою наступне: соєве борошно та крупи, соєві білкові концентрати та соєві білкові ізоляти. Вони описані більш повно нижче. Як застосовують тут, вираз "негідролізований білковий продукт", "негідролізований соєвий білковий продукт" відноситься до білкового продукту, який не був підданий етапу ферментного гідролізу білка. Як застосовують тут, вираз "ферментний гідроліз" відноситься до розпаду білків або хімічних сполук шляхом додавання специфічних ферментів. Додаткові варіанти здійснення даного винаходу включають соєві білкові продукти, щонайменш, з 40 %, 41 %, 42 %, 43 %, 44 %, 45 %, 46 %, 47 %, 48 %, 49 %, 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, %, 89 %,90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % або 97 % білка (N x 6,25) на сухій основі. Соєві білкові продукти даного винаходу можуть бути введені до харчових продуктів, напоїв і кормів для тварин. Вираз "корми для тварин" відносяться до харчових продуктів, які дають тваринам, таким як домашня худоба та кімнатні тварини. Деякі корма для тварин забезпечують здорову та поживну дієту, тоді як інші можуть бути бідними на поживні речовини. Тваринам дають широкий діапазон різних кормів, але двома основними типами кормів для тварин є оброблені корми для тварин (комбікорм) і фураж. Комбікорми представляють собою кормові продукти, змішані з різних сировинних матеріалів і додаткових речовин. Основні інгредієнти, що застосовуються в комерційно отриманих кормах для тварин, представляють собою кормові зерна, які включають кукурудзу, сою, сорго, овес і ячмінь. Ці суміші складені згідно зі специфічними вимогами цільових тварин (що включають різні типи домашньої худоби і кімнатних тварин). Їх виготовляють за допомогою складових частин суміші кормів для тварин у вигляді по типу борошна, гранул або крихт. Комбікорми можуть бути повноцінними кормами, який забезпечує добову потребу поживних речовин, концентратами, які забезпечують частину раціону (білок, енергія) або добавками, які лише забезпечують додаткові мікроелементи, такі як мінерали та вітаміни. Окислення й отже термін зберігання кормових інгредієнтів загальна проблема в промисловості. Окислення представляє собою необоротну хімічну реакцію, в якій кисень реагує з кормом і складовими частинами корму і може призводити до погіршення здоров'я тварин і продуктивності. Негативними ефектами окислення може бути втрата смакової привабливості, розщеплення олійної складової частини, розвиток небажаних продуктів розпаду, зміна кольору і втрата енергії. М'ясо, отримане від тварин, що вирощувались на окислених кормах, має значно нижчий окислювальний показник в порівнянні з тваринами, яких годували кормами, що не піддавалися значному окисленню. М'ясо від тварин, яких годували раціонами, що включать високоолеїнові продукти кукурудзи, демонструє подовжений термін зберігання та більшу окислювальну стабільність (міжнародна публікація WO/2006/002052, опублікована 5 січня 2006), особливо в поєднання з антиоксидантами, такими як токоли. Отже, дуже необхідно запобігати окисленню кормів і кормових інгредієнтів для захисту як поживної цінності, так і органолептичної якості. Синтетичні антиоксиданти застосовують для зберігання якості корму запобіганням окисленню ліпідів, що може призвести до поліпшеної продуктивності тварин. 13 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 Взагалі, синтетичні антиоксиданти можуть діяти як вільні акцептори радікалів і тим самим зменшувати окислення ліпідів. Синтетичні антиоксиданти можуть подовжувати термін зберігання кормів і захищати поживну та органолептичну якість. Існує багато способів випробування показника окислення твердих матеріалів, що включають соєве борошно грубого помелу й інші білкові продукти з сої, включаючи способи прискореного старіння, що прогнозують термін зберігання матеріалу. Одне випробування, яке можна застосовувати, представляє собою витримування матеріалу або при кімнатній температурі, або при підвищеній температурі та вимірювання окислювального показника матеріалу в певні точки часу. OSI прибор придатний в цьому відношенні в тому, що він відібражає довжину часу, необхідного для початку процесу окислення, відомого як час індукції. Довший час індукції означає, що матеріал має більшу окислювальну стабільність і отже термін зберігання. Інші способи включають вимірювання летючих компонентів і зміну кольору. Способи отримання соєвих білкових продуктів добре відомі спеціалісту даної галузі техніки. Наприклад білкові продукти з сої можуть бути отримані різними шляхами. Умови, що типово застосовують для отримання соєвих білкових ізолятів, описані (Cho, et al, (1981) патент США № 4278597; Goodnight, et al. (1978) патент США № 4072670). Соєві білкові концентрати виготовляють за допомогою трьох основних способів: кислотне вилуговування (при близько pH 4,5), екстракція спиртом (близько 55-80 %) і денатурація білка вологим теплом до екстракції водою. Умови, що типово застосовують для отримання соєвих білкових концентратів, описані Pass ((1975) патент США № 897574) і Campbell et al. ((1985) in New Protein Foods, ed. by Altschul and Wilcke, Academic Press, Vol., Chapter 10, Seed Storage Proteins, pp 302-338). "Продукти, що включають соєві боби" або "соєві продукти" можуть бути визначені, як ті продукти, що включають/поєднані з соєвим білковим продуктом. Наприклад, "соєві білкові продукти" можуть включати, і не обмежені цим, пункти, приведені в таблиці 2. Таблиця 2 Соєві білкові продукти, отримані з насіння соїa Цільні соєві продукти Смажена соя Печена соя Соєві ростки Соєве молоко Спеціалізовані соєві продукти/інгредієнти Соєве молоко Соєвий сир Темпе Місо Соєвий соус Гідролізований овочевий білок Збитий білок Оброблені соєві білкові продукти Повножирне і знежирене борошно Соєва крупа Соєві гіпокотилі Соєве борошно грубого помелу Соєве молоко Сухе соєве молоко харчові Соєві білкові ізоляти Соєві білкові концентрати Текстуровані соєві білки Текстуроване борошно і концентрати Текстуровані концентрати Текстуровані ізоляти Соєві чіпси aДивись Soy Protein Products: Characteristics, Nutritional Aspects and Utilization (1987). Soy Protein Council. 30 35 "Процесинг" відноситься до будь-яких фізичних і хімічних способів, що застосовують для отримання продуктів, приведених в таблиці 2, і включають, і не обмежені цим, теплове кондиціонування, утворення пластівців і подрібнення, екструзію, екстракцію розчинником або водне замочування і екстракцію цільного або частини насіння. Більш того, "процесинг" включає способи, що застосовують для концентрування та виділення соєвого білка з цільного або частини насіння, як і різні традиційні Oriental способи отримання ферментованих соєвих харчових продуктів. Торгові стандарти та технічні вимоги встановлені для багатьох з цих продуктів (дивись National Oilseed Processors Association Yearbook and Trading Rules 1991-1992). Знежирені пластівці відносяться до пластівцеподібних, полущених сім'ядоль, які знежирили і 14 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 обробили контрольованим теплом для видалення залишкового гексану. Даний вираз також відноситься до борошна або крупи, що подрібнили. "Білі" пластівці відносяться до пластівцеподібних, полущених сім'ядоль, які знежирили і обробили контрольованим теплом для видалення залишкового гексану. Даний вираз також відноситься до борошна, яке подрібнили. "Крупи" відносяться до знежиреної, полущеної сім'ядолі, яка має стандартний ситовий розмір США від № 10 до 80. "Соєві білкові концентрати" відносяться до тих продуктів, які виготовлені з полущеної, знежиреної сої та типово включають від 65 ваг. % до 90 ваг. % соєвого білка на сухій основі. Соєві білкові концентрати типово виготовляють трьома основними способами: кислотним вилуговуванням (при близько pH 4,5), екстракцією спиртом (близько 55-80 %) і денатурацією білка вологим теплом до екстракції водою. Умови, що типово застосовують для отримання соєвих білкових концентратів, описані Pass (1975) патент США № 3897574; Campbell et al., (1985) in New Protein Foods, ed. by Altschul and Wilcke, Academic Press, Vol. 5, Chapter 10, Seed Storage Proteins, pp 302-338). Як застосовують тут, вираз "соєвий білковий ізолят" або "виділений соєвий білок" відноситься до соєвого білка, що включає матеріал, що включає, щонайменш, 90 % соєвого білка за вагою на сухій основі. "Екструзія" відноситься до способів, за допомогою яких матеріал (крупа, борошно або концентрат) проходить крізь забезпечений кожухом шнек із застосуванням високих тисків і температур як засобів зміни текстури матеріалу. "Текстурування" та "структурування" відносяться до способів екструзії, що застосовують для зміни фізичних характеристик матеріалу. Характеристики цих способів, включаючи термопластичну екструзію, попередньо описані (Atkinson (1970) патент США № 3488770, Horan (1985) In New Protein Foods, ed. by Altschul і Wilcke, Academic Press, Vol. 1A, Chapter 8, pp 367-414). Більш того, умови, що застосовують під час екструзійного процесингу комплексу сумішей кормових продуктів, які включають соєві білкові продукти, попередньо описані (Rokey (1983) Feed Manufacturing Technology III, 222-237; McCulloch, патент США № 4454804). Аналіз залишкової жирної кислоти. Комерційний спосіб, що застосовують для знежирення соєвих пластівців гексаном залишає залишки жирних кислот, які можуть діяти як субстрат для отримання сполук стороннього присмаку. В залежності від способу аналізу вміст залишкового жиру знежирених гексаном соєвих пластівців може знаходитися в діапазоні від 0,6 до 1,0 % (W:W) (екстрагований ефіром; AOCS Method 920.39 (Official Methods of Analys of the AOAC International (1995), 16th Edition, Method 920.39C, Locator #4.2.01 (modified)) до 2,5-3 % (W:W) (що гідролізуються кислотою; AOAC Method 922.06 (Official Methods of Analysis of the AOAC International (1995), 16th Edition, Method 922.06, Locator 32.1.13 (modified)). Основною причиною несхожості між цими двома способами оцінки залишкових жирних кислот є хімічна природа класів жирів, пов'язаних з білковою матрицею після екстракції гексаном. Невелика доля залишкової жирної кислоти знаходиться у формі нейтрального ліпіду (тобто, тригліцерид), і залишок присутній як полярний ліпід (наприклад, фосфоліпіди, відомі як лецитин). Через свою полярну природу фосфоліпід недоступний для екстракції ефіром і видаляється з білкової матриці тільки якщо виконується кислотний гідроліз або інший суворий протокол екстракції. Отже, метод екстракції ефіром дає оцінку нейтральної ліпідної фракції, тоді як спосіб кислотного гідролізу дає кращу оцінку загального вмісту залишкової жирної кислоти (тобто, нейтральній і полярній фракціям). Обидва AOAC способи, описані вище, основані на гравіметричних визначеннях залишкових жирних кислот і, хоча в комбінації вони дають показник класів жирів (нейтральні проти полярних), такі оцінки грубі та є об'єктом для впливу від інших гідрофобних матеріалів (наприклад сапонінів). Крім того, не отримано ніякої інформації про жирнокислотну композицію та як на неї можуть впливати різні експериментальні обробки або генетика початкового матеріалу. Доступні AOAC способи визначення жирнокислотної композиції залишкових жирних кислот (Official Methods of Analysis of the AOAC International (2000), 17th Edition, Method 983.23 Locator 45.4.02, Method 969.33 Locator 41.1.28, Method 996.06 Locator 41.1.28A). Вони основані на перетворенні залишкових жирних кислот, екстрагованих кислотним гідролізом, до метилових складних ефірів жирної кислоти для аналізу за допомогою газової хроматографії. Такі техніки виключно застосовують для оцінки вмісту залишкової жирної кислоти матеріалів харчових продуктів в комерційних установах, хоча їх застосовують для визначень жирних кислот для підтвердження мічення кормів. Нещодавно опублікований звіт, в якому ці способи застосовувались для визначення композиції залишкових жирних кислот комерційних соєвих 15 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 білкових ізолятів (Solina et al. (2005) Volatile aroma components of soy protein isolate and acidhydrolysed vegetable protein Food Chemistry 90: 861-873). Легкий спосіб визначення жирнокислотної композиції залишкових жирів в соєвих білкових продуктах описаний в Прикладі 24. Перевагою цього способу над іншими є те, що він не потребує екстракції залишкових жирів з матриці до дериватизації для ГХ аналізу. Крім того, техніка, придатна для всіх форм жирних кислот, тобто, незалежно від того, чи присутні вони спочатку як вільні жирні кислоти або як складні ефіри жирних кислот, наприклад, тригліцериди або фосфоліпіди (Chistie (1989) Gas Chromatography and Lipids; The Oily Press. Ayr, Scotland). Техніка також може видалити жирні кислоти з білкової матриці, навіть якщо полярна кінцева група фосфоліпіду ковалентно зв'язана з білком. Також в обсяг даного винаходу підпадають харчові продукти, харчові добавки, харчові батончики та напої, а також корма для тварин (такі як корма для кімнатних тварин), що мають включений в них білковий продукт з сої даного винаходу. Напої можуть бути в рідкій або в сухій подрібненій формі. Харчові продукти, до яких може бути введений/доданий білковий продукт з сої даного винаходу, включають майже всі харчові продукти, напої та корма (такі як харчові продукти для кімнатних тварин). Наприклад, можна згадати харчові добавки, харчові батончики, м'ясні продукти, такі як замінники м'яса, мелені м'ясні продукти, емульговані м'ясні продукти, мариновані м'ясні продукти та м'ясні продукти з внесеним білковим продуктом з сої даного винаходу. Включеними можуть бути напої, такі як поживні напої, спортивні напої, напої, збагачені білками, соки, молоко, замінники молока та напої для схуднення. Також можна згадати сири, такі як тверді та м'які сири, вершковий сир і домашній сир. Включеними також можуть бути заморожені десерти, такі як морозиво, молочне морозиво, заморожені десерти з низьким вмістом жиру та немолочні заморожені десерти. Нарешті можуть бути включені йогурти, супи, пудинги, хлібобулочні вироби, заправки до салату, пасти та соуси (такі як майонезні соуси і соуси для чипсів). Соєвий білковий продукт може бути доданий в кількості, вибраній для доставки необхідної кількості до харчового продукту і/або напою. Вирази "білковий продукт з сої" та "соєвий білковий продукт" застосовують рівнозначно. Будь-яке насіння високоолеїнової сої, або трансгенне або нетрансгенне, застосовують як джерело соєвого білкового продукту. Описана соя зі зниженими рівнями насичених жирних кислот, яка отримана мутаційної селекцією (Erickson et al. (1994) J. Hered. 79:465-468; Schnebly et al. (1994) Crop Sci. 34:829-833; і Fehr et al. (1991) Crop Sci. 31:88-89) і трансгенної модифікації (патент США № 5530186). Описана соя зі зниженими рівнями вмісту поліненасичених жирних кислот, яка отримана мутаційною селекцією та селекцією. Зменшені рівні ліноленової кислоти були досягнуті при відносно постійному вмісту лінолевої кислоти (патент США № 5710369 і патент США № 5986118). Знижені поєднані лінолева та ліноленова кислоти також були досягнуті із застосуванням мутаційної селекції, генетичних схрещувань і селекції (Rahman, S. M. et al. (2001) Crop Sci. 41:26-29). Ці способи надавали насіння сої з олійними профілями, що мають вмісти ліноленової кислоти від 1 % до 3 % загальних жирних кислот та загальні рівні поліненасичених жирних кислот від близько 30 до 35 % в порівнянні з більш ніж 6 % ліноленової кислоти та більш ніж 50 % загальних поліненасичених жирних кислот в продовольчій сої. Відкриття способу зміни експресії ферментів, що відповідають за введення другого (міжнародна патентна публікація WO 94/11516) і третього (міжнародна патентна публікація WO 93/11245) подвійних зв'язків в запасний ліпід насіння сої спрямованим чином, дозволило виготовляти сою з високим вмістом мононенасиченої, дуже низьким вмістом поліненасиченої жирної кислоти та особливо дуже низьким вмістом ліноленової кислоти. Генетична комбінація цих двох трансгенних профілів, описаних в патенті США № 6426448, призводить до лінії сої з мінімальним вмістом поліненасичених і високим вмістом мононенасичених і жирнокислотним профілем насінь з екстримальною стійкістю до впливу факторів оточуючого середовища. Ген для мікросомальних дельта-12 десатураз жирних кислот, описаний в WO 94/11516, можна застосовувати для вироблення сорту сої з високим вмістом олеїнової кислоти. Отриманий сорт сої з високим вмістом олеїнової кислоти був таким, в якому поліненасичені жирні кислоти зменшені від 70 % загальних жирних кислот до менш ніж 5 %. Дві десатурази жирних кислот сої, позначені FAD2-1 і FAD2-2, представляють собою Δ-12 десатурази, що вводять другий подвійний зв'язок в олеїнову кислоту для формування лінолевої кислоти, поліненасиченої жирної кислоти. FAD2-1 експресується тільки в насінні, що розвивається (Heppard et al. (1996) Plant Physiol. 110:311-319). Експресія цього гена підвищується впродовж періоду відкладення олії, починаючи з приблизно 19 дня після 16 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 розквітання, і цей генний продукт відповідальний за синтез поліненасичених жирних кислот, що знаходяться в соєвій олії. GmFad 2-1 описаний детально Okuley, J. et al. (1994) Plant Cell 6:147-158 та в WO94/11516. Він доступний з ATCC у формі плазміди pSF2-169K (ATCC номер 69092). FAD 2-2 експресується в насінні, листі, корінні та стеблі рослини сої при постійному рівні і представляє собою ген "домашнього господарства" 12-десатурази. Fad 2-2 генний продукт відповідальний за синтез поліненасичених жирних кислот для клітинних мембран. Оскільки FAD2-1 представляє собою основний фермент цього типу в насінні сої, зниження в експресії FAD2-1 призводить до підвищеного накопичення олеїнової кислоти (18:1) та відповідного зменшення вмісту поліненасичених жирних кислот. Зменшення експресії FAD2-2 в комбінації з FAD2-1 призводить до більшого накопичення олеїнової кислоти та відповідного зменшення вмісту поліненасичених жирних кислот. FAD3 представляє собою Δ-15 десатуразу, яка вводить третій подвійний зв'язок в лінолеву кислоту (18:2) для формування ліноленової кислоти (18:3). Зниження експресії FAD3 в комбінації зі зниженням FAD2-1 і FAD2-2 призводить до більшого накопичення олеїнової кислоти та відповідного зменшення вмісту поліненасичених жирних кислот, особливо ліноленової кислоти. Фрагменти нуклеїнової кислоти, що кодують FAD2-1, FAD2-2, і FAD3 описані в WO 94/11516 і WO 93/11245. Можуть бути сконструйовані химерні рекомбінантні конструкти, що включають всі або частину цих фрагментів нуклеїнової кислоти або їхні зворотні комплементи, що функціонально зв'язані, щонайменш, з однією придатною регуляторною послідовністю, де експресія химерного гена призводить до зміненого жирнокислотного фенотипу. Химерний рекомбінантний конструкт може бути введений в рослини сої за допомогою технік трансформації добре відомих спеціалісту даної галузі техніки. Трансгенні рослини сої, отримані трансформацією рекомбінантною ДНК, оцінюють для вибору рослин зі зміненими жирнокислотними профілями. Рекомбінантний конструкт може включати весь або частину 1) FAD2-1 гена або 2) FAD2-2 гена або 3) FAD3 гена або 4) комбінацію всіх або частин FAD2-1, Fad2-2 або FAD3 генів. Рекомбінантні конструкти, що включають весь або частину з 1) FAD2-1 гена з або без 2) усього або частини Fad2-2 гена з або без усього або частини FAD3 гена, можна застосовувати у виготовленні трансгенної рослини сої, що має високоолеїновий фенотип. Змінений жирнокислотний профіль, особливо підвищення долі олеїнової кислоти та зменшення долі вмісту поліненасичених жирних кислот, вказує на те, що супресований один або більше FAD генів насіння сої (FAD2-1, Fad2-2, FAD3). Оцінку можна провести на культурах соматичних ембріонів сої та насінні для визначення супресії FAD2-1, Fad2-2, або FAD3. Спеціалісту даної галузі техніки буде зрозуміло, що можна застосовувати рекомбінантні конструкти, що включають послідовності, відмінні від тих, що зокрема наведені та мають подібні функції. Ці конструкти можуть включати будь-який специфічний для насіння промотор. Ці конструкти можуть або ні також включати будь-які нуклеотиди, що викликають формування петлі стебла. Ці конструкти можуть включати полінуклеотид, що має нуклеотидну послідовність, ідентичну будь-якій частині гена або генів, згаданих вище, вставлених в смисловій або антисмисловій орієнтації відносно промотору. Нарешті, ці конструкти можуть або ні включати будь який сигнал термінації транскрипції. Як тільки отримали достатньо трансгенних насінь, що мають бажаний фенотип, можна приготовити соєві білкові продукти такі як ізоляти білка або цільне соєве молоко. Приклади Даний винахід додатково характеризується наступними Прикладами, в яких частки і процентні відношення виражені за вагою, а градуси виражені в градусах Цельсія, якщо не зазначено інше. Варто розуміти, що дані Приклади, не зважаючи на те, що показують на переважні варіанти здійснення даного винаходу, наведені тільки для ілюстрації. За допомогою вищенаведеного обговорення і даних прикладів, фахівець у даній галузі може встановити основні характеристики даного винаходу і, не відступаючи від сутності й обсягу даного винаходу, може здійснити різні зміни і модифікації даного винаходу, щоб пристосувати його до різних застосувань й умов. Крім того, різні модифікації даного винаходу, на додаток до зображених і описаних у даному описі, будуть очевидні для фахівців даної галузі з вищенаведеного опису. Такі модифікації також передбачаються, що підпадають в обсяг доданої формули винаходу. Отримання ліній високоолеїнової сої описано детально в Прикладах 3,5 і 8, але не обмежене способами, описаними тут. Приклад 1 Трансформація культур зародків сої (Glycine max) і регенерація рослин сої. 17 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Зародкові суспензійні культури сої трансформують за допомогою способу бомбардування частками із застосуванням процедур, відомих в галузі техніки (Klein et al… Nature (London) 327:70-73 (1987); патент США № 4945050; Hazel et al. (1998) Plant Cell. Rep. 17:765-772; Samoylov et al. (1998) In Vitro Cell Dev. Biol.-Plant 34:8-13). В окремих процедурах бомбардування частками можливо застосування очищеної 1) повної плазмідної ДНК або 2) фрагментів ДНК, що включають тільки експресуючу касету(и) рекомбінантної ДНК, що представляє інтерес. Вихідну тканину для експериментів трансформації отримують за допомогою ініціювання з незрілого насіння сої. Вторинні зародки видалили з експлантатів через 6-8 тижнів на середовищі для ініціювання культур. Середовище для ініціювання представляє собою затверджене агаром модифіковане MS (Murashige and Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473-497) середовище, доповнене вітамінами, 2,4-D і глюкозою. Вторинні зародки поміщають в колби в рідке культуральне підтримуюче середовище та підтримують 7-9 днів на ротаційному шейкері при 26 +/- 2 °C при ~80 мкЕм-2сек-1 силі світла. Культуральне підтримуюче середовище представляє собою модифіковане MS середовище, доповнене вітамінами, 2,4-D, сахарозою і аспарагіном. До бомбардування, грудки тканини видаляють з колб і переміщають в порожні 60 × 15 мм чашки Петрі для бомбардування. Тканину сушать за допомогою перенесення промоканням на Whatman #2 фільтруючому папірі. Приблизно 100-200 мг тканини відповідно до 10-20 грудок (1-5 мм в розмірі кожна) застосовують на чашку бомбардованої тканини. Після бомбардування тканину з кожної бомбардованої чашки поділяють і поміщають в дві колби з культуральним підтримуючим середовищем на чашку бомбардованої тканини. Через сім днів після бомбардування, рідке середовище в кожній колбі замінили свіжим культуральним підтримуючим середовищем, доповненим 100 нг/мл селективним засобом (селективне середовище). Для селекції трансформованих клітин сої селективним засобом, що застосовують, може бути сполука сульфонілсечовини (SU) з хімічною назвою 2-хлор-N-((4-метокси-6 мети1,3,5-триазин-2-іл)амінокарбоніл)бензенсульфонамід (загальні назви: DPX-W4189 і хлорсульфурон). Хлорсульфурон представляє собою активний інгредієнт в DuPont сульфонілсечовинному гербіциді, GLEAN®. Селективне середовище, що включає SU, заміняють кожний тиждень впродовж 6-8 тижнів. Після 6-8 тижневого селекційного періоду, островки зеленої трансформованої тканини спостерігали зростаючими з нетрансформованих, некротичних зародкових кластерів. Ці припустимі трансгенні події виділяють і тримають в середовищі з SU при 100 нг/мл впродовж інших 2-6 тижнів зі змінами середовища кожні 1-2 тижні для утворення нових, клонально розмножених, трансформованих зародкових суспензійних культур. Зародки проводять усього приблизно 8-12 тижнів в контакті з SU. Суспензійні культури пересівають і підтримують як кластери незрілих зародків і також вирощують в цілі рослини за допомогою дозрівання і проростання окремих соматичних зародків. Приклад 2 Аналіз жирних кислот сої З метою визначення зміненої жирнокислотної композиції, як результату супресії десатурази жирних кислот, відносні кількості жирних кислот, пальмітинової, стеаринової, олеїнової, лінолевої і ліноленової, можуть бути визначені наступним чином. Метилові складні ефіри жирних кислот отримують з окремих, зрілих, соматичних зародків сої або паростки насіння сої за допомогою переетерифікації. Один зародок, або паросток насіння, поміщають у флакон, що включає 50 мкл триметилсульфоніл гідроксиду та інкубували 30 хвилин при кімнатній температурі зі струшуванням. Після 30 хвилин додають 0,5 мл гексану, зразок перемішують і дозволяють осідати 15-30 хвилин, дозволяючи жирним кислотам розділитися в фазу гексану. Метилові складні ефіри жирних кислот (5 мкл з шару гексану) вводять, відділяють і визначають кількість із застосуванням газового хроматографа Hewlett-Packard 6890, обладнаного капілярною колонкою з плавленим кварцом Омегаwax 320 (Supelco Inc., Cat#24152). Програмують, щоб температура печі підтримувалась при 220ºC 2,7 хвилини, підвищувалась до 240ºC на 20ºC за хвилину, і потім трималась впродовж додаткових 2,3 хвилини. Газ-носій забезпечений Whatman генератором водню. Періоди утримування порівнювали з такими метилових складних ефірів комерційно доступних стандартів (Nu-Chek Prep, Inc. catalog #U-99A). Приклад 3 Отримання сої з високими рівнями олеїнової кислоти та/або високими рівнями стеаринової кислоти та/або низькими рівнями поліненасичених жирних кислот за допомогою супресії десатураз жирних кислот Отримали фрагменти рекомбінантної ДНК і застосували в трансформації сої для одночасної супресії десатураз жирних кислот FAD2-1 і FAD2-2 і десатурази жирних кислот FAD3. Опис 18 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 конструювання фрагментів рекомбінантної ДНК наведений нижче. A. Фрагмент рекомбінантної ДНК PHP21676A Фрагмент рекомбінантної ДНК PHP21676A включає касету сайленсингу експресії гена, спроектовану для сайленсингу експресії FAD2-1 і FAD2-2 генів і FAD3 гена, пов'язану в голова к голові конфігурації з ALS селективним маркером фрагмента рекомбінантної ДНК Прикладу 1D нижче. Нуклеотидна послідовність фрагмента рекомбінантної ДНК PHP21676A показана в SEQ ID NO:1. Фрагмент рекомбінантної ДНК PHP21676A включає в 5" - 3" орієнтації: a)комплементарний ланцюг ALS селективного маркера фрагмента рекомбінантної ДНК Прикладу 1D нижче, b)близько 2088 нуклеотидів Kti3 промотору, c)74-нуклеотидну синтетичну послідовність, d)приблизно 1500 полінуклеотидного фрагмента, що включає близько 470 нуклеотидів з гена FAD2-2 сої, 420 нуклеотидів з гена FAD2-1 сої, і 643 нуклеотидів з гена FAD3 сої, вставлені в унікальний сайт Not I ендонуклеази рестрикції, e)інвертований повтор 74-нуклеотидної синтетичної послідовності в c), і f)близько 202 нуклеотидів Kti3 термінатору транскрипції. Послідовність приблизно 1500 полінуклеотидного фрагмента пункту d) вище показана в SEQ ID NO:2. Приблизно 1500 полінуклеотидний фрагмент, що включає близько 470 нуклеотидів з гена FAD2-2 сої, близько 420 нуклеотидів з гена FAD2-1 сої, близько 643 нуклеотидів з гена FAD3 сої сконструйований за допомогою ПЛР-ампліфікації, як описано нижче. Фрагмент ДНК приблизно 0,9 тисяч пар основ, що включає частину з гена FAD2-2 сої і частину з гена FAD2-1 сої, отримали за допомогою ПЛР-ампліфікації із застосуванням праймерів BM35 (SEQ ID NO:3) і BM39 (SEQ ID NO:4) й із застосуванням як матриці KSFAD2гібриду фрагмента рекомбінантної ДНК, як описано в Прикладі 1B нижче. Фрагмент ДНК приблизно 0,65 тисяч пар основ, що включає частину гена FAD3, отримали за допомогою ПЛР-ампліфікації із застосуванням праймерів BM40 (SEQ ID NO:5) і BM41 (SEQ ID NO:6) і із застосуванням плазміди pXF1 як матриці. Плазміда pXF1 включає полінуклеотид, що кодує дельта-15 десатуразу сої (FAD3) і описаний в патенті США № 5952544, який видано 14 вересня 1999. Плазміду pXF1 депонували в американську колекцію типових культур (ATCC) Rockville, MD, 3 грудня 1991, відповідно до положень Будапештського договору, під номером ATCC 68874. Фрагмент приблизно 0,9 тисяч пар основ, що включає частину з гена FAD2-2 сої і частину з гена FAD2-1 сої, і фрагмент приблизно 0,65 тисяч пар основ, що включає частину FAD3 гена, змішали та застосували як матрицю для ПЛР ампліфікації з BM35 і BM41 як праймерами для отримання фрагмента приблизно 1533 пар основ, який клонували в комерційно доступну плазміду pCR2.1 із застосуванням TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen). Після розщеплення за допомогою NotI фрагмента приблизно 1500 пар основ, що має нуклеотидну послідовність, показану в SEQ ID NO:2, лігують в NotI сайт плазміди pKS210 (Приклад 1C нижче). B. Фрагментний KSFAD2-гібрид рекомбінантної ДНК Фрагментний KSFAD2-гібрид рекомбінантної ДНК включає приблизно фрагмент 890 полінуклеотидів, що включає близько 470 нуклеотидів з гена FAD2-2 сої і 420 нуклеотидів з гена FAD2-1 сої. Нуклеотидна послідовність фрагментний KSFAD2-гібрид рекомбінантної ДНК показана в SEQ ID NO:7 фрагментний KSFAD2-гібрид рекомбінантної ДНК сконструйовано, як описано нижче. Фрагмент ДНК приблизно 0,47 тисяч пар основ, що включає частину з гена FAD2-2 сої, отримали за допомогою ПЛР-ампліфікації із застосуванням праймерів KS1 (SEQ ID NO:8) і KS2 (SEQ ID NO:9) й із застосуванням геномної ДНК, очищеної з листя Glycine max cv. Jack, як матриці. Фрагмент ДНК приблизно 0,42 тисяч пар основ, що включає частину з гена FAD2-1 сої, отримали за допомогою ПЛР-ампліфікації із застосуванням праймерів KS3 (SEQ ID NO:10) і KS4 (SEQ ID NO:11) й із застосуванням геномної ДНК, очищеної з листя Glycine max cv. Jack, як матриці. Фрагмент 0,47 тисяч пар основ, що включає частину з гена FAD2-2 сої, і фрагмент 0,42 тисяч пар основ, що включає частину з гена FAD2-1 сої, очистили гелем із застосуванням GeneClean (Qbiogene, Irvine, CA), змішали і застосували як матрицю для ПЛР ампліфікації з KS1 і KS4 як праймерами для отримання фрагмента приблизно 890 пар основ, який клонували в комерційно доступну плазміду pGEM-T Easy (Prоmega, Madison, WI) для створення плазміди, що включає фрагментний KSFAD2-гібрид рекомбінантної ДНК. C. Отримання плазміди pKS210 і плазміди PHP17731 19 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Плазміду pKS210 отримали з комерційно доступного вектору клонування pSP72 (Prоmega). Кодуючу область бета лактамази, замістили геном гідроміцин фосфотрансферази для застосування як селективного маркеру в E. coli. На додаток, додали касету сайленсингу експресії гена, з'єднану в голова к голові конфігурації до фрагмента рекомбінантної ДНК ALS селективного маркеру Прикладу 1B. Касета сайленсингу експресії гена в плазміді pKS210 включає KTi3 промотор, синтетичну послідовність 74 нуклеотидів, унікальний сайт NotI ендонуклеази рестрикції, інвертований повтор синтетичної послідовності 74 нуклеотидів і Kti3 термінаторну область. Описаний ген, що кодує Kti3 (Jofuku і Goldberg (1989) Plant Cell 1:1079-1093). 74-нуклеотидні синтетичні послідовності c) і e) (вище) промотують формування стовбурової структури. Показано, що вставка нуклеотидного фрагмента з необхідного гена в унікальний Not I сайт призвела до супресії необхідного гена, як описано в міжнародній публікації WO 02/00904, опублікованій 3 січня 2002. Нуклеотидна послідовність цієї касети сайленсингу експресії насіння-специфічного гена з pKS133 показана в SEQ ID NO:12. Карта плазміди pKS210 показана на фігурі 1, та її нуклеотидна послідовність описана в SEQ ID NO:13. Отримали рекомбінантну плазміду PHP17731, яка включає генетичні послідовності для одночасного сайленсингу одного з генів дельта-9-десатурази сої і гена FAD2-1 дельта-12 десатурази сої. KTI промотор сої, термінаторні області разом із послідовністю синтетичного інвертованого повтору взяли з плазміди KS133 (WO 2002016565A2, A3). Фрагмент гена FAD2-1 ампліфікували за допомогою ПЛР із застосуванням геномної ДНК сої та послідовності в SEQ ID NO 5 патенту США № 6372965 B1 як матриці для отримання фрагмента пар основ 5423-6033 SEQ ID NO:14 (PHP17731). Поруч з тим фрагментом помістили частину кодуючої послідовності копії 3 дельта-9-десатурази сої (послідовність 1 WO 2002016565A2, A3), яка тепер включає основи 6054-411 PHP17731. Фрагмент PHP17731A (SEQ ID NO:15) видалили з вектору клонування PHP17731 за допомогою розщеплення ендонуклеазою рестрикції AscI і очистили, як описано в розділі E нижче. Карта плазміди PHP17731 показана на фігурі 2. D. ALS селективний маркер фрагмента рекомбінантної ДНК Фрагмент рекомбінантної ДНК, що включає конститутивний промотор, керуючий експресію гена ацетолактат синтази (ALS) мутантної сої, з подальшим термінатором транскрипції ALS 3" сої, застосували як селективний маркер для трансформації сої. Конститутивний промотор, що застосовують, представляє собою 1,3-тисяч пар основ фрагмент ДНК, який функціонує як промотор для гена S-аденозилметіонін синтазу (SAMS) сої та описаний в міжнародній публікації № WO 00/37662, опублікованій 29 червня 2000. Нуклеотидна послідовність цього фрагмента рекомбінантної ДНК, що застосовують як селективний маркер, показана в SEQ ID NO:16. Ген ALS мутантної сої кодує фермент, стійкий до інгібіторів ALS, таких як сульфонілсечовинні гербіциди. Виведена амінокислотна послідовність ALS мутантної сої, присутня в фрагменті рекомбінантної ДНК, що застосовують як селективний маркер, показана в SEQ ID NO:17. Гени ALS мутантної рослини, що кодують ферменти, стійкі до сульфонілсечовинних гербіцидів, описані в патенті США № 5013659. Один такий мутант представляє собою ген SURB-Hra тютюну, який кодує гербіцидно-стійку ALS з двома замінами в амінокислотній послідовності білка. Ця гербіцидно-стійка ALS тютюну включає аланін замість проліну в позиції 191 в консервативній "підпослідовності B" (SEQ IDNO:18) і лейцин замість триптофану в позиції 568 в консервативній "підпослідовності F" (SEQ ID NO:19) (патент США № 5013659; Lee et al. (1988) EMBO J 7:1241-1248). ALS селективний маркер фрагмента рекомбінантної ДНК сконструйований із застосуванням полінуклеотиду для ALS сої, в яку ввели дві Hra-подібні мутації за допомогою сайт спрямованого мутагенезу. Таким чином, цей фрагмент рекомбінантної ДНК буде транслюватися до ALS сої, що має аланін замість проліну в позиції 183 і лейцин замість триптофану в позиції 560. Додатково, впродовж конструювання SAMS промотор-мутант ALS експресуючої касети, кодуючу область з гена ALS сої подовжили на 5’-кінці за допомогою п'яти додаткових кодонів, призводячи до п'яти амінокислот (M-P-H-N-T; SEQ ID NO:20), доданих до аміно-кінця ALS білка. Ці екстра амінокислоти розташовуються поряд з і, можливо, видаляються транзитним пептидом впродовж націлювання білка ALS мутантної сої до пластиди. Фрагмент ДНК, що включає полінуклеотид, що кодує ALS сої, розщепили KpnI, затупили кінець T4 ДНК полімеразою, розщепили SalI, і вставили в плазміду, яка включає SAMS промотор, який попередньо розщепили NcoI і затупили кінець за допомогою заповнення ДНК полімеразою Кльонова. Другий селективний маркер плазміди та наступний фрагмент отримали за допомогою заміщення альтернативного промотору рослини, що конституційно експресується, на SAMS промотор, описаний вище. Синтетичний промотор SCP1 (патент США № 6072050) помістили перед ALS кодуючою послідовністю мутантної сої для формування плазміди PHP17064 (SEQ ID 20 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 NO 21 і Фігура 3). Для застосування в трансформації сої фрагмент PHP17064A (SEQ ID NO:22) вирізали з його вектору клонування із застосуванням ендонуклеази рестрикції XbaI і очистили, як описано в розділі E нижче. E. Отримання фрагментів рекомбінантної ДНК, PHP21676A, PHP17731A і PHP17064A для трансформації сої. Для застосування в експериментах трансформації рослин, PHP21676A фрагмент рекомбінантної ДНК 7993 пар основ видалили з його клонуючої плазміди із застосуванням ендонуклеазию рестрикції AscI. Кожний з фрагментів рекомбінантної ДНК PHP21676A, PHP17731A і PHP17064A відділили від плазмідної ДНК, що залишається, за допомогою електрофорезу в агарозному гелі. Осадження фрагмента рекомбінантної ДНК на золоті частинки та трансформацію сої виконали, як описано в Прикладі 1. На кожні вісім трансформацій бомбардуванням, отримали 30 мкл розчину з 3 мг 0,6 мкм золотих частинок і 190 пікограм (пг) фрагмента ДНК на пару основ фрагмента ДНК. Альтернативно, суміші фрагментів PHP17064A і PHP17731A або еквівалентних частин або двох частин PHP17731A-PHP17064A додали до золотих частинок при тій же вазі на пару основ, як описано вище, і застосували в трансформації того, щоб заставити мовчати гени дельта-9 і дельта-12 десатурази. Приклад 4 Аналіз жирнокислотного складу сої, трансформованої фрагментами рекомбінантної ДНК PHP21676A з поєднаними PHP17064A і PHP17731A. В експерименті трансформації сої із застосуванням фрагмента рекомбінантної ДНК PHP21676A, як описано вище, отримали 67 незалежно трансформованих зародкових суспензійних культур, які, як виявлено, стійкі до сульфонілсечовинного гербіциду. Підвищення вмісту олеїнової кислоти як долі п'яти основних жирних кислот, пальмітинової, стеаринової, олеїнової, лінолевої та ліноленової, вказує на супресію FAD2 генів. Тринадцять з 67 зародкових суспензійних культур, стійких до гербіциду (19 %), продукували соматичні зародки з більш ніж 25 % олеїнової кислоти, в порівнянні з близько 8 % олеїнової кислоти для нетрансформованих зародків. Рослин регенерували і отримали T1 насіння з 9 з 13 подій. Насіння випробовували на супресію десатураз жирної кислоти за допомогою вимірювання жирнокислотної композиції насіння олії, як описано в прикладі 2. Рослини, отримані з 5 трансформаційних подій, продукували насіння, що проявляє фенотип з високим вмістом олеїнової та низьким вмістом поліненасиченої жирної кислоти. В експерименті трансформації сої, із застосуванням суміші фрагментів рекомбінантної ДНК PHP17064A і PHP17731A, отримали трансформовані зародкові суспензійні культури, що, як виявили, є стійкими до сульфонілсечовинного гербіцида, провели скринінг на кількість копій трансгенних фрагментів, виявлених за допомогою саузерн аналізу, і потім за допомогою жирнокислотного профілю соматичного зародку. Зростання рівня стеаринової та олеїнової кислоти взяли як показник сайленсингу дельта-9 десатурази і дельта-12 десатурази, що експресуються насінням. Тридцять три кандидати трансформованих ліній регенерували до зрілих рослин сої та насіння з початкових трансформантів аналізували на жирнокислотний профіль. З цихліній зробили наступні вибори з насіння, отриманого з самозапильних рослин в двох додаткових поколіннях. Вибрали одну лінію кандидат, в якій сума лінолевої та ліноленової кислоти складала менш ніж 14 % загальної жирної кислоти, та в якій вміст стеаринової кислоти був більш ніж 16 % загальної жирної кислоти. Приклад 5 Генетичний матеріал, що застосовують для отримання високоолеїнової ознаки (версія 1) Високоолеїнову сою отримали за допомогою рекомбінантної операції з активністю олеоїл 12-десатурази. GmFad 2-1 помістили під контроль сильного, насіння-специфічного промотору, отриманого з α'-субодиниці гена β-конгліциніну сої (Glycine max). Цей промотор дозволяє високий рівень, специфічну для насіння експресію характерного гена. Він охоплює 606 пар основ вище стартового кодону α' субодиниці запасного білка β-конгліцину Glycine max. Послідовність промотору β-конгліциніну представляє алель опублікованого β-конгліциніну (Doyle et al., (1986) J. Biol. Chem. 261:9228-9238), що має різницю в 27 нуклеотидних положеннях. Показано підтримання патернів специфічної для насіння експресії в трансгенних рослинах (Barker et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:458-462 і Beachy et al., (1985) EMBO J. 4:3047-3053). Рамку зчитування закінчували 3' фрагментом гена фазеоліну зеленої квасолі (Phaseolus vulgaris). Це представляє собою 1174 пар основ ділянки послідовностей 3' Рhaseolus vulgaris стоп кодону гена фазеоліну (отриманого від клону, описаного в Doyle et al., 1986). 21 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 GmFad 2-1 відкрита рамка зчитування (ORF) знаходилась в смисловій орієнтації відносно промотору так, щоб отримати сайленсинг гена смислової GmFad 2-1 кДНК і ендогенного GmFad 2-1 гена. Цей феномен, відомий як "смислова супресія", представляє собою ефективний спосіб цілеспрямованого вимикання генів в рослинах і описано в патенті США № 5034323. Для підтримання та реплікації плазміди в E. coli GmFad 2-1 транскрипційну одиницю, описану вище, клонували в плазміду pGEM-9z(-) (Prоmega Biotech, Madison WI, USA). Для ідентифікації трансформованої рослини сої застосували ген β-глюкоронідази (GUS) з E. coli. Касета, яку застосовують, складається з трьох блоків; промотор вірусу мозаїки цвітної капусти 35S, ген β-глюкоронідази (GUS) з E. coli і 0,77 тисяч пар основ фрагмента ДНК, який включає термінатор гена з гена нопалін синтази (NOS) Ti-плазміди Agrobacterium tumefaciens. Промотор 35S представляє собою 1,4 тисяч пар основ промоторну область з CaMV для експресії конститутивного гена в більшості тканин рослини (Odell et al. (1985) Nature 303:810-812), GUS ген 1,85 тисяч пар основ фрагмент, що кодує фермент β-глюкоронідазу (Jefferson et al. (1986) PNAS USA 83:8447-8451) і NOS термінатор, частину 3' кінця кодуючої області нопалін синтази (Fraley et al., (1983) PNAS US 80:4803-4807). GUS касету клонували в GmFad 2-1/pGEM-9z(-) конструкт і назвали pBS43. Плазміду pBS43 трансформували в меристемах елітної лінії сої A2396, за допомогою способу бомбардування частинками, як описано в Прикладі 1. Фертильні рослини регенерували із застосуванням способів, добре відомих в техніці. З початкової популяції трансформованих рослин обрали рослину, яка мала GUS активність і яка була позитивна на GmFad 2-1 ген (Подія 260-05) при оцінці за допомогою ПЛР. Невеликі частинки взяли з деякої кількості R1 насіння рослини 260-05 і провели скринінг жирнокислотної композиції. Насіння, що проклюнулись, потім висадили та пророщували. Геномну ДНК екстрагували з листя отриманих рослин і вирізали рестрикційним ферментом Bam HI. Блоти вивчали зондуванням фазеоліновим зондом. З патерна ДНК гібридизації ясно, що в вихідній трансформаційній події GmFad 2-1 конструкт повинен інтегруватися в два відмінні локуси в геномі сої. В одному локусі (Локус A) GmFad 2-1 конструкт викликає сайленсинг ендогенного гена GmFad 2-1, призводячи до вмістів олеїнової кислоти як показано в таблиці 3. Для порівняння елітні сорти сої мають вміст олеїнової кислоти близько 20 %. В локусі A існує дві копії pBS43. На блоті ДНК гібридизації це було видно як смужки, що косегрегують. В іншому локусі інтеграції (локус B) GmFad 2-1 надекспресувався, таким чином зменшуючи вміст олеїнової кислоти до близько 4 %. Сегрегаційним лініям четвертого покоління (R4 рослини), утвореним з вихідних трансформантів, дозволили зростати до дозрівання. R4 насіння, яке включало тільки локус сайленсингу A (наприклад, G94-1), не включає будь-яку GmFad 2-1 мРНК, що виявляється, (при визначенні за допомогою нозерн блотингу) в зразках, отриманих на 20 день після розквітання. GmFad 2-2 мРНК, не дивлячись на дещо зменшене значення в порівнянні з контролями, не супресувалась. Таким чином GmFad 2-1 смисловий конструкт мав необхідний ефект запобігання експресії GmFad 2-1 гена і, таким чином, підвищення вмісту олеїнової кислоти в насінні. Всі рослини гомозиготні за GmFad 2-1 локусом, що мовчить, мали ідентичний профіль саузерн блоту протягом кілька поколінь. Це вказує на те, що вставка була стабільна в тому ж положенні в геномі через, щонайменш, чотири покоління. Приклад 6 Жирнокислотний аналіз високоолеїнової ознаки (версія 1). Короткий опис вмісту олеїнової кислоти, що знаходиться в різних поколіннях рекомбінантних рослин і насіння сої, представлена в таблиці 7. Жирнокислотну композицію визначили, як описано в прикладі 2. Таблиця 3 Ідентифікаційний номер рослини G253 G276 G296 G313 G328 G168-187 G168-171 G168-59-4 Висаджене поколінняa Аналізоване насінняa Об'єм олеїнової кислоти (%) R0:1 R0:1 R0:1 R0:1 R0:1 R1:2 R1:2 R2:3 R1:2 R1:2 R1:2 R1:2 R1:2 R2:3 R2:3 R3:4 22 84,1 % 84,2 % 84,1 % 83,8 % 84,0 % 84,4 % 85,2 % 84,0 % UA 102533 C2 Продовження таблиці 3 G168-72-1 G168-72-2 G168-72-3 G168-72-4 R2:3 R2:3 R2:3 R2:3 R3:4 R3:4 R3:4 R3:4 84,1 % 84,5 % 84,3 % 83,3 % aR0:1 вказує на насіння та рослину, що вирощувались з насіння після самозапилення трансформанту першого покоління. R1:2 вказує на насіння і рослину, що вирощувались з насіння після самозапилення трансформанту другого покоління. R2:3 вказує на насіння і рослину, що вирощувались з насіння після самозапилення трансформанту третього покоління. R3:4 на вказує насіння і рослину, що вирощувались з насіння після самозапилення трансформанту четвертого покоління. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Приклад 7 Генетичний матеріал, що застосовують для отримання високоолеїнової ознаки (версія 2) Подію сої (Glycine max) отримали за допомогою сумісного бомбардування частками, як описано в Прикладі 1, фрагментами PHP19340A (Фігура 4; SEQ ID NO:23) і PHP17752A (Фігура 5; SEQ ID NO:24). Ці фрагменти отримали за допомогою Asc I розщеплення з вихідної плазміди. Фрагмент PHP19340A отримали з плазміди PHP19340 (Фігура 6; SEQ ID NO:25) і фрагмент PHP17752A отримали з плазміди PHP17752 (Фігура 7; SEQ ID NO:26). РНP19340 фрагмент включає касету з фрагментом 597 пар основ з мікросомального гена омега-6 десатурази сої 1 (gm-fad2-1) (Heppard et al., 1996, Plant Physiol. 110: 311-319). Присутність gm-fad2-1 фрагмента в експресуючій касеті діє для супресії експресії ендогенних омега-6 десатураз, призводячи до підвищеного рівня олеїнової кислоти та зменшених рівнів пальмітинової, лінолевої та ліноленової кислоти. Вище gm-fad2-1 фрагмента знаходиться промоторна область з гена Kunitz інгібітору трипсину 3 (KTi3) (Jofuku і Goldberg, 1989, Plant Cell 1: 1079-1093; Jofuku et al., 1989, Plant Cell 1: 427-435), що регулює експресію транскрипту. КТі3 промотор є високоактивним в соєвих ембріонах так в 1000 разів менш активним в тканині листя (Jofuku and Goldberg, 1989, Plant Cell 1: 1079-1093). 3" область, що не транслюється, КТі3 гена (КТі3 термінатор) (Jofuku and Goldberg, 1989, Plant Cell 1: 1079-1093) закінчує експресію з цієї касети. РНP17752 фрагмент включає касету з модифікованою версією гена ацетолактатсинтази сої (gm-hra), що кодує GM-HRA білок з двома залишками амінокислоти, модифікованими від ендогенного ферменту і п'ять додаткових амінокислот в N-термінальній області білка, отриманого з трансляції 5" області, що не транслюється, гена ацетолактатсинтази сої (Falco і Li, 2003, заявка на патент США: 2003/0226166). gm-hra ген кодує форму ацетолактатсинтази, яка є толерантною до класу сульфонілсечовинних гербіцидів. GM-HRA білок включає 656 амінокислот і має молекулярну вагу приблизно 71 кДа. Експресію gm-hra гена регулюють за допомогою 5" промоторної області S-аденозил-Lметіонин синтази (SAMS) гена сої (Falco і Li, 2003, заявка на патент США: 2003/0226166). Ця 5" область включає конститутивний промотор і інтрон, який перериває SAMS 5" нетрансльовану область (Falco і Li, 2003). Термінатором для gm-hra гена є ендогенний термінатор ацетолактатсинтази сої (als термінатор) (Falco і Li, 2003, заявка на патент США: 2003/0226166). Приклад 8 Трансформація і селекція для високоолеїнової події сої (версія 2) Для трансформації тканини сої, лінійну частину ДНК, яка включає послідовність gm-fad2-1 гена і регуляторні складові частини, необхідні для експресії, вирізали з плазміди PHP19340 із застосуванням рестрикційного ферменту Asc I і очистили із застосуванням електрофорезу в агарозному гелі. Лінійну частину ДНК, яка включає послідовність gm-hra гена і регуляторні складові частини, необхідні для експресії, вирізали з плазміди PHP17752 із застосуванням рестрикційного ферменту Asc I і очистили із застосуванням електрофорезу в агарозному гелі. Лінійну частину ДНК, яка включає gm-fad2-1 ген, назвали вставка PHP19340A розміром 2924 bp. Лінійну частину ДНК, яка включає gm-hra ген, назвали вставка PHP17752A розміром 4511 bp. Єдиною ДНК, введеною в подію трансформації DP-305423-1, була ДНК вставок, описаних вище. Трансгенні рослини з події DP-305423-1 отримали за допомогою мікропроекційного бомбардування як описано в Прикладі 1. Зразки зародкової тканини взяли для молекулярного аналізу для підтвердження присутності gm-fad2-1 і gm-hra трансгенів за допомогою саузерн 23 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аналізу. Рослини регенерували з тканини, отриманої з кожної унікальної події та перенесли в теплицю для отримання насіння. Приклад 9 Саузерн аналіз рослин, що включає високоолеїнову подію версії 2 Матеріали і способи: Геномну ДНК екстрагували з тканини замороженого листя сої окремої рослини T4 і T5 поколінь DP-305423-1 і контролю (сорт: Jack) із застосуванням стандартного способу екстракції буфером сечовини. Визначили кількість геномної ДНК на спектрофлуорометрі із застосуванням Pico Green® реагенту (Molecular Probes, Invitrogen). Приблизно 4 мкг ДНК на зразок розщепили Hind III або Nco I. До зразків позитивного контролю, приблизно 3 пг (2 еквіваленти геномних копій) плазміди PHP19340 або PHP17752 додали для регулювання геномної ДНК сої до розщеплення. Зразки негативного контролю складаються з немодифікованої геномної ДНК сої (сорт: Jack). Фрагменти ДНК відділили за розміром із застосуванням електрофорезу в агарозному гелі. Після електрофорезу в агарозному гелі, відділені фрагменти ДНК апуринували, денатурували, нейтралізували in situ і перенесли до нейлонної мембрани в 20x SSC буфер із застосуванням способу, описаного для TURBOBLOTTER™ Rapid Downward Transfer System (Schleicher & Schuell). Після переносу на мембрану, ДНК зв'язали з мембраною за допомогою УФ зшивання. ДНК зонди для gm-fad2-1 і gm-hra маркували дигоксигеніном (DIG) за допомогою ПЛР із застосуванням ПЛР DIG Probe Synthesis Kit (Roche). Марковані зонди гібридизували до цільової ДНК на нейлонних мембранах для визначення специфічних фрагментів із застосуванням DIG Easy Hyb solution (Roche) в основному, як описано виробником. Постгібридизаційні промивання виконали з високою строгістю. DIG-марковані зонди, гібридизовані до зв'язаних фрагментів, визначали із застосуванням CDPStar Chemiluminescent Nucleic Acid Detection System (Roche). Блоти піддавали дії рентгенограми при кімнатній температурі впродовж одного або більше моментів часу для визначення гібридизованих фрагментів. Жирнокислотну композицію події визначили як описано в Прикладі 2. Рівні олеїнової кислоти, визначені в 29 відмінних подіях (T1 отримання), знаходились в діапазоні 61,5-84,6 %. Рівень олеїнової кислоти з однієї події (T4-T5 отримання) знаходився в діапазоні 72-82 %. Приклад 10 Дрібномасштабне отримання соєвого білкового ізоляту Отримання соєвого білкового ізоляту виконується як описано нижче. a) Виготовлення жовтих пластівців: Повножирні пластівці отримують наступним способом. Об'єм сої помістили в закритий контейнер, з невеликою кількістю води для запобігання сушіння бобів впродовж наступного мікрохвильового нагрівання. Сою нагрівають мікрохвилями доки температура досягне 150 °F і потім тримають впродовж 1 хвилини. Боби швидко охолоджують до кімнатної температури в холодильнику псевдозрідженого шару впродовж близько 1 хвилини. Сою потім пропускають крізь дробарку для виготовлення ½ і ¼ подрібнених часток. Лушпиння видаляють в аспіраторі і отриману "м'якоть" обробляють далі для виготовлення пластівців. М'якоть поміщають в герметизований контейнер з невеликою кількістю води та нагрівають мікрохвилями доки температура досягне 150° F і потім тримають впродовж 1 хвилини. Гарячу м'якоть потім пропускають крізь плющильний верстат для пластівців для виготовлення соєвих пластівців, які потім швидко охолоджують до кімнатної температури в холодильнику киплячого шару впродовж близько 1 хвилини. Пластівці з високим показником диспергованості білка (PDI) виготовили з достатньо характерною для зняття олії екстракцією розчинником. Пластівці з низьким PDI виготовили за допомогою підвищення кількості води, температури і тривалості впливу впродовж виготовлення. b) Виготовлення білих пластівців: Білі пластівці можуть бути отримані за допомогою контакту жовтого пластівця з гексаном для видалення олії. На додаток до гексану, пластівці екстрагують лише, або в комбінації з, іншою системою розчинників, яка має деякий ступінь розчинності в олії, такою як етанол, водні суміші етанолу, суміші гексану і етанолу, надкритичні CO2 водні суміші етанолу, та ін… Жовті пластівці загружають в однократний або напівперервний екстрактор при відношенні розчинник:пластівці, температурі, і часом екстракції, достатнім для видалення олії. В однократному екстракторі, гексан, нагрітий до 60 °C, додають при 3:1 відношенні розчинник:пластівці і циркулюють крізь шар пластівців впродовж 45 хвилин. Розчинний міцелій, який застосовують, видаляють і процедуру екстракції розчинником, описану вище, повторюють. Пластівці подають на кінцеве полоскання свіжим розчинником. Напівперервний екстрактор 24 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 застосовує приблизно те саме відношення розчинника до пластівців, але свіжий розчинник безперервно регенерують впродовж застосування фільтру тверда речовина/рідина в ємності з подальшим випаровуванням розчинника з олії і рециркулюють конденсат назад в екстрактор. Цей напівперервний екстрактор застосовують для утворення будь-якої кількості оборотів розчинника. В іншому апараті, отриманим білим пластівцям з великою кількістю гексану дозволяють сушитися повітрям в витяжному пристрої впродовж ночі. Якщо бажано, комерційну обробку парою впродовж видалення розчинника проводять за допомогою додавання води до пластівців (типово 5-10 % сухої основи пластівців), і поміщення змочених пластівців в герметизований контейнер і нагрівання впродовж 6 хвилин при 100 °C мікрохвилями. Гарячі пластівці потім помістили в вакуумну піч і швидко охолодили до близько 50 °C для виготовлення високого PDI пластівців. Підвищення кількості води, часу або температури впродовж цього етапу давало низький PDI пластівців. Пластівці подрібнили до борошна з розміром частинок, придатним для ефективної екстракції білка, або цей етап можна повністю пропустити. c) Виготовлення вологого сиру: Кількість соєвого борошна екстрагують водою (підігрітою, типово до 33 °C) при відношенні води до борошна, щонайменше, достатньому для вироблення рухливої зависі (типово 6:1) в ємності, здатній забезпечувати добрий контакт води з пластівцями і/або додаткову здатність подрібнення муки (типово колоїдний млин). Якщо бажано, рН екстракції підвищують основою (типово Ca(OH)2 до pH близько 9,7) або зменшують кислотою до рН близько 2,0. Протиспінюючі засоби в кількості, достатній для запобігання спінюванню (типово менш ніж 1 % на основу пластівців) і сульфіт (Na2SO3, типово менш ніж 1 % на основу пластівців) додають в цій точці для сприяння екстракції. Екстракт перемішують (типово в колоїдному млині) впродовж приблизно 10-15 хвилин. Завись подають в центрифугу (або однократної дії або напівперервну) при обертах за хвилину і часі, достатнім для відділення твердих речовин (типово вище Log 4,0 Гсек при 33 °C). Рідину декантують і тверді речовини повторно екстрагують при відношення води до твердих речовин, щонайменш, достатньому для вироблення рухливої зависі (типово 4 до 1). Завись (типово 33 °C) перемішують (типово в колоїдному млині) і відділяють на центрифузі як описано вище. Якщо бажано, рН другого екстракту також підвищують або зменшують в цій точці. Після центрифугування, рідину декантують і пластівці, що залишились, видаляють. Перший і другий рідинні екстракти поєднують і обробляють далі. Якщо бажано, можна провести додаткові екстракції. Щоб осадити білок, рН довели до рН, достатнього для відділення потрібних білків (типово до 4,5) кислотою (типово 1M HCl) і подали до напівперервної або однократної центрифуги при умовах, описаних вище. Рідину декантують і видаляють, і тверді речовини повторно суспендують свіжою водою (типово в гомогенізаторі). Воду повторної суспензії підігрівають, якщо бажано, (типово промивною водою температурою близько 50-60 o C). Промивання, описане вище, можна повторити якщо бажано. d) Отримання виділеного соєвого білка: Вологий сир повторно суспендують до вмісту твердих речовин, придатних для пастеризації білкової суспензії. Типово, вміст твердих речовин складає приблизно 10-20 %. Завись перемішують (типово в колоїдному млині або гомогенізаторі) і рН доводять основою (типово NaOH) до приблизно 6,8-7,2. Завись пастеризували безперервно нагнітанням пари при температурі і часі, достатньому для зменшення мікробної кількості і активності інгібітору трипсину для збереження рівнів для прийому їжі людиною. Типово умови наступні, приблизно 120-160 °C впродовж 4-60 секунд. Пастеризовану завись охолоджують (типово миттєво охолодили до 50-60 °C із застосуванням 100-150 мм вакууму). Завись подають в розпилюючу сушку при умовах, необхідних для отримання сухого продукту з менш ніж близько 5 % вологи. Типово умови включають вхідну температуру близько 250-300 °C і вихідну температуру близько 90-100 °C. Умови, викладеним в цих прикладах включають технологічні параметри, які застосовують для виготовлення Supro® 760, Supro® 670 і Supro® 500E – типу ізолятів білка в експлуатаційній платформі малого масштабу. Приклад 11 Великомасштабне отримання знежирених пластівців Матеріал пластівців сої може бути сформований з сої згідно до наступного способу. Сою очистили проходженням сої крізь магнітний сепаратор для видалення заліза, сталі і інших магнетично доступних об'єктів, з подальшим струшуванням сої на ситах, меш яких прогресивно зменшується, для видалення твердих залишків, лушпиння, стеблин, насіння бур'яну, мілких бобів, і іншого сміття. Очищену сою потім подрібнюють проходженням сої крізь дробильну вальцеву систему. Дробильна вальцева система представляє собою рифлені циліндри спірального розтину, які відсіюють лушпиння в той час як соя проходить крізь вальці і 25 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 подрібнюють соєвий матеріал на різні шматки. Переважно подрібнену сою пристосовують до 10 % - 11 % вологи при 63-74C для покращення часу зберігання соєвого матеріалу. Подрібнену сою потім лущать, переважно за допомогою аспірації. Соєві гіпокотилі, які набагато менші ніж сім'ядолі сої, можуть бути видалені за допомогою струшування полущеної сої на ситі достатньо малого розміру меш для того, щоб видалити гіпокотилі і залишити сім'ядолі бобів. Гіпокотилі треба видалити, так як вони включають тільки близько 2 % за вагою сої, тоді як сім'ядолі включають близько 90 % сої за вагою, тем не менш, переважним є видалення гіпокотилів, оскільки вони пов'язані з бобовим присмаком сої. Полущену сою, з або без гіпокотилями, потім плющать на вальцях проходженням сої крізь плющильні вальці. Плющильні вальці представляють собою гладкі циліндричні вальці, встановлені для формування пластівців сої, коли вони проходять крізь вальці, що мають товщину від близько 0,01 дюйма до близько 0,015 дюйма. Пластівці потім знежирюють. Пластівці знежирюють за допомогою екстрагування пластівців придатним розчинником для видалення олії з пластівців. Переважно пластівці екстрагують nгексаном або n-гептаном протитоковою екстракцією. Знежирені пластівці повинні включати менш ніж 1,5 % жиру або вмісту олії, і переважно менш ніж 0,75 %. З екстрагованих розчинником пластівців потім видаляють розчинник для видалення будь-якого залишкового розчинника із застосуванням звичайних способів видалення розчинника, що включають видалення розчинника за допомогою пристрою для миттєвого видалення розчинника і дезодорації, паровакуумного пристрою для видалення розчинника і дезодорації, або видалення розчинника за допомогою низхідного процесу видалення розчинника. Переважно, знежирені пластівці перетирають в соєве борошно або соєву крупу для покращення виходу білкової екстракції з пластівців. Пластівці перетирають подрібненням пластівців до бажаного розміру частинки із застосуванням звичайного обладнання помелу і подрібнення, такого як молотковий млин або повітряноструминний млин. Соєве борошно має розмір частинки, де, щонайменш, 97 %, за вагою, муки має розмір частинки 150 мікронів або менше (здатних проходити крізь № 100 меш U.S. Standard Screen). Соєва крупа, більш крупнішого помелу ніж соєве борошно, має розмір частинки, більший ніж соєве борошно, але менший ніж соєві частинки у формі пластівця. Переважно соєва крупа має розмір частинки від 150 мікронів до близько 1000 мікронів (здатна проходити крізь № 10 – № 80 U.S. Standard Screen). Приклад 12 Великомасштабне отримання соєвого білкового ізоляту Для виготовлення білкового сирного матеріалу сої, HO знежирене соєве борошно екстрагують водою або водним розчином, що має рН від 6,5 до 10 для екстрагування білка в борошні з нерозчинних матеріалів, таких як волокно. Соєве борошно переважно екстрагують водним розчином гідроксиду натрію, що має рН від близько 8 до близько 10, хоча інші водні лужні екстрактанти, такі як гідроксид амонію, також ефективні. Переважно, вагове відношення екстрактанту до матеріалу соєвого борошна складає від близько 8:1 до близько 16:1. Після екстракції, екстракт відділяють від нерозчинних матеріалів. Переважно відділення виконують за допомогою фільтрації або за допомогою центрифугування і відділення екстракту з нерозчинних матеріалів. рН відділеного екстракту потім доводять до близько ізоелектричної точки соєвого білка, щоб осадити білковий соєвий сир так, щоб білок сої можна відділити від розчинних речовин сої, що включають олігосахариди, що викликають насиченість газом і інші водорозчинні карбогідрати. рН відділеного екстракту доводять придатною кислотою до ізоелектричної точки соєвого білка, переважно до рН від близько pH 4 до близько pH 5, більш переважно від близько pH 4,4 до близько pH 4,6. Придатні харчові кислоти для доведення рН екстракту до близько ізоелектричної точки соєвого білка включають соляну кислоту, фосфорну кислоту, сірчану кислоту, азотну кислоту або оцтову кислоту. Білковий матеріал осаджують переважно соляною кислотою або фосфорною кислотою. Осаджений білковий матеріал (сир) відділяють з екстракту (сироватка), переважно за допомогою центрифугування або фільтрації для виготовлення білкового сирного матеріалу сої. Відділений білковий сирний матеріал сої переважно промивають водою для видалення залишкових розчинних речовин, переважно при ваговому відношенні води до білкового матеріалу від близько 4:1 до близько 10:1. Умови, викладені в прикладах 11 і 12, описують в основному технологічні параметри, які застосовують для виготовлення Supro® 760, Supro® 1610, Supro® 651, Supro® 500E і Supro® 670 – типів ізолятів білка в експлуатаційній платформі великого масштабу. Детальний опис виготовлення Supro® 760 описано в прикладах 13 і 14. Виготовлення Supro® 670 включає етап гідролізації, який не використовують при виготовленні інших ізолятів, і описано в прикладах 16-18. 26 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклад 13 Спосіб отримання Solae Supro® 760 типу білка зі знежиреного HO борошна Для виготовлення Supro® 760 типу білкового матеріалу, білковий сирний матеріал сої, виготовлений як описано в прикладі 12, спочатку нейтралізували до рН 6,8-7,2 водним лужним розчином або водним лужноземельним розчином, переважно розчином гідроксиду натрію або розчином гідроксиду калію. Нейтралізований білковий сирний матеріал сої потім нагрівають. Переважно нейтралізований соєвий сир нагрівають при температурі від близько 75C до близько 160C впродовж періоду від близько 2 секунд до близько 2 годин, де сир нагрівають впродовж довшого періоду при нижчій температурі і впродовж коротшого періоду при вищій температурі. Більш переважно білковий сирний матеріал сої обробляють при підвищеній температурі і під позитивним тиском, більшим ніж атмосферний тиск. Переважним способом нагрівання білкового сирного матеріалу сої є обробка соєвого сиру при температурі, більшій ніж температура навколишнього середовища, за допомогою введення пари під тиском до сиру, яке тут називають "обробка струминного типу.» Наступний опис представляє собою переважний спосіб обробки струминного типу білкового сирного матеріалу сої, тем не менш, даний винахід не обмежений описаним способом і включає будь-які очевидні зміни, які може зробити спеціаліст даної галузі техніки. Білковий сирний матеріал сої вводять в робочий бак печі струминного типу, де соєвий сир тримають в суспензії з апаратом для змішування, який перемішує соєвий сир. Сир направляють з робочого баку до насосу, який пускає сир крізь реакторну трубу. Пару подають до сиру під тиском, доки сир входить в реакторну трубу, негайно нагріваючи сир до бажаної температури. Температуру регулюють за допомогою доведення тиску пари, що вводять, і переважно складає від близько 75C до близько 160C, більше переважно від близько 100C до близько 155C. Сир обробляють при підвищеній температурі впродовж часу обробки, який регулюють швидкістю потоку зависі крізь трубку. Переважно швидкість потоку складає близько 18,5 фунтів/хвилину, і час готовки складає близько 9 секунд при близько 150C. Для виготовлення білкового матеріалу даного винаходу нагрітий нейтралізований сир потім охолоджують і сушать. Сир можна охолодити і висушити будь-яким звичайним способом, відомим в техніці. В переважному варіанті здійснення даного винаходу сир охолоджують за допомогою миттєвого випаровування. Нагрітий сир миттєво випарюють за допомогою введення гарячого сиру в камеру вакуумування, що має вхідну температуру від 20C до 85C, яка негайно зменшує тиск навколо сиру до тиску від близько 25 мм до близько 100 мм ртутного стовпа, і більш переважно до тиску від близько 25 мм ртутного стовпа до близько 30 мм ртутного стовпа. Більш переважно гарячий сир вивантажують з реакторної трубки печі струминного типу в камеру вакуумування, приводячи до миттєвого збільшення тиску і зменшення температури, яка випаровує значну частину води з сиру, миттєво охолоджуючи сир до температури. Переважно камера вакуумування має підвищену температуру до близько 85C для запобігання загущення білкового сирного матеріалу сої при введенні сиру в камеру вакуумування. Теплова обробка під тиском за подальшим швидким зменшенням тиску і випаровуванням води також призводить до випаровуванням значної кількості летких складових частин з соєвого матеріалу, і тим самим покращуючи смак соєвого матеріалу. Миттєво випарений білковий матеріал потім сушать, переважно за допомогою розпилювальної сушки. Переважно розпилювальна сушка представляє собою сушку паралельного потоку, де гаряче вхідне повітря і структурний білковий матеріал, розпорошений за допомогою введення в сушку під тиском крізь розпилювач, проходять крізь сушку паралельним потоком. В переважному варіанті здійснення білковий матеріал подають в сушку крізь розпилюючу форсунку. Хоча розпилююча форсунка є переважною, можна використовувати інші розпилювачі для сушіння, такий як відцентровий розпилювач. Сир подають в сушку під тиском, достатнім для розпилення суспензії. Переважно завись розпилена під тиском близько 3000 psig (фунтів на квадратний дюйм надл.) до близько 5500 psig (фунтів на квадратний дюйм надл.), і більш переважно близько 3500-5000 psig (фунтів на квадратний дюйм надл.). Гаряче повітря подають в сушку крізь вхід гарячого повітря, розташований так, що гаряче повітря, що входить в сушку, тече паралельно з розпорошеним соєвим сиром, розпиленим з розпилювача. Гаряче повітря має температуру від близько 285C до близько 315C, і переважно має температуру від близько 290C до близько 300C. Висушений соєвий білковий матеріал збирають з розпилювальної сушки. Звичайні засоби і способи можна застосовувати для збору соєвого матеріалу, що включають циклони, рукавні фільтри, електростатичні осаджувачі і гравітаційний збір. Приклад 14 27 UA 102533 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Виготовлення SUPRO® 760-типу високоолеїнового соєвого білкового ізоляту SUPRO® 760-тип високоолеїновий соєвий білковий ізолят отримали з високоолеїнової сої згідно наступного способу. 100 фунтів знежирених високоолеїнових соєвих пластівців помістили в екстракційний бак і екстрагували 1000 фунтами води, нагрітої до 32ºC. Це забезпечило вагове відношення води до пластівців 10:1. Пластівці відділили з екстракту і повторно екстрагували 600 фунтами води, нагрітої до 32ºC і яка має достатньо гідроксиду кальцію, доданого для доведення рН до 9,7. Цей другий етап екстракції забезпечив вагове відношення води до пластівців 6:1. Пластівці видалили за допомогою центрифугування, і перший і другий екстракти поєднали і довели до рН 4,5 соляною кислотою, щоб осадити білковий сир. Сир, осаджений кислотою, відділили з екстракту за допомогою центрифугування, залишаючи водну сироватку (видалена), і потім промили водою в ваговій кількості в сім раз більшій, ніж початкові матеріал пластівців для забезпечення ізоелектричного білкового ізоляту. Для виготовлення SUPRO® 760-типу високоолеїнового білкового матеріалу, додали воду до біоелектричного соєвого білкового матеріалу і рН довели до 6,9-7,3 водним розчином гідроксиду натрію для виготовлення нейтралізованої соєвої білкової зависі і потім нагріли за допомогою введення пари під тиском в завись, що тут називають "обробка струминного типу". Нейтральну соєву білкову завись ввели в робочий бак печі струминного типу, де її тримали в суспензії з апаратом для змішування, який збовтує завись. Завись направили з робочого баку до насосу, який подає завись крізь реакторну трубу. Пару вводили в завись під тиском, доки суспензія входила в реакторну трубку, миттєво нагріваючи завись до бажаної температури. Температуру регулювали за допомогою регулювання тиску пари, що вводять. Теплова обробка проводилась близько 9 секунд при близько 150ºC. Нагріту нейтральну завись потім охолодили за допомогою миттєвого випаровування, яке випарило значну частину води з гарячої нейтральної білкової зависі, миттєво охолоджуючи нейтральний білковий матеріал. Охолоджену нейтральну білкову завись потім гомогенізували і перенесли до розпилювальної сушки, де більшість вологи випаровувалось з додаванням тепла для отримання кінцевого SUPRO® 760-типу соєвого білкового ізоляту. Приклад 15 Спосіб отримання Solae Supro® 760 типу білка зі знежиреного HO борошна Для виготовлення Supro® 760-типу білкового продукту даного винаходу, 60 фунтів HO соєвого борошна екстрагували 600 фунтами 32ºC води при 10:1 відношенні води до борошна в апараті для змішування, який змішує соєве борошно для доброго контакту води з пластівцями. Протиспінюючий засіб додали в кількості, достатній для запобігання спінювання, і 54,48 г сульфіту (Na2SO3) додали в цій точці. рН зависі складав 6,6. Завись перемішували 10 хвилин. Завись подали в центрифугу періодичної дії при 12,2 обертів/хвилину при 8,1 % твердих речовин для відділення твердих речовин від рідини. Рідину декантували і тверді речовини повернули до ємності змішування, і повторно екстрагували при 5:1 відношенні води до пластівців при 32ºC. рН суспензії підвищили NaOH до 9,7 і суспензію перемішували впродовж 10 хвилин і відділили в однократній центрифузі при 12,2 обертів/хвилину 3,9 % подачею твердих речовин. Після центрифугування рідину декантували і пластівці, що залишились, видалили. Перший і другий рідинні екстракти поєднали і обробили далі. Щоб осадити білок, рН довели до 4,5 HCl і тримали 10 хвилин. Матеріал подали в однократну центрифугу при 25 обертів/хвилину, 6,0 % твердих речовин і 55ºC для відділення рідкої сироватки від сиру. Рідину декантували і видалили, і тверді речовини повторно суспендовані свіжою водою в 7:1 відношенні води до пластівців, проходили крізь Dispax дробарку для забезпечення ефективного промивання. Подрібнену суспензію подали в однократну центрифугу при 25 обертів/хвилину при 59ºC для відділення промитої рідини з сиру. Вологий сир повторно суспендували водою до 11,3 % твердих речовин, придатних для пастеризації білкової зависі. рН зависі підвищили NaOH до рН 7,1 і завись гомогенізували при 550 psig (фунтів на квадратний дюйм надл.). Завись ввели в робочий бак печі струминного типу, де соєвий сир тримали в суспензії з апаратом для змішування, який перемішує соєвий сир. Сирну завись направили з робочого баку до насосу, який подає сир крізь реакторну трубу 0,94 дюйми в діаметрі і 33 дюйми довжиною. Пару вводили до сиру під тиском, коли сир входив в реакторну трубку, миттєво нагріваючи сир до бажаної температури. Температуру регулювали за допомогою доведення тиску пари, що вводять, і вона складала 149ºC. Сир обробили при підвищеній температурі впродовж 9 секунд. Нагрітий сир потім охолодили і сушили. Сир охолодили за допомогою миттєвого випаровування. Нагрітий сир миттєво випарили за допомогою введення гарячого сиру в камеру вакуумування, що має вхідну температуру 63ºC, яка миттєво знижує тиск до 26 мм ртутного стовпа. Миттєве збільшення тиску і зниження температури випаровує значну частину води з сиру, миттєво охолоджуючи сир до 68ºC. 28