Композиція, яка містить дріжджі saccharomyces cerevisiae, та її застосування як профілактичного продукту

Реферат: Винахід належить штаму дріжджів Saccharomyces cerevisiae, депонованого у Національній колекції культур мікроорганізмів під номером CNCM I-3856 та штаму дріжджів Saccharomyces cerevisiae var. boulardii, депонованого у Національній колекції культур мікроорганізмів під номером CNCM I-3799. Винахід також належить композиції, яка містить вказані дріжджі і/або одне похідне дріжджів та застосуванню композиції як харчової добавки і/або пробіотика, і/або продукту для лікувально-профілактичного харчування, і/або біологічно активної добавки, і/або функціональних інгредієнтів, і/або лікувально-косметичного засобу, і/або фармацевтично активної речовини, призначених для людини і/або тварини. UA 100402 C2 (12) UA 100402 C2 UA 100402 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується сфери харчування й здоров'я людини й/або тварини. Винахід більш переважно стосується нових штамів дріжджів і нових дріжджів, одержуваних, виходячи з нових штамів. Такі дріжджі є особливо корисними для комфортного стану травного тракту й/або для попередження й/або лікування порушень травного тракту людини або тварини. В літературі описана множина мікроорганізмів для корисного застосування у людини в травному тракті й з метою харчування, див., наприклад, WO 2006/021965. Такі мікроорганізми традиційно позначають терміном "пробіотик", який стосується активних мікроорганізмів, здатних приносити організму-хазяїну користь відносно здоров'я в тому випадку, коли їх введення здійснюється в достатній кількості (Joint FAO/WHO Expert Consultation Probiotics in food, FAO Food and nutrition paper Nr 85, ISBN 92-5-105513-0). Корисний результат при пероральному введенні мікроорганізмів великою мірою залежить не тільки від штаму використовуваного мікроорганізму, але також і від форми введення. Навіть серед одного виду, залежно від використовуваних штамів, спостережувані ефекти на практиці дуже сильно варіюють і є іноді позитивними, іноді негативними або нейтральними, як, наприклад, для виду Escherichia coli, у якому можна знайти як патогенні штами (наприклад, типу ентеротоксиногенних або ентерогеморагічних), так і корисні штами, як, наприклад, штам Nissle 1917 (M. de Vrese; P.R. Marteau. Probiotics and Prebiotics: Effects on Diarrhea. 2007, J. Nutr., 137 (3 Suppl. 2), 803S-811S). Таким чином, на даний час стосовно заданого штаму неможливо передбачити, що при введенні такого штаму можна розраховувати на корисний ефект відносно здоров'я людини, і навіть передбачити природу його можливого корисного ефекту або його інтенсивність. Деякі штами мікроорганізмів, зокрема серед дріжджів і молочних бактерій, вже були ідентифіковані відносно деяких випадків корисної дії на шлунково-кишковий тракт. Проте, одержання комплексної корисної дії на шлунково-кишковий тракт часто вимагає супутнього введення декількох штамів різної природи (I. Goktepe; V.K. Juneja; M. Ahmedna (eds). Probiotics in Food Safety and Human Health. 2006, CRC Taylor & Francis, ISBN 1-57444-514-6). Крім того, було помічено, що досить багато мікроорганізмів, зокрема молочні бактерії, мають прозапальну дію. Такий прозапальний ефект може виявитися особливо шкідливим і небажаним, наприклад, у випадку аутоімунних захворювань або імунодефіциту. Описані деякі фракції дріжджів і/або похідні продукти дріжджів відносно їх корисної дії на травний тракт. Так, наприклад, манопротеїни, які є похідними продуктами дріжджів, описані відносно їх інгібувальної дії на адгезію патогенів. Описані також продукти клітинних стінок дріжджів відносно їх дії подібно волокнам. Однак, існує множина штамів дріжджів Saccharomyces cerevisiae, які зовсім не виявляють корисну дію або такі ж ефекти. Крім того, залежно від використовуваних штамів і форм дріжджів, що вводяться, ефекти також можуть дуже сильно варіювати. Таким чином, існує потреба в можливості мати у своєму розпорядженні нові штами мікроорганізмів, які можуть виявляти корисну дію відносно здоров'я профілактично й/або терапевтично на відомі або передбачувані патології або порушення або на загальний стан як фізичного, так і психічного здоров'я. Таким чином, об'єктом даного винаходу є новий штам Saccharomyces cerevisiae, депонований у Національній колекції культур мікроорганізмів під номером CNCM I-3856, і новий штам Saccharomyces cerevisiae var. boulardii, депонований у Національній колекції культур мікроорганізмів під номером CNCM I-3799. Об'єктом даного винаходу є також дріжджі Saccharomyces cerevisiae, одержані, виходячи зі штаму, депонованого в Національній колекції культур мікроорганізмів під номером CNCM I-3856, і дріжджі Saccharomyces var. boulardii, одержані, виходячи зі штаму, депонованого в Національній колекції культур мікроорганізмів під номером CNCM I-3799. Іншим об'єктом даного винаходу є композиція, яка містить дріжджі Saccharomyces cerevisiae, одержані, виходячи зі штаму, депонованого в Національній колекції культур мікроорганізмів під номером CNCM I-3856, і/або дріжджі Saccharomyces var. boulardii, одержані, виходячи зі штаму, депонованого в Національній колекції культур мікроорганізмів під номером CNCM I-3799, і/або щонайменше один похідний продукт дріжджів Saccharomyces cerevisiae, вибраний з екстрактів дріжджів, похідних продуктів клітинних стінок, парієтальних глюканів, парієтальних манопротеїнів, ліпідних фракцій дріжджів, фракцій нуклеїнових кислот дріжджів (РНК, ДНК). Композиція за даним винаходом має наступні переваги: - здатність, зокрема, у сухих формах до опору й виживання при переході шлункового бар'єра, що дозволяє оптимізувати її дію на шлунково-кишковий тракт; - протизапальна дія; 1 UA 100402 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - відсутність прозапальної дії або дуже слабка така дія; - здатність зменшувати болі в кишечнику; - здатність ускладнювати й зменшувати адгезію й заселення бактеріями, які є патогенними й/або мають інвазивний характер, шлунково-кишкового тракту, зокрема тонкого кишечнику й товстої кишки. Ця нова композиція, яка має таку комбінацію характеристик, дотепер ще не була описана або ідентифікована. Таким чином, дана композиція являє собою винятковий інтерес. Іншим об'єктом даного винаходу є застосування згаданої композиції для одержання харчової добавки й/або пробіотика, і/або продукту для лікувально-профілактичного харчування, і/або біологічно активної добавки, і/або функціональних інгредієнтів, і/або лікувальнокосметичного засобу, і/або фармацевтично активної речовини, призначених для людини й/або тварини. У той же час, даний винахід стосується застосування композиції, визначеної раніше, для одержання харчових композицій, призначених для поліпшення комфортного стану шлунковокишкового тракту й/або поліпшення кишкової мікрофлори. Об'єктом даного винаходу є також застосування композиції, визначеної раніше, для одержання лікарського засобу, призначеного для лікування й/або профілактики розладів кишечнику, функціональних порушень кишечнику або захворювань шлунково-кишкового тракту. Об'єктом даного винаходу є також застосування композиції, визначеної раніше, для одержання лікарського засобу, призначеного для лікування й/або профілактики патологій або розладів кишечнику, які характеризуються станом гіпералгезії. Останнім об'єктом даного винаходу є набір, який містить щонайменше один вид дріжджів і/або щонайменше один похідний продукт дріжджів, визначених раніше, у формі, прийнятній для перорального введення. Штам, депонований заявником відповідно до Будапештського договору в Національній колекції культур мікроорганізмів (інститут Пастера, Париж) під номером CNCM I-3856, в подальшому описі для стислості позначається "ScРro1". Штам, також депонований заявником відповідно до Будапештського договору в Національній колекції культур мікроорганізмів (інститут Пастера, Париж) під номером CNCM I3799, в подальшому описі для стислості позначається "SCB1". Також для стислості похідний продукт дріжджів Saccharomyces cerevisiae, вибраний з екстрактів дріжджів, похідних продуктів клітинних стінок, парієтальних глюканів, парієтальних манопротеїнів, ліпідних фракцій дріжджів, фракцій нуклеїнових кислот дріжджів (РНК, ДНК) і їх сумішей, в подальшому описі згадується як "похідне". Під пробіотиком розуміють активні мікроорганізми, які, у випадку їх введення в достатній кількості, виявляють позитивну дію на здоров'я, комфортний стан і гарне самопочуття крім традиційних живильних ефектів. Під продуктом для лікувально-профілактичного харчування або біологічно активною добавкою, або функціональним харчовим продуктом, або лікувально-косметичним засобом розуміють харчовий продукт, який містить інгредієнти, що виявляють корисну дію на здоров'я або здатні поліпшити фізіологічні функції. Під харчовою добавкою розуміють харчовий продукт, призначенням якого є доповнення нормального харчового режиму. Харчова добавка являє собою концентроване джерело живильних речовин або інших речовин, що мають живильну або фізіологічну дію, у тому випадку, коли їх використовують індивідуально або в комбінації в малих кількостях. Під харчовими продуктами, призначеними для спеціального харчування (DDAP), розуміють харчові продукти, метою яких є особливе харчування, призначене для чітко визначеної групи населення, такої як грудні діти, діти молодшого віку, спортсмени. Харчова композиція, така, як згадано в даному винаході, може являти собою харчову добавку або DDAP. Штами за даним винаходом були виявлені заявником завдяки їх численним перевагам і, зокрема, завдяки їх здатності індукувати корисну дію на травний тракт людини й, зокрема, на тонкий кишечник і товсту кишку, а також на організм у цілому. На практиці було помічено, що дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні несподіваним чином здатні індукувати протизапальну дію на протилежність досить великій кількості штамів дріжджів і при цьому без прозапальної дії. На практиці дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні викликають збільшення секреції інтерлейкіну IL-10, залученого в протизапальні сигнали. Крім того, на відміну від дії пробіотичних бактерій типу лактобактерій дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні не 2 UA 100402 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 індукують синтез прозапального цитокіну IL-12. Продукування прозапальних цитокінів TNF і IFN також помітно менше в порівнянні з бактеріальними пробіотиками. У той же час дослідження дозволили довести протизапальний ефект in vivo дріжджів ScРro1 і, зокрема, зменшення вдвічі ступеня запалення товстої кишки й зменшення на третину кишкового некрозу. Крім того, дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні в їх сухих формах здатні долати шлунковий бар'єр без яких-небудь негативних наслідків на їх виживаність або їх цілісність, при цьому дані дріжджі не проникають у внутрішнє середовище товстої кишки. Заявником уперше й несподівано доведено, що дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні здатні збільшувати опірність до болю, зокрема, на моделі зі щуром in vivo. На доповнення до даної корисної дії дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні здатні інгібувати заселення й/або інвазію на рівні кишечнику мікроорганізмів, які є патогенними й/або мають інвазивний характер. Введення даних дріжджів викликає зменшення чисельності ентеробактерій на рівні товстої кишки й кишкової мікрофлори, стійкої до антибіотиків. Зокрема, заявником була показана профілактична й терапевтична активність проти заселення кишечнику дріжджами Candida albicans і запалень, провокованих і підтримуваних даним патогеном. У той же час, дані дріжджі проявляють інгібувальну дію на здатність до адгезії й інвазії штамів, які є патогенними й/або мають інвазивний характер, патотипів Escherichia coli, виділених з біопсійних матеріалів тонкого кишечнику хворих, що страждають хворобою Крона. За даним винаходом дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні можуть бути введені в активній або реактивованій формі переважно пероральним шляхом. Під термінами "активна форма" або "активні" за даним винаходом розуміють ту обставину, що дріжджі мають активний або реактивований метаболізм або здатні до розмноження. Мова йде, зокрема, про дріжджі в сухому або свіжому вигляді. Як правило, дріжджі у свіжому вигляді знаходяться у формі пресованих або питльованих дріжджів. Вони можуть знаходитися також у формі дріжджів у вигляді суспензії на водній основі, називаних також рідкими дріжджами. У цьому випадку дріжджі переважно є інкапсульованими. Способи інкапсулювання й різні типи капсул добре відомі фахівцям у даній галузі техніки. Серед сухих форм дріжджів можна згадати дріжджі, які можуть знаходитися в сухій швидкорозчинній або сухій активній формі. Під сухими дріжджами розуміють будь-які дріжджі, які мають вміст сухої речовини більше 90 % і переважно в інтервалі приблизно від 92 до 96 %. Серед сухих дріжджів також можна згадати швидкозаморожені або незаморожені дріжджі із середньою вологістю. Швидкорозчинні сухі дріжджі призначені головним чином для великих і дрібних хлібопекарських підприємств. Інші варіанти застосування й збуту можливі на основі харчового призначення (технологія лікарських форм, спиртове бродіння). Особливість даних сухих дріжджів полягає в тому, що вони не вимагають зволоження перед додаванням до борошна. Дані дріжджі одержують зневоднюванням дріжджів під дією градієнта гарячого повітря, що дозволяє перетворювати пастоподібний продукт (пресовані або рідкі дріжджі) на продукт у вигляді тонкої сухої вермішелі, який при цьому залишається активним. Потім продукт із метою забезпечення стабільності повинен бути розфасований за відсутності кисню. Сухі активні дріжджі являють собою активні дріжджі, висушені при низькій температурі з метою збереження їх ферментувальної здатності і забезпечення достатньо тривалого зберігання. Дріжджі знаходяться у формі сферичних частинок. Дані дріжджі одержують зневоднюванням дріжджів при спільній дії тепла й механічного впливу, які дозволяють перетворювати дріжджі в пастоподібній формі в сухий продукт, зберігаючи їх життєздатність. Вибрані сухіактивні дріжджі одержують екструзією і висушуванням у псевдозрідженому шарі біомаси (активні клітини дріжджів). Такі сухі активні дріжджі, тобто сухі дріжджі, які мають високий вміст активних клітин дріжджів, знаходяться у формі гранул у загальному випадку з діаметром від 0,1 мкм до 2,5 мм і вмістом H2O від 4 до 8 % мас. Такі сухі форми мають перевагу, яка полягають у тому, що вони забезпечують більш гарну гастрорезистентність у порівнянні з формою свіжих дріжджів і оптимізують корисну дію дріжджів за даним винаходом. Дріжджі за даним винаходом переважно знаходяться у формі сухих активних дріжджів. У загальному випадку відомо, що прозапальні цитокіни стимулюють запальні механізми, які при цьому можуть бути відповідальними за багато які клінічні проблеми, зокрема, у випадках аутоімунних захворювань або імунодефіциту. Так, наприклад, дріжджі за даним винаходом можуть бути використані для профілактики й/або лікування як хронічних, так і гострих захворювань або запальних розладів кишечнику, необов'язково пов'язаних з діареєю або запорами. 3 UA 100402 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У першому варіанті здійснення даного винаходу розлади й захворювання необов'язково пов'язані з діареєю. У другому варіанті здійснення даного винаходу розлади й захворювання не пов'язані з діареєю. Зокрема, дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні можуть бути корисними для профілактики або лікування колітів, які характеризуються в основному запаленням товстої кишки. Зокрема, дані дріжджі є добре прийнятними для профілактики й/або лікування хронічних запальних захворювань кишечнику (MICI), зокрема виразкового коліту, геморагічного ректоколіту, целіакії або хвороби Крона. Дані захворювання характеризуються, зокрема, загостреною імунною відповіддю, у яку залучено багато запальних каскадів. Так, наприклад, у рамках профілактики або лікування даних захворювань пробіотиком і/або продуктом для лікувально-профілактичного харчування, і/або функціональним харчовим продуктом, і/або біологічно активною добавкою, і/або лікувально-косметичним засобом, є важливим, щоб прозапальні ефекти були якомога більш слабкими. Таким чином, дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні за даним винаходом є найбільш переважно прийнятними для такого застосування. Дані дріжджі мають декілька додаткових переваг. Першою перевагою є те, що вони мають здатність збільшувати опірність до болю. Друга перевага, зокрема у випадку хвороби Крона, полягає в тому, що дані дріжджі здатні, зокрема, інгібувати здатність до адгезії й інвазії штамів, які є патогенними й/або мають інвазивний характер E. coli, що походять від хворих, які страждають даним захворюванням. Запальна відповідь може бути, зокрема, обумовлена інвазією будь-яких патогенних мікроорганізмів. Так, наприклад, дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні за даним винаходом проявляють гарну ефективність при профілактиці або лікуванні шлунково-кишкових порушень або захворювань, обумовлених заселенням кишечнику мікроорганізмами, які є патогенними й/або мають інвазивний характер прокаріотів, таких як бактерії, або еукаріотів, таких як гриби. Шлунково-кишкові порушення або захворювання можуть являти собою хронічні запальні кишкові захворювання, такі як виразковий коліт, целіакія, хвороба Крона, геморагічний ректоколіт. Крім того, що дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні дозволяють збільшувати опірність до болю, вони представляють також інтерес для профілактики або лікування патологій або розладів кишечнику, супроводжуваних станом гіпералгезії. Такі патології або розлади можуть являти собою переважно функціональні кишкові розлади, хронічні запальні захворювання кишечнику (MICI) або харчову непереносимість (алергії, вироблення умовних рефлексів і т. д.), які характеризуються хронічним вісцеральним болем. Дані дріжджі переважно прийнятні для профілактики або лікування гіпералгезії, зокрема синдрому подразнення кишечнику (SII) будь-якої форми (запор, діарея або їх комбінація), а також хронічних вісцеральних болів, що не належать до SII, таких як функціональні абдомінальні болі без труднощів дефекації (FAPS: Functional Abdominal Pain) і болі, пов'язані з харчовою непереносимістю й целіакією. Дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні, або будь-які композиції, які їх містять, можуть бути також прийнятними для профілактики у пацієнтів, що мають схильність або підвищену чутливість до порушень або захворювань такого типу, або для лікування, наприклад, у випадку криз або протягом більш тривалих періодів. Композиції й способи за даним винаходом можуть зменшувати страждання хворих, послабляти симптоми або причину таких порушень. Об'єднання дії даних дріжджів і/або їх похідних за даним винаходом на біль, запалення й мікроорганізми, які є патогенними й/або мають інвазивний характер, викликає деяким чином поліпшення самопочуття, здоров'я й/або комфортного стану шлунково-кишкового тракту людини або тварини. Композиція за даним винаходом може містити дріжджі ScРro1 і/або дріжджі SCB1, і/або щонайменше одне похідне дріжджів Saccharomyces cerevisiae, вибране з екстрактів дріжджів, похідних продуктів клітинних стінок, парієтальних глюканів, парієтальних манопротеїнів, ліпідних фракцій дріжджів, фракцій нуклеїнових кислот дріжджів (РНК, ДНК), у кількості в інтервалі 10 8 10 приблизно від 107 до 6·10 КУО і переважно в інтервалі від 10 до 2·10 КУО або в інтервалі від 1 мг до 10 г і переважно в інтервалі від 1 мг до 1 г. Така кількість може являти собою добову кількість, що приймається за один або декілька прийомів протягом доби. 4 UA 100402 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Переважно дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні застосовують при терапевтичному або 10 нетерапевтичному призначенні в добовій дозі в інтервалі від 107 до 6·10 КУО 8 10 (колонієутворювальних одиниць) і переважно в інтервалі від 10 до 2·10 КУО. У випадку, коли дріжджі й/або їх похідні знаходяться в активній, а не в реактивованій формі, добова доза, прийнятна при терапевтичному або нетерапевтичному призначенні, знаходиться переважно в інтервалі від 1 мг до 10 г і більш переважно в інтервалі від 1 мг до 1 г. Ефективна добова доза може бути введена за один, два, три або чотири прийоми. Дріжджі й/або їх похідні за даним винаходом або композиції, які їх містять, переважно вводять пероральним шляхом. Їх кількість може становити терапевтично ефективну дозу, що означає, що щонайменше один із симптомів зменшується або пригнічується. Дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні можуть бути включені в харчову композицію, призначену для людини або тварини, і/або введені з ексципієнтами або наповнювачами, прийнятними для перорального введення. Композиція, призначена для харчування людини, може являти собою рідину, пасту або тверду речовину. Зокрема, композиція може являти собою молочний продукт, такий як сир, масло, йогурт або вершки, продукт на основі фруктів, такий як фруктовий сік, компот або фруктова паста, напій або твердий харчовий продукт, наприклад легкі закуски, галети, або інший продукт. Таким чином, композиція містить дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні й компоненти харчового продукту або напою. Дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні також можуть бути включені у фармацевтичну композицію. Фармацевтична композиція є прийнятною для перорального введення. Таким чином, вона містить дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні, а також відповідну традиційну основу, вибрану з ексципієнтів, дозволених для застосування у фармацевтичних композиціях. Композиція може бути виготовлена у вигляді рідини, такої як сироп або ампули для пиття, або у вигляді таблеток, желатинових капсул, пакетиків, капсул або порошків і інших прийнятних галенових препаратів. Крім того, дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні можуть бути введені з іншими пробіотиками й/або іншими функціональними інгредієнтами, зокрема із пробіотичними бактеріями, зокрема, для найбільш повної профілактичної дії. Як приклад можна згадати молочні бактерії родів Lactobacillus, Bifidobacterium, Pediococcus, Propionibacterium або Leuconostoc. Дріжджі ScРro1 і/або SCB1 і/або їх похідні також можуть бути введені з іншими активними речовинами, такими як антибіотики, анальгетичні засоби, протидіарейні засоби, проносні засоби і їх суміші. Далі даний винахід пояснюється прикладами й фігурами, наведеними в порядку пояснення й необмежувальним чином: - на фіг. 1 показана зміна виживаності дріжджів ScРro1 у травній системі, що моделює товсту кишку людини, відповідно до прикладу 2; - на фіг. 2 показана дія дріжджів ScРro1 на мікрофлору товстої кишки відповідно до прикладу 2; - на фіг. 3 і 4 показана зміна чисельності клітин Candida albicans у випорожненнях мишей у дослідах 1 і 2 прикладу 5, відповідних моделі профілактики (фіг. 3) і лікування (фіг. 4); - на фіг. 5 показана процентна частка залишкової адгезії клітин Escherichia coli AIEC LF82 на епітеліальних клітинах кишечнику людини залежно від кількості дріжджів ScРro1 при попередній інкубації; клітини дріжджів інкубували з епітеліальними клітинами кишечнику протягом години. Інфікування клітин штамом AIEC LF82 здійснювали в присутності дріжджів ScРro1 відповідно до прикладу 6; - на фіг. 6 показана процентна частка залишкової адгезії клітин Escherichia coli AIEC LF82 на епітеліальних клітинах кишечнику людини залежно від кількості дріжджів ScРro1 при спільній інкубації; клітини дріжджів і клітини Escherichia coli інкубували одночасно з епітеліальними клітинами кишечнику протягом години відповідно до прикладу 6; - на фіг. 7 показана оцінка інтенсивності запалення кишечнику мишей згідно з макроскопічною шкалою Wallace після введення дріжджів ScРro1 і SCB1 відповідно до прикладу 4; - на фіг. 8 показана оцінка інтенсивності запалення інтестинального епітелію кишечнику мишей згідно з гістологічною шкалою Ameho після введення дріжджів ScРro1 і SCB1 відповідно до прикладу 4; - на фіг. 9 показана оцінка інтенсивності запалення кишечнику мишей згідно з макроскопічною шкалою Wallace після введення дріжджів ScРro1 і SCB1, введених окремо або в комбінації, відповідно до прикладу 4; 5 UA 100402 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - на фіг. 10 показана оцінка інтенсивності запалення інтестинального епітелію мишей згідно з гістологічною шкалою Ameho після введення дріжджів ScРro1 і SCB1, введених окремо або в комбінації, відповідно до прикладу 4; - на фіг. 11 показаний рівень експресії іРНК гена, кодуючого білок IL-10, через одну і три години після приведення в контакт дріжджів або їх похідних за даним винаходом з епітеліальними клітинами кишечнику людини відповідно до прикладу 7; - на фіг. 12 показаний рівень експресії іРНК гена, кодуючого нуклеарний рецептор PPARα, через одну і три години після приведення в контакт дріжджів або їх похідних за даним винаходом з епітеліальними клітинами кишечнику людини відповідно до прикладу 7; - на фіг. 13 показане модулювання експресії іРНК гена, кодуючого білок IL-10, через одну і три години після приведення в контакт похідних дріжджів за даним винаходом з епітеліальними клітинами кишечнику людини відповідно до прикладу 7; - на фіг. 14 показана експресія гена кодуючого білок IL-10, в епітеліальних клітинах кишечнику мишей після введення дріжджів і/або їх похідних за даним винаходом (приклад 4); - на фіг. 15 показана експресія гена, кодуючого нуклеарний рецептор PPARα, в епітеліальних клітинах кишечнику мишей після введення дріжджів і/або їх похідних за даним винаходом (приклад 4); - на фіг. 16 показана кількість цитокіну IL-10 у пг/мл, секретованого інтестинальними клітинами біопсійних матеріалів хворих, які необов'язково страждають хворобою Крона, після приведення їх у контакт із дріжджами й/або їх похідними за даним винаходом (приклад 8); - на фіг. 17 показана кількість цитокіну TNF-α у пг/мл, секретованого інтестинальними клітинами біопсійних матеріалів хворих, які необов'язково страждають хворобою Крона, після приведення їх у контакт із дріжджами й/або їх похідними за даним винаходом (приклад 8); - на фіг. 18 показані результати досліджень по визначенню здатності зв'язування пілей типу 1 з манопротеїновими фракціями (EL05 і EL06) дріжджів ScРro1; - на фіг. 19A і 19B показана відповідно середня процентна частка залишкової адгезії й залишкової інвазії штаму AIEC LF82 відносно клітин T84 у випадку спільної інкубації зі зростаючими концентраціями дріжджів (приклад 6) - *p < 0,05, **p < 0,01; - на фіг. 20A і 20B показана відповідно середня процентна частка адгезії й інвазії штаму AIEC LF82 відносно клітин T84 у випадку спільної інкубації зі зростаючими концентраціями манопротеїнів дріжджів EL05 (приклад 6); - на фіг. 21A і 21B показана відповідно середня процентна частка залишкової адгезії й залишкової інвазії штаму AIEC LF82 стосовно клітин T84 у випадку попередньої інкубації зі зростаючими концентраціями дріжджів (приклад 6) - *p < 0,05, **p < 0,01; - на фіг. 22A і 22B показана відповідно середня процентна частка адгезії й інвазії штаму AIEC LF82 відносно клітин T84 у випадку попередньої інкубації зі зростаючими концентраціями манопротеїнів дріжджів EL05 (приклад 6) - *p < 0,05, **p < 0,01; - на фіг. 23 показана процентна частка залишкової адгезії штаму AIEC LF82 відноснол клітин CHO-K1 і CHO-K1/CEACAM6 у випадку попередньої інкубації зі зростаючими концентраціями дріжджів ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі (приклад 6) - *p < 0,05, **p < 0,01; - на фіг. 24 показана адгезія штаму AIEC LF82 або мутанта LF82-δfimh, що не має пілей, на щітковій облямівці ентероцитів 3 зразків клітин хворих, які страждають хворобою Крона (приклад 6); - на фіг. 25 показані результати вимірювань порога сприйняття болю (у мм рт. ст.) здоровими щурами у випадку різних дріжджів (приклад 9); - на фіг. 26 показані результати вимірювань порога сприйняття болю (у мм рт. ст.) щурами з вісцеральною підвищеною чутливістю у випадку різних дріжджів (приклад 9). Приклади Приклад 1. Виживаність дріжджів ScРro1 і/або SCB1 у штучному травному середовищі, яке моделює кишечник людини Дослідження зміни дріжджів ScРro1 і/або SCB1 у процесі проходження шлунково-кишкового тракту Дріжджі ScРro1 і SCB1 були випробувані й досліджені in vivo у штучному травному середовищі, яке моделює травлення людини, і, зокрема, шляхом дослідження виживаності випробуваних життєздатних дріжджів у процесі проходження шлунково-кишкового тракту. Були випробувані два зразки сухих активних дріжджів ScРro1 і два зразки сухих активних дріжджів SCB1. Два зразки відрізнялися часом зберігання при кімнатній температурі у вакуумі: тривалість зберігання до 6 місяців і до 2 років. Експериментальні умови 6 UA 100402 C2 5 Процеси травлення здійснювали в системі, називаній TIM1 (шлунок + тонкий кишечник), відповідно до експериментальних умов, установлених, виходячи з даних, одержаних з літературних джерел, і відтворюючи перетравлювання рідкого харчового продукту (води) дорослою здоровою людиною натще з видаленням продуктів травлення діалізом і абсорбцією. Кожний цикл травлення здійснювали протягом 5 годин. Усі експерименти із травленням здійснювали в тих самих загальних дослідних умовах, описаних далі. Температура: температуру підтримували рівною 37 °C. Параметри спорожнювання шлунка: спорожнювання шлунка здійснювали відповідно до залежності, визначеної Elashoff і співавт. (1982) і вираженої відповідно до формули: F  1  2( t / T) 10 b 15 20 25 30 35 40 45 50 55 де F означає порцію їжі, що видаляється, t означає час, T означає час напіввиведення харчового продукту, а b означає параметр, що описує форму кривої. Прийняті параметри: T=15 хв.; b=1. Параметри спорожнювання тонкого кишечнику: спорожнювання тонкого кишечнику здійснювали відповідно до модифікованої залежності Elashoff (при цьому введення параметра d 3 забезпечує уповільнення спорожнювання наприкінці травлення, F m=F + d·t ). Прийняті -7 параметри: T=150 хв.; b=2,4; d = -10 (порівн. фіг. 2). Задані значення pH: шлунок (хв./од. pH): 0/6,0; 10/3,2; 20/2,4; 40/1,8; 60/1,6; 90/1,5; 300/1,5; дванадцятипала кишка: 6,4; порожня кишка: 6,9; клубова кишка: 7,2. Шлункова секреція: HCl; пепсин; ліпаза. Кишкова секреція: NaHCO3 у трьох ділянках тонкого кишечнику; екстракт жовчі у дванадцятипалу кишку; екстракт підшлункової залози у дванадцятипалу кишку. Діаліз/абсорбція Видалення "малих" порцій кишкового хімусу здійснювали на двох рівнях TIM1 (порожня кишка й клубова кишка) за допомогою гемодіалізаторів. Діаліз кишкового хімусу здійснювали безперервно із сольовим розчином, склад якого був близький до складу плазми крові. Діалізати збирали в діалізні мішки. Відбір проб здійснювали в процесі травлення на різних рівнях тракту з метою контролю виживаності досліджуваних дріжджів. Підрахунки чисельності дріжджів здійснювали відповідно до традиційних мікробіологічних методик і прийнятого відбору проб: у шлунку через 10, 20, 30 і 45 хв., на виході з тонкого кишечнику з накопиченням протягом години й у кінцевому залишку. Методика підрахунку викладена далі. Для кожної відібраної проби швидко здійснювали послідовне десятикратне розведення стерильним фізіологічним розчином (NaCl, 8,5 г/л). Потім 0,1 мл кожного розведення наносили й потім розподіляли по поверхні агарового середовища, розлитого в чашки Петрі (дві чашки на одне розведення). Чашки інкубували протягом 48 год. при 35 °C перед підрахунком "колонієутворювальних одиниць" (КУО). Результати підрахунку виражали в КУО/мл (необроблені дані) і у процентному відношенні клітин активних дріжджів у порівнянні із числом клітин первісно введених дріжджів для визначення рівня виживаності дріжджів у шлунку й на виході з тонкого кишечнику. У наведеній далі таблиці узагальнені теоретичні рівні виживаності (при 100 %-ній життєздатності) і реальні значення, одержані для кожного штаму на рівні шлунка, у накопиченій пробі на виході з тонкого кишечнику після 5 год. травлення й у накопиченій пробі системи після 5 год. травлення. Результати 7 UA 100402 C2 Продукти травлення ScРro1, зразок 1 ScРro1, зразок 2 SCB1 1 SCB1 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Введені дріжджі, КУО 3,5·1010 2,0·1010 1,5·1010 1,5·1010 На виході зі шлунка через T=45 хв. 89 % 88 % 83 % 85 % На виході з тонкого Загальна кишечнику через T=5 виживаність через год. T=5 год. 100 % 106 % 95 % 106 % 76 % 81 % 69 % 76 % Висновок Дані результати добре демонструють чудову виживаність у шлунково-кишковому тракті дріжджів ScРro1 і SCB1. Приклад 2. Виживаність дріжджів ScРro1 у штучному травному середовищі, яке моделює кишечник людини Дослідження виживаності дріжджів ScРro1 під час ферментації в товстій кишці й вплив дріжджів на кишкову мікрофлору Дріжджі ScРro1 у сухій активній формі були випробувані й досліджені in vitro у штучному травному середовищі, яке моделює травлення людини, і, зокрема, шляхом дослідження зміни й впливу життєздатних досліджуваних дріжджів на середовище під час ферментації в товстій кишці. Ферментація в товстій кишці є безперервною ферментацією з послідовним надходженням середовища для збереження мікрофлори. Дане середовище містить головним чином складні вуглеводні сполуки, не перетравлені у верхній частині травного тракту (крохмаль, пектин, целюлоза т. п.), у більшій або меншій мірі гідролізовані білкові сполуки й муцин. Ферментовані сполуки витягають із середовища товстої кишки також послідовно. Середовище проходить через систему діалізу, яка забезпечує безперервне видалення розчинних продуктів ферментації. Діалізат збирають для аналізу жирних кислот з короткими ланцюгами (AGCC). Середовище витримують в анаеробних умовах, створюваних за рахунок власних газів ферментації, при цьому середовище має окисно-відновний потенціал менше -300 мВ. На закінчення pH доводять до заданого значення, яке дорівнює 6. Кожний цикл травлення включає в себе: період стабілізації мікрофлори протягом 2-3 днів після засівання товстої кишки, період обробки (щонайменше протягом 3 днів) щонайменше з одним щоденним додаванням продукту й період припинення обробки протягом 3 днів. У кожному досліді контролювали й/або реєстрували наступні параметри: - життєздатність дріжджів; - зміна різних аеробних і анаеробних бактеріальних популяцій; - зміна основних продуктів ферментації (AGCC і гази); - детектування стандартної ферментативної активності; - температура, pH і окисно-відновний потенціал. Ферментацію здійснювали в пеніциліновому флаконі місткістю 60 мл, закритому герметизованою пробкою із септою і заповненому на 30 мл середовищем товстої кишки (культуральне середовище зі свіжою фекальною мікрофлорою). Зразок дріжджів додавали до 30 мл середовища. Середовище товстої кишки складалося, з одного боку, з мікробної суспензії, одержаної зі свіжих випорожнень, у буферному фосфатному розчині, а з іншого боку, з типового харчового продукту, використовуваного також для культивування мікрофлори товстої кишки в штучній товстій кишці. Після змішування середовища товстої кишки з досліджуваним продуктом флакон закупорювали й герметизували. Усі дані маніпуляції робили у витяжній анаеробній шафі (в атмосфері суміші газів, яка не містить кисень). Флакон поміщали в роторний інкубатор (37 °C-200 об./хв.) на 24 год. Для кожного продукту дослідження здійснювали у двох пробах. При цьому в тих же самих умовах готовили також 4 флакони з контрольними пробами (без досліджуваного продукту). При цьому два флакони обробляли негайно (початковий час), а два флакони інкубували так само, як і випробувані флакони. Ферментацію зупиняли через 24 год., а потім флакони обробляли. Продукування ферментаційних газів. Обсяг газів, які утворюються при ферментації, визначали за допомогою системи Маріотта (принцип вимірювання об'єму води, що витісняється 8 UA 100402 C2 5 10 15 20 тиском газів, які містяться в пеніциліновому флаконі). При цьому аналіз газів, які містяться у флаконі, здійснювали способом CPG (H2, CO2, CH4, O2). Продукування жирних кислот з короткими ланцюгами. Здійснювали відбір першої проби вмісту товстої кишки. Пробу або заморожували, або відразу обробляли для визначення концентрації AGCC (леткі жирні кислоти з короткими ланцюгами) у надосадовій культуральній рідини. Даний аналіз здійснювали способом CPG. Досліджені метаболіти являли собою оцтову, пропіонову, масляну, ізомасляну, валеріанову, ізовалеріанову, капронову, ізокапронову й гептанову кислоти. Мікробіологічний аналіз. Здійснювали відбір другої проби вмісту товстої кишки й відразу обробляли (послідовне десятикратне розведення відновним середовищем для розведення) для підрахунку чисельності загальної анаеробної, факультативної аеробно-анаеробної і грибкової мікрофлори. Результати по виживаності дріжджів ScРro1 представлені на фіг. 1. На даній фігурі кожна вертикальна стрілка вказує на введення дріжджів ScРro1. Було відзначено, що дріжджі ScРro1 проявляють гарну виживаність до 3-го дня після введення й значну загибель між 4-м і 7-м днями періоду введення. Дана обставина показує, що дріжджі не проникають у внутрішнє середовище товстої кишки. Результати мікробіологічного аналізу представлені на фіг. 2. Вони показують зменшення чисельності ентеробактерій у присутності дріжджів ScРro1 з підвищенням після припинення введення дріжджів. Під час введення дріжджів ScРro1 також було відзначено, що значно зменшилася мікрофлора, стійка до антибіотиків (хлорамфенікол, гентаміцин). Результати по дії дріжджів ScРro1 на продукування летких жирних кислот з короткими ланцюгами (AGCC) узагальнені в наведеній далі таблиці (у мм у середовищі товстої кишки). Ацетат Пропіонат Бутират Ізобутират Ізовалерат Валерат Ізокапронат Капронат Гептаноат Разом Перед обробкою 71,4±2,3 22,8±0,6 35,0±1,6 3,2±0,3 5,6±0,5 8,0±0,6 0,1±0,1 9,0±1,1 0,2±0,2 155,3±2,7 Під час обробки 57,6±4,2 26,5±4,2 36,5±2,2 3,3±0,2 5,2±0,2 7,8±1,4 0,0±0,0 7,3±0,3 0,0±0,1 144,1±6,8 Після обробки 60,6±0,7 35,7±1,1 26,6±4,2 3,4±0,1 5,3±0,0 9,1±0,9 0,0±0,0 5,7±0,7 0,0±0,0 146,4±3,4 25 30 35 40 45 Під час обробки було відзначене зменшення вмісту ацетатів, частково на користь пропіонатів, що передбачає зменшення активності ацетогенної мікрофлори. Серед інших контрольованих параметрів не була помічена явна дія обробки на: - продукування газів (по кількості й вмісту); - загальну й просту (стабільну у часі) концентрацію цукрів; - ферментативну активність. Приклад 3. Дослідження впливу дріжджів ScРro1 і SCB1 на індукування продукування цитокінів Був досліджений вплив активних дріжджів ScРro1 і SCB1 на індукування продукування цитокінів у периферичних мононуклеарних клітинах крові людини (PBMC). Дріжджі ScРro1 і SCB1 були досліджені в сухій швидкорозчинній формі й сухій активній формі відносно їх здатності індукувати продукування цитокінів IL-10, IL-12, TNFα, TNFγ в PBMC людини. Одержання периферичних мононуклеарних клітин крові людини Свіжу людську кров, одержану від донорів з гарним здоров'ям у Центрі гемотрансфузії, розбавляли в 2 рази PBS-Ca (GIBCO) і очищали із градієнтом фіколу (GIBCO). Після центрифугування при 400 g протягом 30 хвилин при 20 °C периферичні мононуклеарні клітини крові (PBMC) утворюють у сироватці шар у формі кола. PBMC ретельно збирали аспірацією, суспендували в 50 мл кінцевого об'єму з використанням Pbs-Ca і промивали 3 рази таким же буферним розчином із центрифугуванням протягом 10 хвилин при 20 °C і 350 g. Потім PBMC знову суспендували, використовуючи повне середовище RPMI (GIBCO), збагачене 10 % мас./об. ембріональної телячої сироватки (інактивованої при 56 °C протягом 30 хвилин), 1 % мас./об. L-глутаміну (GIBCO) і гентаміцином (150 мкг/мл) (GIBCO). Кількість PBMC 9 UA 100402 C2 6 5 10 15 20 25 30 підраховували під мікроскопом, відрегульованим на концентрацію 2·10 клітин/мл, і розподіляли (в 1 мл аліквоти розчину) по 24-ямкових чашках для культивування клітин (Corning, Inc.). Мікробіологічні препарати Після культивування, здійсненого протягом ночі, Lactobacillus, Lactococcus і Escherichia coli (контрольні штами) промивали 2 рази буферним розчином PBS, pH=7,2, перед наступним 9 суспендуванням в PBS з концентрацією 2·10 КУО/мл. 8 Концентрація дріжджів, використана в першій серії дослідів, становила 2·10 КУО/мл. Для дослідження порівняння вихідної дози можна було здійснити послідовні разведення 10 на 10 7 8 9 для порівняння дії при концентраціях 2·10 , 2·10 і 2·10 КУО/мл. Інкубація периферичних мононуклеарних клітин крові людини 10 мкл робочої суспензії поміщали в ямки чашок, що містять PBMC, і інкубували при 37 °C в атмосфері суміші 5 % CO2 і 95 % атмосферного повітря. Після інкубації протягом 24 годин надосадову рідину відсмоктували, центрифугували при 2000 об./хв. (модель Еппендорфа), витягали осад і зберігали при -20 °C. Контрольний зразок складався із грампозитивних бактерій (Lactobacillus і Lactococcus), грамнегативних бактерій (Escherichia coli) і буферного розчину за відсутності дріжджів. Кількісне визначення цитокінів Рівні експресії цитокінів визначали способом ELISA. Планшети для аналізу ELISA покривали антитілом (протягом ночі), а антитіло насичували 1 %-ним розчином PBS/BSA (бичачого сироваткового альбуміну). Градуювальну криву одержували з відомими концентраціями цитокінів з межами виявлення від 15,62 до 2000 пг/мл (інкубація протягом ночі). Дослідження й кількісне визначення антицитокіну здійснювали вимірюванням активності стрептавідину із субстратом TMB (тетраметилбензидин, PHarmingen2). Були використані комерційні набори PHarmingen відповідно до опису виготовлювача. Були вибрано чотири цитокіни: 3 прозапальних (TNFα, IFN, IL-12) і один протизапальний (IL-10). Результати Відповіді 4 цитокінів на 5 різних донорів оцінювали при співвідношенні дріжджі/PBMC, яке дорівнює 1/1. Результати кількісного визначення 4 цитокінів, секретованих у надосадову культуральну рідину, узагальнені в наведеній далі таблиці A. Дані представлені як середнє значення (Moy) кількісного визначення по 5 донорах. У таблиці наведені також значення стандартної помилки середнього значення (Sem). Таблиця A IL-10 (пг/мл) Moy Sem Негативна контрольна проба E. coli Lactococcus lactis Bifidobacterium longum Lactobacilus acidopHilus SCB1 ScРro1 35 40 45 IFN (пг/мл) Moy Sem TNFα (пг/мл) Moy Sem IL-12 (пг/мл) Moy Sem 0 0 50 0 50 0 0 0 2474 111 1072 435 569 442 839 43 355 259 291 292 57376 136103 33780 85543 27807 15218 29591 62706 27164 46838 19231 9304 11185 25362 14517 18369 6492 3643 3875 9818 5601 6857 2698 1847 15 1101 22 529 14 8 15 543 20 343 10 5 Було помічено: 1) продукування у випадку дріжджів ScРro1 і SCB1 дуже малої, у деяких випадках невиявлюваної кількості IL-12, індукованого PBMC, на відміну від порівняльних бактерій; 2) суттєві рівні IL-10 в обох випадках активних дріжджів, що дозволили виявити, що SCB1 має більш гарний результат, ніж ScРro1; 3) явно менші в порівнянні з різними досліджуваними пробіотичними бактеріями кількості IFN і TNFα, секретовані під дією дріжджів ScРro1 і SCB1. Висновки: - очевидно, що дріжджі ScРro1 і SCB1 у присутності PBMC не індукують експресію прозапального цитокіну IL-12 на противагу тому, що традиційно спостерігають у випадку пробіотичних лактобактерій; - дріжджі ScРro1 і SCB1 у присутності PBMC індукують суттєві рівні IL-10 (протизапального); - кількості IFN- і TNF-α, секретованих PBMC у присутності дріжджів ScРro1 або SCB1, явно менші, ніж у випадку пробіотичних бактерій. 10 UA 100402 C2 5 10 15 20 25 30 35 Приклад 4. Оцінка захисної дії дріжджів ScРro1 і SCB1 у випадку хімічно індукованого коліту (TNBS) у моделі з мишею Традиційно використовувана запропонована модель із твариною була адаптована для вимірювання протизапальної дії дріжджів. У даному досліді були використані миші лінії Balb/c у віці 6 тижнів. Миші були акліматизовані в умовах лабораторії протягом тижня перед дослідом з вільним доступом до води і їжі. Кожний зразок випробовували на групі з 10 мишей. Коліт індукували в циклі з вільним доступом до питної води, що містила 5 % (мас./об.) TNBS, протягом 7 днів. Дріжджі вводили перорально один раз на день через шлунковий зонд за 3 дні до початку індукування коліту за допомогою TNBS і протягом періоду обробки TNBS (7 днів). Крім двох досліджуваних груп використовували контрольну групу (негативний контроль), у якій застосовували тільки фізіологічний розчин. Параметри випробувань, одержані за результатами обробки, наведені далі. - Макроскопічне оцінювання запалення кишечнику (шкала Wallace). Товста кишка кожної миші була оглянута під препарувальною лупою (5-кратне збільшення) для оцінки макроскопічних ушкоджень по шкалі Wallace від 0 до 10 залежно від критеріїв оцінки, що характеризують ступінь запалення, таких як гіперемія, товщина стінки товстої кишки й площа укривання виразками. - Гістологічне оцінювання запалення (шкала Ameho). Для здійснення гістологічного оцінювання по шкалі Ameho від 0 до 6 залежно від ступеня інфільтрації запалення, наявності ерозії, укривання виразками або некрозів і глибини, а також поширення ушкоджень по поверхні використовували ділянку товстої кишки, що відбирається точно в 2 см від анального каналу. Кількісне визначення деградації й ушкоджень кишечнику здійснювали 2 незалежних експерти. - Кількісне визначення експресії генів, кодуючих IL-10 і PPARα. З цією метою із тканин товстої кишки виділяли загальну РНК за допомогою набору Rneasy (Macherey Nagel, Хердт, Франція) згідно з інструкцією виготовлювача. Кількісне визначення інформаційної РНК здійснювали, використовуючи спектрофотометр. Після обробки при 37 °C протягом 30 хвилин з 20-50 одиницями препарату Dnase I Rnase-free (Roche Diagnostics Corporation, Індіанаполіс, Індіана, США) були використані праймери оліго-DT (Roche Diagnostics Corporation, Індіанаполіс, Індіана, США) для синтезу простих одноланцюжкових кільцевих ДНК. Інформаційні РНК кількісно визначали за допомогою набору SYBR green Master Mix (Applera, Куртабеф, Франція) і олігонуклеотидів людини, призначених для досліджень in vitro (див. табл. B, наведену далі), за допомогою приладу Geneamp Abiprism 700 (Applera, Куртабеф, Франція). У кожному досліді використовували еталонні й нееталонні контрольні зразки. Для кожного зразка здійснювали три вимірювання. Інтенсивність забарвлення препарату SYBR vert визначали з використанням програми Abiprism 7000 SDS (Applera, Куртабеф, Франція). Усі результати нормалізовані в порівнянні з геном, кодуючим β-актин. Таблиця B Гени 40 45 50 Послідовності нуклеотидних затравок F: 5'-Aagtccctcaccctcccaaaag-3' β-актин R: 5'-Aagcaatgctgtcaccttccc-3' F: 5'-Acgatgctgtcctccttgatg-3' PPARα R: 5'-gtgtgataaagccattgccgt-3' F: 5'-Cagtcagccagacccacat-3' IL-10 R: 5'-gctccactgccttgcttt-3' Дріжджі ScРro1 і SCB1 були досліджені в описаній раніше стандартній моделі профілактики. Контроль маси тіла тварин перед індукуванням коліту показав, що композиції дріжджів, які вводяться мишам, дуже добре переносилися. Запалення кишечнику, оцінене по шкалі Wallace, у випадку дріжджів ScРro1 (суха активна форма, 1 мг/добу) і SCB1 зменшилося на 60 % у порівнянні з позитивним контролем. Дріжджі SCB1 також викликали зменшення запалення. Некроз кишечнику, оцінений по шкалі Ameho, у випадку дріжджів ScРro1 (суха швидкорозчинна форма, від 1 мг до 100 мкг/добу) зменшився на третину в порівнянні з позитивним контролем. Дріжджі ScРro1 і SCB1, введені окремо або спільно, підвищили рівень експресії генів, кодуючих протизапальний інтерлейкін IL-10 і нуклеарний рецептор PPARα. На фіг. 7-10 добре видні чудові значення макроскопічних показників по шкалах Wallace і Ameho для дріжджів ScРro1 і SCB1 з різними добовими дозами. На фіг. 7 і 8 представлені відповідно макроскопічний показник по шкалі Wallace і 11 UA 100402 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гістологічний показник по шкалі Ameho для дріжджів ScРro1 і SCB1 у сухій швидкорозчинній формі, що вводяться щодня в кількості від 10 мкг до 1 мг. Цифрами при кожному стовпці графіків, показаних на фіг. 7 і 8, позначені наступні варіанти: 1 означає TNBS, узятий окремо; 2 означає TNBS+ScРro1 (1 мг); 3 означає TNBS+ScРro1 (100 мкг); 4 означає TNBS+SCB1 (1 мг); 5 означає TNBS+SCB1 (100 мкг). Можна помітити, що дріжджі ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі, що вводяться з дозою 100 мкг/добу, у значній мірі зменшують ушкодження на макроскопічному й гістологічному рівнях. На фіг. 9 і 10 представлені відповідно макроскопічний показник по шкалі Wallace і гістологічний показник по шкалі Ameho для дріжджів ScРro1 і SCB1, які взяті окремо або в комбінації в сухій швидкорозчинній формі або в сухій активній формі й вводяться щодня в кількості від 100 мкг до 1 мг. На фіг. 14 і 15 показані відповідно рівні експресії генів, кодуючих протизапальний інтерлейкін і нуклеарний рецептор PPARα, на рівні інтестинальних клітин. Цифрами при кожному стовпці графіків, показаних на фіг. 9, 10, 14 і 15, позначені наступні варіанти: 1 означає TNBS, узятий окремо; 2 означає TNBS+ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі (100 мкг); 3 означає TNBS+ScРro1 у сухій активній формі (100 мкг); 4 означає TNBS+SCB1 у сухій активній формі (100 мкг); 5 означає TNBS+ScРro1 у сухій активній формі (1 мг); 6 означає TNBS+ScРro1 у сухій активній формі (100 мкг); 7 означає TNBS+ScРro1 у сухій активній формі (100 мкг) + SCB1 (100 мкг). Висновки Можна відзначити, що дріжджі ScРro1 у сухій активній формі в значній мірі викликають ушкодження на макроскопічному рівні й існує синергічний протизапальний ефект комбінації ScРro1 і SCB1 як на макроскопічному рівні, так і на гістологічному рівні. Дріжджі ScРro1 і SCB1 підвищили відповідно в 2,9 і 3,1 разу рівень експресії гена, кодуючого протизапальний інтерлейкін IL-10, при дозах 100 мкг. Комбінація ScРro1+SCB1 (стовпець № 7) підвищила в 2,7 разу даний рівень експресії (фіг. 14). Дріжджі ScРro1 і SCB1 підвищили відповідно в 1,5 і 1,6 разу рівень експресії гена, кодуючого нуклеарний рецептор PPARα, при дозах 100 мкг. Комбінація ScРro1+SCB1 (стовпець № 7) підвищила в 1,7 разу даний рівень експресії (фіг. 15). Приклад 5. Дослідження впливу дріжджів ScРro1 і SCB1 на заселення дріжджами Candida albicans на рівні кишечнику у випадку хімічно індукованого запалення в моделі з мишею Метою дослідження є визначення ефектів введення дріжджів ScРro1 і SCB1 пробіотичного типу на заселення кишечнику патогенними дріжджами Candida albicans і його ефект потенціювання запалення у випадку хімічно індукованого коліту в моделі з мишею. Досліджувані дріжджі прийняті в сухій швидкорозчинній формі. Експериментальні умови Миші-самки лінії Balb/C мали вік від 4 до 6 тижнів. Від дня J0 до дня J14 тварини одержували DSS (Dextran Sodium Sulfate (сульфат декстраннатрію) з концентрацією 1,5 % у питній воді для хімічного індукування запалення. Було здійснено три досліди. 7 У першому досліді від дня J5 мишам через канюлю вводили 5·10 клітин дріжджів ScPro1 в 200 мкл PBS (буферний фосфатний розчин). Дану процедуру повторювали щоденно протягом 7 19 днів. В день J0 мишам через канюлю вводили 5·10 клітин дріжджів штаму C. albicans SC5314 в 200 мкл PBS. 7 У другому досліді в день J0 мишам через канюлю вводили 5·10 дріжджових клітин штаму C. albicans SC5314 в 200 мкл PBS. Через 4 дні частині мишей через шлунковий зонд вводили по 7 5·10 клітин дріжджів ScPro1 в 200 мкл PBS. Дану процедуру повторювали щоденно протягом 14 днів. 7 У третьому досліді в день J0 мишам через канюлю вводили 5·10 клітин дріжджів штаму C. albicans SC5314 в 200 мкл PBS. Через годину частині мишей через шлунковий зонд вводили по 7 5·10 клітин дріжджів ScPro1 в 200 мкл PBS. Дану процедуру повторювали щоденно протягом 14 днів. Тварин (з дослідів 1, 2 і 3) щодня контролювали за наступними показниками: - консистенція випорожнень, анальна кровотеча, маса тіла (клінічний показник); 12 UA 100402 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 - ретрокультивування 1 мг випорожнень, гомогенізованих в 1 мл PBS, 10 мкл якого засівали на середовище Candi-select; після культивування протягом 24 год. при 37 °C підраховували КУО C. albicans (забарвлених у синій колір) і S. cerevisiae (забарвлених у зелений колір); - тварин забивали по закінченні випробування. Відразу відбирали кров пункцією в серце, декантували при кімнатній температурі, сироватку відділяли центрифугуванням і зберігали при 80 °C. Відбирали товсту кишку й ділили на 4 частини, з яких 3 заморожували, а 1 поміщали у фіксатор (PFA, 4 %) для гістологічного дослідження. Результати Як можна бачити на фіг. 3, у першому досліді (випробування на профілактичну дію) у даній моделі хімічно індукованого коліту спостерігається, що введення DSS у значній мірі збільшує заселення слизових оболонок кишечнику дріжджами C. albicans, починаючи із дня J4 (DSS+Ca). Становить великий інтерес те, що введення пробіотичних дріжджів ScРro1 протягом 19 днів у значній мірі зменшує заселення дріжджами C. albicans, індуковане за допомогою DSS. Як видно з фіг. 4, у другому досліді (випробування на терапевтичну дію) спостерігається, що введення пробіотичних дріжджів ScРro1 або SCB1 зменшує заселення, індуковане за допомогою DSS. Крім того, дія дріжджів ScРro1 помітна навіть після припинення обробки за допомогою DSS у день J14. Висновки З викладеного випливає, що введення дріжджів ScРro1 або дріжджів SCB1 у значній мірі зменшує заселення дріжджами C. albicans, причому як в умовах профілактики, так і в умовах терапії. Слід помітити, що така захисна дія триває навіть після припинення терапії. Приклад 6. Дослідження інгібувальної дії дріжджів ScРro1 або SCB1 або їх похідних на здатність до адгезії й інвазії патогенних штамів E. coli, виділених з біопсійних матеріалів тонкого кишечнику хворих, які страждають хворобою Крона Вплив активних дріжджів ScРro1, SCB1 і їх похідних був досліджений відносно їх інгібувальної дії на здатність до адгезії й інвазії патогенних штамів E. coli, виділених з біопсійних матеріалів тонкого кишечнику хворих, які страждають хворобою Крона. Штами E. coli, скорочено називані AIEC від Adherent-Invasive E. coli і виділені з біопсійних матеріалів тонкого кишечнику хворих, які страждають хворобою Крона (MC), здатні прикріплюватися й захоплювати епітеліальні клітини кишечнику. Штам E. coli LF82, виділений із хронічно ушкодженої ділянки тонкого кишечнику у хворого, який страждає хворобою Крона, має всі характеристики інвазивного бактеріального патогену. Характеристика фенотипу "адгезія-інвазія" штаму LF82 і відсутність генетичних визначників інвазії, вже описаних в E. coli, Shigella і Salmonella, привели до детермінування існування нової патогенної групи E. coli, яка може бути пов'язана із хворобою Крона й позначена AIEC. Після фагоцитозу макрофагами миші або людини штам AIEC LF82 виживає й розмножується в широкій вакуолі, при цьому зберігаючи цілісність клітини-хазяїна. У відповідь на інфекцію макрофаги секретують значну кількість TNFα. Ступінь поширення штамів AIEC на рівні ушкоджень тонкого кишечнику хворих, які страждають MC, дорівнює 36,4 %. Процес адгезії бактерії на клітинах еукаріотів є результатом специфічної взаємодії між лігандом, присутнім на поверхні бактерії й називаним адгезином, і рецептором протеїнової, глікопротеїнової або гліколіпідної природи, експресованим на поверхні епітеліальної клітинихазяїна. Відносно бактерій було доведено, що адгезин Fimh пілей типу 1 залучений в адгезію бактерій AIEC на епітеліальних клітинах кишечнику. Бактеріальний адгезин Fimh розпізнає ентероцитарний рецептор CEACAM6 (називаний також CD66c або NCA), який являє собою глікопротеїн, багатий залишками манози й аномально надекспресований на рівні тонкого кишечнику у 90 % хворих, які страждають MC. Експериментальні умови Як штам-прототип був використаний штам AIEC LF82, що відрізняється своєю здатністю до адгезії й інвазії на епітеліальних клітинах кишечнику в культурі. Дане дослідження було проведене також з 10 штамами AIEC, виділеними у хворих, які страждають MC, для підтвердження результатів, одержаних зі штамом AIEC LF82. Штам E. coli DAEC (Diffuse Adherent Escherichia Coli) C1845, який прикріплюється до епітеліальних клітин по механізму, що не залежить від манози (адгезини Afa/Dr), був використаний як негативна контрольна проба. Випробування на аглютинацію З активними дріжджами ScРro1 і SCB1 були здійснені випробування на кількісну аглютинацію як у присутності бактерій AIEC, так і в присутності екстрактів очищених пілей типу 1, одержаних, виходячи зі штаму AIEC LF82, згідно з методикою, описаною Boudeau і співавт. 13 UA 100402 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (2001, Mol. Microbiol. 39:1272-84). Індекс аглютинації визначали по фіксованій концентрації дріжджів і змінній концентрації бактерій або очищених пілей типу 1. У випадку фракцій дріжджів манопротеїнового типу, для яких не спостерігається аглютинація, визначення здатності зв'язування пілей типу 1 здійснювали способом ELISA. Такі випробування традиційно здійснюють у мікропланшетах. Фракції дріжджів фіксують на мікропланшеті. Різні розведення очищених пілей типу 1 приводять у контакт із фракціями дріжджів. Після промивань пілей типу 1 відкривають за допомогою антитіл анти-пілі типу 1, одержаних від кролика (Boudeau і співавт., 2001). Після промивання використовують вторинні антитіла, зв'язані з пероксидазою. Кількісне визначення здійснюють за допомогою субстрату пероксидази (H2O2) і хромогену (тетраметилбензидину) шляхом вимірювання оптичної густини на мікропланшетному фотометрі при 450 нм. Випробування на інгібування взаємодії бактерій AIEC з рецептором CEACAM6, експресованим на поверхні епітеліальних клітин кишечнику, дріжджами ScРro1 або SCB1 Використані клітини Для випробування на інгібування in vitro (попередня й спільна інкубація) були взяті недиференційовані епітеліальні клітини кишечнику T84, у значній мірі експресуючі рецептор CEACAM6. Клітини T84 культивували в атмосфері з 5 % CO2 при 37 °C у лужному середовищі DMEM (середовище Ігла в модифікації Дульбекко), доповненому 50 % Ham-F12 (Life Technology) і 10 % ембріональної телячої сироватки, декомплементованої при нагріванні. До даного середовища додавали 1 % амінокислот, які не є незамінними (Life Technology), 1 % глутаміну (Life Technology), 200 од./л пеніциліну, 50 мг/л стрептоміцину, 0,25 мг/л амфотерицину B і 1 % суміші вітамін X-100 для середовища MEM (Minimum Essential Medium) (Life Technology). 5 Клітини засівали з розрахунку 4·10 клітин на ямку в 1 мл і інкубували протягом 48 год. при 37 °C в атмосфері з 5 % CO2. Потім шар клітин T84 промивали розчином PBS і далі в кожну з ямок додавали 1 мл інфікованого середовища (DMEM/F12+10 % SVF). Бактеріальну суспензію в PBS з оптичною густиною DO620, що дорівнює 0,1, готували, виходячи зі штаму AIEC LF82, культивованого протягом ночі при 37 °C в бульйоні Луріа-Бертані (LB). Клітини T84 інфікували мультиплетним джерелом інфекції (MOI) з розрахунку 10 бактерій на 1 клітину, додаючи 25 мкл бактеріальної суспензії з оптичною густиною DO620, що дорівнює 0,1, до інфікованого середовища. Планшет на 24 ямки інкубували протягом 3 год. при 37 °C в атмосфері, збагаченій CO2. Визначення залишкової адгезії і залишкової інвазії бактерій здійснювали відповідно до описаного далі. Здійснювали дослід із клітинами CHO-K1, не експресуючими CEACAM6, і такими ж генетично модифікованими клітинами, стабільно експресуючими CEACAM6 (CHOK1/CEACAM6). Клітини CHO-K1 культивували в середовищі DMEM/F12, що містило 5 % ембріональної телячої сироватки, 1 % L-глутаміну, 200 од./л пеніциліну, 50 мг/л стрептоміцину й 0,25 мг/л амфотерицину B. Клітини CHO-K1 культивували в середовищі DMEM/F12, що містило 5 % ембріональної телячої сироватки, 1 % L-глутаміну й 600 мкг/л гігроміцину. Клітини засівали 5 в 24-ямковий планшет з розрахунку 2·10 клітин на ямку. Після інкубації протягом 7-8 год. при 37 °C середовище заміняли новим культуральним середовищем, доповненим 5 мкM бутирату натрію, для індукування експресії CEACAM6. Для контролювання експресії білка CEACAM6 трансфікованими клітинами здійснювали вестерн-блотинг. Після інкубації протягом 20-24 год. при 37 °C клітини інкубували зі зростаючими концентраціями штаму дріжджів ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі протягом 1 год. (дослід 6 попередньої інкубації), потім їх інфікували за допомогою MOI 20 (4·10 бактерій на ямку) для додержання співвідношення бактерії/дріжджі, використаного раніше при проведенні випробувань із клітинами T84. Після інкубації протягом 3 год. при 37 °C прикріплені бактерії підраховували за відсутності або в присутності дріжджів відповідно до описаного далі. В іншому досліді використовували операційний матеріал, одержаний від хворих. Ентероцити, одержані з біопсійних матеріалів тонкого кишечнику 3 хворих, які страждають хворобою Крона, промивали розчином PBS і потім попередньо інкубували в пробірці Еппендорфа місткістю 2 мл в 1 мл середовища DMEM, що містило 20 % ембріональної телячої сироватки, у присутності 0, 1,25, 2,5 або 5 мг/мл штаму дріжджів ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі. Вміст пробірки перемішували обертанням протягом 15 хв. при 37 °C, потім ентероцити інфікували в присутності дріжджів 50 мкл культури в середовищі LB протягом ночі штамом AIEC LF82. Далі здійснювали інкубацію протягом 3 год. при перемішуванні. Ентероцити промивали 2 рази розчином PBS, потім наносили між предметною пластиною й покривним склом і спостерігали за допомогою фазоконтрастної мікроскопії. Підрахунки бактерій, прикріплених до щіткової облямівки ентероцитів, здійснювали за відсутності або в присутності дріжджів. Дослід здійснювали також з мутантом LF82-delta fimh, що не має пілей, для визначення базального 14 UA 100402 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рівня адгезії бактерій AIEC, що не розпізнають пілі типу 1 рецепторами CEACAM6. Випробування на інгібування адгезії були проведені також у присутності антитіла антиCEACAM6. Методика аналізу для визначення залишкової адгезії й залишкової інвазії бактерій на епітеліальних клітинах кишечнику T84 Клітинний шар промивали розчином PBS 4 рази по 1 мл, потім клітини піддавали лізису шляхом інкубації протягом 5 хв. при кімнатній температурі з 500 мкл 1 %-ного розчину Triton X100 у дистильованій воді. Лізати розбавляли й потім наносили на агар Lb-agar для визначення числа КУО, відповідного числу прикріплених бактерій. Для підрахунку інвазивних бактерій клітинний шар промивали розчином PBS через 3 год. після інфікування, потім протягом 1 год. інкубували 1 мл інфікованого середовища, яке містило 100 мкг/мл гентаміцину, для знищення позаклітинних бактерій. Інвазивні бактерії підраховували після лізису клітин, послідовних розведень і нанесення на агар Lb-agar. Рівні адгезії й інвазії штаму AIEC LF82 аналізували в порівнянні із клітинами, які інфіковані штамом AIEC LF82 й не піддавалися якій-небудь обробці дріжджами або похідними дріжджів. Усі результати виражені відповідно до співвідношення R: R = число прикріплених або інвазивних бактерій у присутності дріжджів ScРro1/число прикріплених або інвазивних бактерій за відсутності обробки. Методика 1. Модель спільної інкубації Клітини T84 і суспензію бактерій одержували відповідно до методики, описаної раніше у випробуванні на адгезію й інвазію. Дріжджі або похідні дріжджів суспендували в PBS з визначеною концентрацією й 25 мкл такої суспензії додавали до інфікованого середовища клітин T84 (1 мл). Потім клітини відразу інфікували бактеріальним штамом MOI 10. Суміш "суспензія бактерій/дріжджі, інкубовані в присутності клітин, " гомогенізували, а потім 24ямковий планшет інкубували протягом 3 год. при 37 °C. Рівні адгезії й інвазії бактеріального штаму визначали відповідно до описаного раніше й при цьому за відсутності й у присутності дріжджів або екстрактів дріжджів при інфікуванні. Співвідношення між рівнем бактеріальної адгезії або інвазії за відсутності дріжджів (100 %) і рівнем бактеріальної адгезії або інвазії в присутності дріжджів являє собою рівень залишкової адгезії або залишкової інвазії бактерій. Методика 2. Модель попередньої інкубації Клітини T84 і суспензію бактерій одержували відповідно до методики, описаної раніше у випробуванні на адгезію й інвазію. Суспензію дріжджів або похідних дріжджів додавали до інфікованого середовища (1 мл) клітин T84 в об'ємі 25 мкл. Суспензію дріжджів гомогенізували, а потім інкубували протягом 1 год. при 37 °C в 24-ямковому планшеті для культивування клітин. Після даної інкубації клітини T84 інфікували бактеріальним штамом MOI 10 у присутності дріжджів протягом 3 год. при 37 °C. Підрахунок прикріплених і інвазивних бактерій здійснювали відповідно до описаного раніше в присутності або за відсутності дріжджів для визначення процентної частки залишкової адгезії або залишкової інвазії, при цьому 100 % означає адгезію або інвазію за відсутності дріжджів. - Верифікація експресії CEACAM6 Імуноцитохімічне маркування здійснювали для кожної партії культивованих клітин для перевірки наявності й оцінювання кількості експресованого CEACAM6. Клітини культивували на стерильних скляних пластинах. Клітинний шар промивали розчином PBS, потім фіксували 3 %ним параформальдегідом при pH=7,4 протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Клітини інкубували з моноклональним антитілом анти-CEACAM6 (клон 9A7, Genovac), розведеним у співвідношенні 1/100 сумішшю PBS-5 % кінської сироватки, у вологій атмосфері протягом години. Після промивання розчином PBS клітини приводили в контакт із вторинним антитілом, зв'язаним із флуорохромом (анти-мишачий FITC, Zymed) і розведеним у співвідношенні 1/500 сумішшю PBS-5 % кінської сироватки, протягом 1 години у вологій атмосфері. Скляні пластини фіксували на предметному склі Moewiol і потім візуалізували за допомогою флуоресцентного мікроскопа. - Перевірка відсутності клітинної цитотоксичності Відсутність клітинної цитотоксичності, індукованої різними дозами дріжджів, перевіряли кількісним аналізом лактатдегідрогенази (LDH) в інкубаційному середовищі дріжджі/клітини або FDL/клітини (Glasser і співавт., 2001). Результати Випробування на аглютинацію з LF82 Титри аглютинації, одержані з LF82 у присутності дріжджів ScРro1 або SCB1 у культурі (= свіжому вигляді) або в сухому вигляді (висушування до сухої швидкорозчинної або ліофілізованої форми), узагальнені в наведеній далі таблиці, у якій представлені результати від 3 до 5 незалежних дослідів. 15 UA 100402 C2 Дріжджі ScРro1 ScРro1 ScРro1 SCB1 SCB1 SCB1 5 10 20 25 30 35 40 Свіжа культура Суха швидкорозчинна форма Суха ліофілізована форма Свіжа культура Суха швидкорозчинна форма Суха ліофілізована форма Титр аглютинації Мінімальне Максимальне значення титру значення титру 1/3 1/12 1/58 1/20 1/96 1/43 1/28 1/24 1/12 1/64 1/40 1/16 1/12 1/20 1/19 1/16 1/24 Були одержані достовірно гарні результати аглютинації з LF82 у випадку сухих дріжджів ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі й SCB1 у сухій швидкорозчинній формі. Для даних дріжджів була доведена значимість сприятливого впливу способу й, зокрема, способу сушіння на їх потенціал аглютинації. Випробування на аглютинацію з очищеними пілями Титри аглютинації, одержані з очищеними пілями в присутності дріжджів ScРro1 у культурі (= свіжому вигляді) або в сухій швидкорозчинній формі й дріжджів SCB1 (у сухій формі) узагальнені в наведеній далі таблиці. Дріжджі ScРro1 ScРro1 SCB1 15 Форма Середнє значення 1/7 Форма Свіжі пресовані дріжджі Суха швидкорозчинна форма Суха ліофілізована форма Дослід 1 1/300 1/600 1/300 Титр аглютинації Дослід 2 Дослід 3 1/300 1/400 1/600 1/300 1/300 1/200 Дане дослідження підтверджує, що для аглютинації в значній мірі необхідна взаємодія "пілідріжджі". Враховуючи, що пілі необхідні для розпізнавання манозних структур, саме останні розпізнаються у дріжджів і беруть участь у спостережуваному феномені аглютинації. Кращі результати одержані у випадку дріжджів ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі. Результати випробувань по визначенню здатності зв'язування пілей типу 1 з манопротеїновими фракціями дріжджів ScРro1 На фіг. 18 ясно показано, що очищені пілі типу 1, одержані зі штаму AIEC LF82, специфічно фіксуються на манопротеїнах дріжджів. Слід помітити, що спосіб одержання (термічний або ферментативний) таких манопротеїнів (EL05 і EL06) здійснює незначний вплив на константу спорідненості до пілей. Результати по інгібуванню взаємодії бактерій AIEC з рецептором CEACAM6, експресованим на поверхні епітеліальних клітин кишечнику 1/ Розподіл зразків дріжджів або похідних дріжджів по здатності інгібування адгезії й інвазії штаму AIEC LF82 на епітеліальних клітинах кишечнику T84 у моделі спільної інкубації 7 Були досліджені дріжджі ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі (3,09·10 клітин/мг), ScPro1 в 7 7 сухій формі (1,86·10 клітин/мг) і SCB1 в сухій швидкорозчинній формі (5,83·10 клітин/мг), а також манопротеїни дріжджів EL05 (в сухій формі). 7 Як порівняльний зразок додавали дріжджі Ultra-levure® (Biocodex, 2,054·10 клітин/мг). Порівняння інгібувальної здатності дріжджів з однаковою кількістю дріжджів у моделі спільної інкубації Після промивання розчином PBS і центрифугування протягом 15 хв. при 7500 об./хв. зразки 8 дріжджів знову суспендували в PBS з концентрацією 4·10 клітин/мл. Розведення дріжджів в PBS здійснювали зі співвідношенням 1/2, 1/10, 1/20 і 1/100. Було здійснено три незалежні досліди згідно з методикою 1. Результати на фіг. 19A і 19B (залишкова адгезія й залишкова інвазія) представлені у вигляді середніх значень рівнів залишкової адгезії й залишкової інвазії й інтервалів помилки, відповідної стандартній помилці середнього значення. На фіг. 19A і 19B показані наступні одержані результати: адгезія: - дріжджі ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі й ScРro1 у сухій формі сильно інгібують адгезію штаму LF82 на клітинах T84 залежно від дози. Інгібування дріжджами ScРro1 у сухій 16 UA 100402 C2 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 швидкорозчинній формі в кількості 5·10 клітин/мл є більш значним у порівнянні з дріжджами 6 ScPro1 в сухій формі в кількості 5·10 клітин/мл; - дріжджі SCB1 у сухій швидкорозчинній формі інгібують адгезію менш сильно, ніж 2 інших 7 зразки дріжджів: залишкова адгезія при дозі 1·10 клітин/мл складає 45,7 % у порівнянні з 18,7 і 8 % залишкової адгезії для штамів ScPro1 в сухій швидкорозчинній формі і ScPro1 в сухій формі, відповідно; інвазія: - дріжджі ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі значно інгібують інвазію клітин T84 штамом 5 7 AIEC LF82 при дозі 1·10 клітин/мл. При дозі 1·10 клітин/мл рівень залишкової інвазії складає 16,3 %; - для дріжджів ScРro1 у сухій формі й SCB1 у сухій швидкорозчинній формі інгібувальна дія 6 6 є більш повільною при дозі 1·10 і 5·10 клітин/мл, відповідно. Випробування на інгібування манопротеїнами EL05 у моделі спільної інкубації Манопротеїни дріжджів EL05 суспендували в PBS з концентрацією 160 мг/мл. Здійснювали послідовні розведення в PBS зі співвідношенням 1/2, 1/4, 1/8 і 1/40 і додавали 25 мкл кожної суспензії манопротеїнів до інфікованого середовища згідно з методикою 1. Було здійснено три незалежні досліди. Результати, показані на фіг. 20A і 20B (залишкова адгезія й залишкова інвазія), представлені у вигляді середніх значень рівнів залишкової адгезії й інтервалів помилки, відповідної стандартній помилці середнього значення. На даних фігурах показано, що манопротеїни дріжджів EL05 мають здатність інгібування адгезії й інвазії штаму AIEC LF82 на клітинах T84 залежно від дози в моделі спільної інкубації. 2/ Розподіл зразків дріжджів або похідних дріжджів по здатності інгібування адгезії й інвазії штаму AIEC LF82 на епітеліальних клітинах кишечнику T84 у моделі попередньої інкубації У моделі попередньої інкубації були використані такі ж зразки дріжджів і фракцій, що й у моделі спільної інкубації. Порівняння інгібувальної здатності дріжджів з однаковою кількістю дріжджів у моделі попередньої інкубації Після промивання розчином PBS і центрифугування протягом 15 хв. при 7500 об./хв. зразки 8 дріжджів знову суспендували в PBS з концентрацією 4·10 клітин/мл. Розведення дріжджів в PBS здійснювали зі співвідношенням 1/2, 1/10, 1/20 і 1/100. Було здійснено три незалежних досліди відповідно до методики 2. Результати, показані на фіг. 21A і 21B (залишкова адгезія й залишкова інвазія), представлені у вигляді середніх значень рівнів залишкової адгезії й залишкової інвазії й інтервалів помилки, відповідної стандартній помилці середнього значення. Попередня обробка клітин T84 дріжджами забезпечує значне інгібування адгезії штаму LF82 6 при дозі 5·10 клітин/мл штаму ScPro1 в сухій швидкорозчинній формі і ScPro1 в сухій формі. Проте, у випадку дріжджів SCB1 в сухій швидкорозчинній формі з такою дозою будь-якого значного інгібування не було помічено. Попередня обробка клітин T84 дріжджами забезпечує інгібування інвазії штаму LF82 при 5 дозі 1·10 клітин/мл штаму дріжджів ScPro1 в сухій формі. 5 При дозі 5·10 клітин/мл 3 зразки дріжджів індукують значне зменшення інвазії штаму LF82. Випробування на інгібування манопротеїнами EL05 у моделі попередньої інкубації Манопротеїни дріжджів EL05 суспендували в PBS з концентрацією 160 мг/мл. Здійснювали послідовні розведення в PBS зі співвідношенням 1/2, 1/4, 1/8 і 1/40 і додавали 25 мкл кожної суспензії манопротеїнів до інфікованого середовища згідно з методикою 2. Було здійснено три незалежні досліди. Результати, показані на фіг. 22A і 22B (залишкова адгезія й залишкова інвазія), представлені у вигляді середніх значень рівнів залишкової адгезії й інтервалів помилки, відповідної стандартній помилці середнього значення. Таким чином, манопротеїни EL05 дозволяють інгібувати залежно від дози адгезію й інвазію штаму LF82 при концентрації 2 мг/мл. Результати випробувань на інгібування дріжджами адгезії штаму AIEC LF82 у випадку CHOK1, експресуючих або не експресуючих рецептор CEACAM6, у моделі попередньої інкубації Було здійснено п'ять незалежних дослідів відповідно до згаданої раніше методики 2. На фіг. 23 показано, що спостерігається значне інгібування адгезії штаму AIEC LF82 на клітинах CHO/CEACAM6 при попередній інкубації з 25 мкг/мл дріжджів. У випадку таких клітин помічена інгібувальна дія залежно від дози. Адгезія штаму AIEC LF82 також спостерігається на клітинах CHO-K1, що безсумнівно обумовлено експресією манозовмісних білків, експресованих на поверхні таких клітин. Однак, попередня інкубація штаму LF82 із дріжджами ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі не забезпечує інгібування в значній мірі адгезії на нетрансфікованих клітинах. 17 UA 100402 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Таким чином, дана обставина свідчить, що дріжджі впливають на адгезію штаму LF82 з рецепторами CEACAM6, експресованими клітинами. Результати інгібування адгезії штаму AIEC LF82 на рівні щіткової облямівки ентероцитів хворих, які страждають хворобою Крона, у моделі попередньої інкубації На фіг. 24 показані середні індекси адгезії, одержані в ході експерименту й розраховані в присутності або за відсутності зростаючих концентрацій дріжджів ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі (мг/мл) або в присутності антитіла анти-CEACAM6. За результатами, представленим на даній фігурі, можна констатувати залежне від дози значне зменшення адгезії штаму AIEC LF82 до щіткової облямівки ентероцитів хворих у випадку присутності штаму дріжджів ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі. При дозі дріжджів 5 мг/мл залишкова адгезія штаму AIEC LF82 подібна адгезії, спостережуваній в присутності антитіла анти-CEACAM6, або адгезії, спостережуваній у випадку мутанта, позбавленого пілей типу 1. Висновки З даного дослідження випливає, що: - дріжджі ScРro1 і SCB1, зокрема, у сухій швидкорозчинній формі проявляють більшу здатність аглютинації штаму LF82; - дріжджі ScРro1 і SCB1 здатні інгібувати in vitro адгезію й інвазію епітеліальних клітин людини (T84, ентероцити з біопсійних матеріалів тонкого кишечнику) і клітин CHO, експресуючих рецептор CEACAM6 людини, у випадку бактерій E. coli залежно від дози; - манопротеїни здатні інгібувати in vitro адгезію й інвазію епітеліальних клітин людини (T84, ентероцити з біопсійних матеріалів тонкого кишечнику) і клітин CHO, експресуючих рецептор CEACAM6 людини, у випадку бактерій E. coli залежно від дози; - in vitro дріжджі ScРro1 здатні в більших концентраціях частково захищати приблизно 80 % клітин, інфікованих бактеріями. Приклад 7. Дослідження регуляторної ролі дріжджів ScРro1, SCB1 і похідних дріжджів в експресії генів, кодуючих IL-10 і PPARα, в епітеліальних клітинах кишечнику людини, культивованих in vitro Був досліджений пробіотичний характер дріжджів ScРro1 і SCB1, що вводяться окремо або в комбінації, і/або фракцій дріжджів і їх здатність інгібувати виникнення запалення за рахунок взаємодії з деякими кишковими рецепторами. Дослідження in vitro Зокрема, була досліджена дія дріжджів і похідних дріжджів за даним винаходом на різні рецептори епітеліальних клітинах кишечнику шляхом аналізу in vitro двох ліній клітин раку товстої кишки Caco-2 (ATCC HTB-37) і HT-29 (ATCC HTB-38). З цією метою здійснювали транскрипційний аналіз шляхом екстракції РНК за наведеною далі методикою. Клітини піддавали лізису в тризолі. Потім з розчинною фракцією здійснювали стадію з дезоксирибонуклеазою, додаючи 200 мкл розчину, що містив 10 одиниць інгібітору рибонуклеази й 10 одиниць дезоксирибонуклеази. 10 мкг РНК були ретротранскрибовані в присутності 200 одиниць інверсної транскриптази, дитіотреїтолу, оліго-dt15 і дезоксирибонуклеотидів. Ампліфікували кДНК за відомою методикою конкурентної полімеразної ланцюгової реакції (PCR, Polymerase Chain Reaction), використовуючи специфічні смислові й антисмислові затравки, зокрема гени, такі як IL-10 і PPARα. Після 40 циклів ампліфікації, здійснених у присутності 1,25 одиниці Ampli Taq Gold 5000, і розділення різних зразків на 3 %-ному гелі агарози інтенсивність смуг визначали за допомогою дисектора. 5 Результати виражені як число молекул іРНК на 10 молекул β-актину як внутрішній стандарт. Результати, наведені на фіг. 11, являють собою значення експресії іРНК через годину (індекс A) і через 3 години (індекс B) після приведення в контакт дріжджів або їх похідних з епітеліальними клітинами кишечнику, експресуючими ген, кодуючий протизапальний білок IL-10. На фіг. 11 цифрами позначені досліджені дріжджі/похідні дріжджів, які показали рівень швидкої експресії, що перевищує 4-кратний порівняльний сигнал: 3 означає дріжджі Saccharomyces cerevisiae; 5 означає дріжджі ScРro1 за даним винаходом; 6 означає екстракт дріжджів Saccharomyces cerevisiae; 12 означає фракцію РНК дріжджів Saccharomyces cerevisiae. 18 UA 100402 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дані результати добре демонструють, що дріжджі й похідні дріжджів Saccharomyces cerevisiae за даним винаходом індукують швидку експресію, вже через годину, гена, кодуючого протизапальний цитокін IL-10. Дійсно, у порівнянні з необробленим контрольним зразком експресія іРНК у випадку дріжджів і їх похідних за даним винаходом перевищує 4-кратне значення по осі ординат, яке вже відповідає чудовому рівню швидкої експресії. Інші результати представлені на фіг. 13. На даній фігурі показана зміна залежно від кількості внесених похідних дріжджів експресії іРНК гена, кодуючого білок IL-10. Показані на фіг. 13 значення експресії були виміряні через годину (1 год.) і через три години (3 год.). Варіанти експресії у випадку дріжджів і екстрактів дріжджів Saccharomyces cerevisiae за даним винаходом позначені цифрами: 5 означає дріжджі ScРro1 за даним винаходом; 6 означає екстракт дріжджів Saccharomyces cerevisiae; 8 означає парієтальний β-глюкан Saccharomyces cerevisiae; 9 означає парієтальний манопротеїн дріжджів Saccharomyces cerevisiae; 11 означає фракцію ДНК дріжджів Saccharomyces cerevisiae; 12 означає фракцію РНК дріжджів Saccharomyces cerevisiae. Експресію вимірювали при різних концентраціях дріжджів і/або їх похідних. Чим темніше колір стовпця на фіг. 13, тим більше концентрація дріжджів/похідного. Результати, представлені на фіг. 13, показують, що екстракти дріжджів Saccharomyces cerevisiae за даним винаходом індукують швидку експресію іРНК протизапального цитокіну (IL10). Результати, наведені на фіг. 12, являють собою значення експресії іРНК через годину (індекс A) і через 3 години (індекс B) після приведення в контакт дріжджів або їх похідних з епітеліальними клітинами кишечнику, експресуючими ген, кодуючий нуклеарний рецептор PPARα. На фіг. 12 цифрами позначені досліджені дріжджі/похідні дріжджів, які показали рівень повільної експресії, що перевищує 3-кратний порівняльний сигнал: 1 означає дріжджі Saccharomyces cerevisiae ScРro1 за даним винаходом в сухій активній формі; 4 означає дріжджі Saccharomyces cerevisiae; 5 означає дріжджі Saccharomyces cerevisiae ScРro1 за даним винаходом в сухій активній формі; 8 означає фракцію клітинних стінок дріжджів Saccharomyces cerevisiae; 9 означає фракцію парієтальних β-глюканів дріжджів Saccharomyces cerevisiae; 10 означає фракцію парієтальних манопротеїнів дріжджів Saccharomyces cerevisiae; 11 означає фракцію ДНК дріжджів Saccharomyces cerevisiae; 12 означає фракцію РНК дріжджів Saccharomyces cerevisiae. Дані результати добре демонструють, що дріжджі й похідні дріжджів Saccharomyces cerevisiae за даним винаходом індукують повільну експресію, через три години, гена, кодуючого нуклеарний рецептор PPARα. Дійсно, експресія іРНК у випадку дріжджів і їх похідних за даним винаходом перевищує 3кратне значення по осі ординат, яке вже відповідає чудовому рівню повільної експресії. Приклад 8. Дослідження ex vivo регуляторної ролі дріжджів і похідних дріжджів в експресії генів, кодуючих IL-10 і TNF-α, в епітеліальних клітинах кишечнику людини, виділених з біопсійних матеріалів хворих, які страждають хворобою Крона Вплив дріжджів і/або похідних дріжджів на секрецію цитокінів IL-10 (протизапального) і TNFα (прозапального) був досліджений ex vivo на біопсійних матеріалах хворих, які страждають або не страждають хворобою Крона. Біопсійні матеріали кишечнику відбирали у хворих, які страждали або не страждали хворобою Крона, потім поміщали на 24 год. у середовище HBSS-CMF, доповнене пеніциліном і стрептоміцином, при 37 °C в атмосфері, що містила 5 % CO2. Після промивання біопсійні матеріали приводили в контакт із дріжджами або похідними дріжджів протягом 4 годин у середовищі RPMI 1640. Надосадову рідину відділяли для аналізу способом ELISA. Потім біопсійні матеріали піддавали лізису з метою екстракції як іРНК, так і загального білка. Підтвердження секреції цитокінів здійснювали імунологічним аналізом надосадових рідин культур клітин і білкових екстрактів способом ELISA. Білки денатурували протягом 5 хвилин при 95 °C в осаджувальному буферному розчині (об./об.; 75 мм Tris, pH=6,8; 5 % гліцерину; 0,25 % бромфенолового синього; 2 % SDS, 5 % β-меркаптоетанолу), наносили (50 мкг) і розділяли на 10 %-ному гелі поліакриламіду. Після поділу білки переносили на мембрану PVDF (Hybond-P, 19 UA 100402 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Amersham PHarmacia Biotech, Орсе, Франція) способом напівсухого електроперенесення (Hoefer TE77, Amersham PHarmacia Biotech, Орсе, Франція) протягом 1 години при 16 В. PPARα і IL-10 виділяли з використанням поліклональних антисироваток кролика, анти-PPARα людини й анти-IL-10 людини, розведених у співвідношенні 1/500, і кількісно визначали по хемілюмінесценції (E.C.L. Amersham PHarmacia Biotech, Орсе, Франція) на плівці Biomax-mr (Kodak) за допомогою програми Gel Analyst (CLARA VISION, Париж, Франція). На фіг. 16 і 17 показані результати, одержані для IL-10 і TNF-α, відповідно. По осі ординат відкладена кількість цитокінів, виміряна в пг/мл. Кожна точка відповідає результату вимірювання, одержаному з біопсійним матеріалом хворого, який страждає хворобою Крона в стадії загострення (кружок чорного кольору), хворого, який страждає хворобою Крона в стадії ремісії (кружок сірого кольору), і здорових людей (кружок білого кольору). Прямокутник відповідає середньому значенню вимірювань. На даних фігурах: 1 означає дріжджі Saccharomyces cerevisiae ScРro1 за даним винаходом в сухій активній формі; 3 означає дріжджі Saccharomyces cerevisiae; 8 означає фракцію клітинних стінок дріжджів Saccharomyces cerevisiae; 11 означає фракцію ДНК дріжджів Saccharomyces cerevisiae; 12 означає фракцію РНК дріжджів Saccharomyces cerevisiae. На фіг. 16 показано, що дріжджі ScРro1 за даним винаходом збільшують в 2 рази секрецію протизапального цитокіну IL-10 епітеліальними клітинами хворих, які страждають хворобою Крона або знаходяться у стадії ремісії, у порівнянні зі здоровими людьми й негативною контрольною пробою (-), відповідною вимірюванням, виконаним у присутності тільки фізіологічного розчину. На фіг. 17 показано, що дріжджі ScРro1 за даним винаходом не викликають збільшення секреції прозапального цитокіну TNF-α кишковими клітинами, виділеними з біопсійних матеріалів хворих, які страждають хворобою Крона або знаходяться у стадії ремісії. Ні дріжджі ScРro1, ні які-небудь інші досліджувані дріжджі або похідні дріжджів не індукують яку-небудь секрецію TNF-α. Приклад 9. Дослідження анальгетичних властивостей дріжджів і похідних дріжджів у моделі зі щурами при колоректальному розширенні Дослід зі здоровими щурами 1/ Матеріали й методи У даному дослідженні були використані щури-самці лінії Sprague Dawley (Charles River, Арбресль, Франція) з масою тіла в інтервалі від 175 до 200 г. Щури проходили акліматизацію в умовах розплідника протягом тижня перед експериментом. Тварин утримували по п'ять особин у клітці з вільним доступом до води і їжі. Усі дослідження проводили згідно з рекомендаціями Committee for Research and Ethical Issues, що входить в International Association for the Study of Pain [6]. Для запобігання або мінімізації дискомфорту тварин були вжиті заходи обережності. 2/ Оцінювання чутливості товстої кишки Больову рецепцію тварин оцінювали, вимірюючи тиск усередині товстої кишки, необхідний для викликання поведінкової відповіді. Такий тиск створювали колоректальним розширенням за допомогою роздування балона, введеного в товсту кишку. Поведінкова відповідь характеризується підняттям задньої частини тіла тварини і ясно спостережуваним абдомінальним скороченням, відповідним сильним скороченням [7-9]. Щурів анестезували летким знеболювальним засобом (2 %-ний ізофлюран) і інтраректально вводили балон (методика згідно з процедурою, описаною Bourdu [8]) якомога менш травматично на глибину 7 см від ануса. Катетер прикріплювали до основи хвоста липкою стрічкою. Через 5 хвилин щурів поміщали в середині коробки із плексигласу, і катетер приєднували до електронного баростата (Distender Series IIRTM, G&J Electronics). Тиск підвищували безупинно до відключення по больовому рефлексу або до досягнення граничного значення тиску, що дорівнює 80 мм рт. ст. 3/ Сполуки, що вводяться Дріжджі вводили через шлунковий зонд один раз на день протягом 15 днів. Для позитивного контролю за 30 хв. до колоректального розширення внутрішньоочеревинно вводили морфій з дозою 1 мг/кг. У дослідженні використовували 8 груп щурів: - 10 контрольних щурів, що одержували PBS; - 10 щурів, що одержували ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі (100 мкг/день) (група 1); - 10 щурів, що одержували ScРro1 у сухій формі (100 мкг/день) (група 2); - 10 щурів, що одержували штам SCB1 (100 мкг/день) (група 3); 20 UA 100402 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - 10 щурів, що одержували штами ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі (50 мкг/день) + SCB1 у сухій швидкорозчинній формі (50 мкг/день) (група 4); - 10 щурів, що одержували 1 ін'єкцію морфію (1 мг/кг, за 30 хв. до розширення) (група 5). 4/ Результати На фіг. 26 показано, що дріжджі ScРro1, з одного боку, введені в сухій швидкорозчинній формі окремо (група 1) або в комбінації зі штамом SCB1 (група 4), а з іншого боку, введені в сухій активній формі (група 2), збільшують поріг сприйняття болю, значно зменшуючи, таким чином, сприйняття вісцерального болю в порівнянні зі щурами, яким нічого не вводили. Наведені далі результати надані в мм рт. ст. у порівнянні з контрольною групою: - 74,5±3,07 проти 53,6±3,9, p=0,07 для штаму ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі (група 1); - 66,5±3,36 проти 53,6±3,9, p=0,04 для комбінації штамів ScРro1 і SCB1 у сухій швидкорозчинній формі (група 4); - 72±2,59 проти 53,6±3,9, p < 0,01 для штаму ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі (група 2). З іншого боку, такий ефект порівнянний з ефектом, що викликається у групі 5 морфієм, використаним з дозою 1 мг/кг, з больовим порогом 72±2,59 мм рт. ст. Штам SCB1 у сухій швидкорозчинній формі також індукує анальгетичний ефект у здорових щурів - 70±3,16 мм рт. ст., p=0,026. Дослід з щурами з підвищеною вісцеральною чутливістю 1/ Матеріали й методи Були використані щури-самки лінії Sprague Dawley (Charles River, Арбресль, Франція) з масою тіла в інтервалі від 175 до 200 г. Щури проходили акліматизацію в умовах лабораторії протягом тижня перед експериментом. Тварин поміщали по п'ять особин у клітці з вільним доступом до води і їжі. Усі дослідження проводили згідно з рекомендаціями Committee for Research and Ethical Issues, що входить в International Association for the Study of Pain [6]. Були вжиті суттєві заходи обережності відносно умов життя для запобігання або мінімізації дискомфорту тварин. 2/ Індукування підвищеної чутливості товстої кишки промиванням бутиратом Для кожного промивання катетер (катетер Фогарті діаметром 2 мм) вводили в товсту кишку на глибину 7 см від ануса й вводили тваринам по 2 рази щодня протягом 3 днів по 1 мл розчину 200 мм бутирату натрію з нейтральним значенням pH (pH=6,9). Здоровим тваринам вводили сольовий розчин. 3/ Обробка тварин дріжджами за даним винаходом Було використано 10 груп тварин, що мали підвищену вісцеральну чутливість (n=10 особин у групі). Піддослідним тваринам вводили через шлунковий зонд по 100 мкг дріжджів один раз на день протягом 15 днів. Контрольним тваринам вводили PBS відповідно до тієї ж методики, що й раніше. Дріжджі суспендували в розчині PBS. Інстиляції бутирату або сольових розчинів починали через 7 днів після першого введення через шлунковий зонд протягом 3 днів. Підвищену чутливість товстої кишки вимірювали через 14 днів після початку обробки пероральним шляхом або через 7 днів після інстиляцій у товсту кишку. 4/ Групи піддослідних тварин У дослідженні використовували сім груп щурів. Номера груп відповідають фіг. 26: - 10 щурів, що одержували PBS (контрольна група); - 10 щурів, що одержували сухі дріжджі ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі (100 мкг/день) (група 1); - 10 щурів, що одержували сухі дріжджі ScРro1 у сухій активній формі (100 мкг/день) (група 2); - 10 щурів, що одержували дріжджі SCB1 у сухій швидкорозчинній формі (100 мкг/день) (група 3); - 10 щурів, що одержували ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі (50 мкг/день) і SCB1 у сухій швидкорозчинній формі (50 мкг/день) (група 4); - 10 щурів, що одержували морфій (група 5); - 10 щурів, що одержували фібрати (група 6). 5/ Результати Насамперед можна відзначити, що у контрольних щурів больовий поріг у дослідах з щурами з підвищеною чутливістю менше больового порога у здорових щурів. Дріжджі ScРro1 у сухій швидкорозчинній формі, що вводяться окремо або в комбінації із дріжджами SCB1, виявляють у даній моделі перспективну анальгетичну дію. Одержані наступні результати: 21 UA 100402 C2 Групи 1 4 5 мм рт. ст. 56,5 +/- 4,27; p=0,03 59 +/- 4,33; p=0,02. Дріжджі за даним винаходом дозволяють відновлювати рівень сприйняття болю, порівнянний з рівнем, спостережуваним у здорових щурів. Анальгетичний ефект, індукований дріжджами, еквівалентний ефекту, що викликається морфієм. На фіг. 26 також показаний значний анальгетичний ефект фенофібрату, який збільшує в 2 рази поріг сприйняття болю у щурів з вісцеральною підвищеною чутливістю (70 +/- 4,48, p=0,001). Даний результат підтверджує роль рецептора PPAR у модулюванні вісцерального болю. 10 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 15 20 25 30 35 40 45 50 55 1. Штам Saccharomyces cerevisiae, депонований у Національній колекції культур мікроорганізмів під номером CNCM І-3856. 2. Штам Saccharomyces cerevisiae var. boulardii, депонований у Національній колекції культур мікроорганізмів під номером CNCM I-3799. 3. Дріжджі Saccharomyces cerevisiae штаму за п. 1. 4. Дріжджі Saccharomyces cerevisiae var. boulardii штаму за п. 2. 5. Композиція, яка містить дріжджі Saccharomyces cerevisiae штаму, депонованого у Національній колекції культур мікроорганізмів під номером CNCM І-3856, і/або дріжджі Saccharomyces cerevisiae var. boulardii штаму, депонованого у Національній колекції культур мікроорганізмів під номером CNCM I-3799 і/або щонайменше одне їх похідне, вибране з екстрактів дріжджів, похідних продуктів клітинних стінок, парієтальних глюканів, парієтальних манопротеїнів, ліпідних фракцій дріжджів, фракцій нуклеїнових кислот дріжджів (РНК, ДНК). 6. Композиція за п. 5, яка відрізняється тим, що дріжджі знаходяться у сухому або свіжому вигляді. 7. Композиція за п. 6, яка відрізняється тим, що дріжджі знаходяться у сухій швидкорозчинній формі або в сухій активній формі. 7 10 8. Композиція за будь-яким з пп. 5-7, яка відрізняється тим, що вона містить від 10 до 6·10 8 10 КУО і переважно від 10 до 2·10 КУО вказаних дріжджів. 9. Композиція за будь-яким з пп. 5-7, яка відрізняється тим, що вона містить від 1 мг до 10 г і переважно від 1 мг до 1 г вказаних дріжджів. 10. Застосування композиції за будь-яким з пп. 5-9 як харчової добавки і/або пробіотика, і/або продукту для лікувально-профілактичного харчування, і/або біологічно активної добавки, і/або функціональних інгредієнтів, і/або лікувально-косметичного засобу, і/або фармацевтично активної речовини, призначених для людини і/або тварини. 11. Застосування композиції за будь-яким з пп. 5-9 для одержання харчових композицій, призначених для поліпшення комфортного стану шлунково-кишкового тракту і/або поліпшення кишкової мікрофлори. 12. Застосування композиції за будь-яким з пп. 5-9 для одержання лікарського засобу, призначеного для лікування і/або профілактики розладів кишечнику, функціональних порушень кишечнику або захворювань шлунково-кишкового тракту. 13. Застосування композиції за будь-яким з пп. 5-9 для одержання лікарського засобу, призначеного для лікування і/або для профілактики патологій, або розладів кишечнику, які супроводжуються станом гіпералгезії. 14. Застосування за будь-яким з пп. 10-13, при якому дріжджі знаходяться у сухому або свіжому вигляді. 15. Застосування за п. 14, при якому дріжджі знаходяться у сухій швидкорозчинній формі або в сухій активній формі. 7 16. Застосування за будь-яким з пп. 10-13 дріжджів з добовою дозою в інтервалі від 10 до 10 8 10 6·10 КУО і переважно в інтервалі від 10 до 2·10 КУО. 17. Застосування за будь-яким з пп. 10-13 дріжджів і/або похідних дріжджів з добовою дозою в інтервалі від 1 мг до 10 г і переважно в інтервалі від 1 мг до 1 г. 18. Набір, який містить дріжджі Saccharomyces cerevisiae штаму, депонованого у Національній колекції культур мікроорганізмів під номером CNCM І-3856, і/або дріжджі Saccharomyces cerevisiae var. boulardii штаму, депонованого у Національній колекції культур мікроорганізмів під 22 UA 100402 C2 номером CNCM I-3799, і/або щонайменше одне їх похідне, вибране з екстрактів дріжджів, похідних продуктів клітинних стінок, парієтальних глюканів, парієтальних манопротеїнів, ліпідних фракцій дріжджів, фракцій нуклеїнових кислот дріжджів (РНК, ДНК), у формі, прийнятній для перорального введення. 23 UA 100402 C2 24 UA 100402 C2 25 UA 100402 C2 26 UA 100402 C2 27 UA 100402 C2 28