Спосіб одержання бактеріального препарату “лст” для посолу м’ясної сировини

Реферат: Винахід належить до біотехнології, стосується способу одержання бактеріального препарату для посолу м'ясної сировини, який включає сумісне культивування молочнокислих бактерій видів Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei ssp. paracasei та Lactobacillus plantarum і стафілококу виду Staphylococcus carnosus при співвідношенні культур 1:0,5:0,5:1 у поживному середовищі на основі води з пептоном протягом 14-15 годин при періодичній аерації при температурі 32 ± 2 ºC при постійному рН 6,4-6,6, відокремлювання біомаси, змішування з захисним середовищем, заморожування, сушіння суспензії клітин та подрібнення препарату. UA 114255 C2 (12) UA 114255 C2 UA 114255 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнології, а саме до способів одержання бактеріальних препаратів для посолу м'ясної сировини. Відомим є спосіб отримання бактеріального препарату для приготування м'ясних продуктів (патент России № 22754231, опубл. 27.04.2006), який передбачає глибинне культивування штаму Paracoccus denitrificans K-3 за умов аерації у поживному середовищі, яке містить органічний джерело амінного азоту, джерело азоту на основі дріжджів, глюкозу, магній сірчанокислий, марганець сірчанокислий і воду. До складу поживного середовища додатково вводять натрій хлористий, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений і калій нітрит, лужний гідролізат крові великої рогатої худоби, компонент, що знижує окислювально-відновної потенціал. Джерело амінного азоту - панкреатичний гідролізат казеїну - використовують з вмістом амінного азоту 600 мг% або панкреатичний гідролізат знежиреного молока з вмістом амінного азоту 600 мг%, джерело азоту на основі дріжджів автолізат пекарських дріжджів за певного співвідношення компонентів. Спосіб дозволяє отримати бактеріальний препарат, який 8-9 міс. зберігає денітрифікуючу активність. Недоліком цього способу є трудомісткість приготування посівного матеріалу та довготривале нагромадження біомаси штаму - (36-48) год. Залучення до складу бактеріального препарату лише одного штаму мікроорганізмів, який володіє нітритредукувальною активністю та отримують м'ясний продукт з невисоким рівнем органолептичних та фізіолого-біохімічних показників. Відомо спосіб приготування сухого бактеріального препарату ПБ-МП для виробництва сирокопчених та сиров'ялених ковбас, до складу якого входять два штами лактобактерій: Lactobacillus plantarum (ГНЦА № 2164), Lactobacillus casei (ГНЦА № 2163) та денітрифікуючого мікрокока Micrococcus varians (ГНЦА № 2165) (Патент России № 2083665, опубл. 10.07.1997). Недоліком цього способу є те що вказаний бактеріальний препарат використовується лише для виробництва сирокопчених та сиров'ялених ковбас. Найбільш близьким технічним рішенням, яке вибрано як прототип є склад суміші мікроорганізмів для виробництва сирокопчених та сиров'ялених м'ясних продуктів (патент України № 102931, опубл. 27.08.2013) з наступним співвідношенням культур, мас. %: (50-55): (30-25): (10-7): (5-8): (2,5-3,5): (2,5-1,5) Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Micrococcus varians, Pediococcus cerevisiae, Propioni bacterium shermanii, Bifidobacterium longum. Недоліком прототипу є застосування даної композиції для виготовлення лише сирокопчених та сиров'ялених м'ясних продуктів. Для створення вказаної суміші не проведено відбір штамів, які спроможні функціонувати у м'ясній сировині, та не вказані за рахунок чого відбувається збереження співвідношення між штамами композиції. Для посолу м'ясної сировини використовуються культури які проявляють свої технологічні властивості за відносно низької температури посолу - (2-6)°С. В основу винаходу поставлена задача розробки способу одержання бактеріального препарату "ЛСт" посиленої біологічної активності прямого внесення, що забезпечить контрольований посол м'ясних продуктів, скорочення їх терміну виготовлення та подовження терміну зберігання. В способі, що заявляється, пропонується використання мікроорганізмів видів Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei ssp. paracasei, Staphylococcus carnosus у такому співвідношенні 1:0,5:0,5:1 відповідно. Скорочені назви мікроорганізмів: Lactobacillus plantarum-L. plantarum, Lactobacillus rhamnosus-L. rhamnosus, Lactobacillus paracasei ssp. paracasei-L. paracasei, Staphylococcus carnosus-S. carnosus. Напівсинтетичне поживне середовище на основі пептону з додаванням мінеральних компонентів та стимуляторів росту створювали з врахуванням потреб кожного складника бактеріального препарату. Ці прийоми дозволяють підвищити чисельність життєздатних клітин молочнокислих бактерій та стафілококу, біологічну активність бактеріального препарату, завдяки чому прискорюється процес дозрівання м'ясної сировини і підвищується санітарний стан готового продукту. Поставленазадача вирішується тим, що в способі одержання бактеріального препарату "ЛСт" для посолу м'ясної сировини передбачають такі стадії виробництва: приготування поживного середовища, поживне середовище готують шляхом розчинення у воді пептону, вуглеводів, дріжджового екстракту, солей органічних та неорганічних кислот, а як посівний матеріал використовують культури молочнокислих бактерій та стафілококу, окреме культивування молочнокислих бактерій і стафілококу, змішування їх та сумісне культивування, відокремлення біомаси, змішування з захисним середовищем, заморожування та сушіння суспензії, подрібнення бактеріального препарату, фасування, відповідно до винаходу, проводять окреме культивування молочнокислих бактерій видів L. plantarum, L. rhamnosus та L. paracasei на середовищі МРС за температури 32±2 °C в статичних умовах протягом 18-20 год., 1 UA 114255 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 культивують стафілокок виду S.carnosus на МП А за температури 32±2 °C в аеробних умовах протягом 46-48 год., а нагромадження біомаси у поживному середовищі на основі води з пептоном та стимуляторами росту проводять протягом 14-15 годин при періодичній аерації за температури 32±2 °C, через 7-8 годин додають 1,0 % глюкози, при постійному рН 6,4-6,6. Як вуглеводи використовують глюкозу та лактозу, як солі органічних кислот ацетат натрію і цитрат натрію, солі неорганічних кислот - сульфат магнію, сульфат марганцю та хлорид натрію. Особливістю запропонованого способу є використання спеціально підібраної заквашувальної композиції, до складу якої залучені молочнокислі бактерії L. plantarum, L. rhamnosus L. paracasei, та штам стафілококу виду S. carnosus при співвідношенні культур 1:0,5:0,5:1, відповідно. Всі штами молочнокислих бактерій та стафілококу є власними штамами ІПР НААН і задепоновані в Депозитарії Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України. Вони відбиралися на основі ретельних лабораторних досліджень з врахуванням вимог, що висуваються до штамів, які функціонують у м'ясній сировині, за наступними критеріями: солестійкість, висока антагоністична, протеолітична, нітритредукуюча, каталазна, ароматоутворююча активності, резистентність до жовчі, фенолу. Всі використані культури мікроорганізмів, які входять до складу бактеріального препарату "ЛСт" є непатогенними і спроможні функціонувати за умов посолу м'ясної сировини. Підбір складу інгредієнтів до поживного середовища на немолочній основі - пептон, солі органічних та неорганічних кислот, а також окремих стерильних розчині в вуглеводів і стимуляторів росту - дріжджовий екстракт, разом з використанням штамів L. plantarum, L. rhamnosus, L. paracasei, S. carnosus забезпечує одержання бактеріального препарату прямого внесення з високою концентрацією живих клітин молочнокислих бактерій та стафілококу. Спосіб одержання бактеріального препарату "ЛСт" для посолу м'ясної сировини виконують таким чином. Поживне середовище для нагромадження біомаси складають з основи, яка включає пептон, кукурудзяний екстракт, солі органічних і мінеральних кислот, та окремо стерилізованих розчинів глюкози, аскорбінової кислоти, дріжджового екстракту. Після підготування основи поживного середовища встановлюють рН 7,5±0,05 шляхом додавання 40 %-ного розчину гідроксиду натрію, стерилізують за температури 121±1 °C протягом 30 хв і охолоджують до температури 50±1 °C. Окремо готують і вносять розчини аскорбінової кислоти, глюкози. Стерильний розчин глюкози вносять у два етапи: на 1 годину культивування в кількості 0,5 % та на 7-8 годину росту при сумісному культивуванні в кількості 0,5 % від об'єму поживного середовища у ферментері. Інокуляти кожного із штамів L. plantarum, L. rhamnosus та L. paracasei, готують окремо шляхом внесення добових бульйонних культур в кількості 5 % до об'єму поживного середовища МРС і подальшого вирощування за температури 32±2 °C протягом 18-20 год. Інокулят S. carnosus готують шляхом вирощування в аеробних умовах за температури 32±2 °C протягом 2 3 46-48 год. на поверхні м'ясо-пептонного агару площиною близько 800 см змивають в 1 дм м'ясо-пептонного бульйону. В підготовлене поживне середовище у ферментер вносять інокулят суміші молочнокислих бактерій видів штамів L. plantarum, L. rhamnosus та L. paracasei у кількості 4 об. % та S. carnosus-2 об. % і що дає співвідношення між ними 1:0,5:0,5:1, і проводять процес нагромадження біомаси. Нагромадження бактеріальної маси бактеріального препарату "ЛСт" проводять за температури 32±2 °C протягом 14-15 год. з періодичною або безперервною нейтралізацією культурального середовища 25 %-ним водним розчином аміаку до активної кислотності 6,4-6,6 од. рН з періодичною аерацією. У разі періодичної нейтралізації першу нейтралізацію здійснюють через 3 години, потім через кожні 2 години. Після закінчення процесу нагромадження біомаси культуральну рідину охолоджують до температури (12±2)°С. Відокремлення біомаси від культурального середовища проводять на суперцентрифугах за температури (12±2)°С, після чого змішують у співвідношенні 1:2 зі стерильним захисним середовищем, яке містить 15 % сахарози, 5 % лимоннокислого натрію, 5 % сухого знежиреного молока. Одержану таким чином суспензію клітин, що утворилась розливають у стерильні кювети шаром не більше (6±1) см, заморожують при мінус 40±2 °C протягом 16-18 годин і висушують в сублімаційній сушарці за таких режимів: температура на початку сушіння - мінус 25±2 °C, в кінці - плюс 30±2 °C. Тривалість сушіння - 18-20 годин. Висушену суспензію подрібнюють в дрібнодисперсний порошок. 2 UA 114255 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Застосування цих технологічних прийомів дозволяє за 14-15 годин культивування одержати 3 10 з 1 дм середовища 7,5 г сухого препарату, 1 г якого містить 2,0-3,010 життєздатних клітин 9 молочнокислих бактерій та 1,0-10 клітин стафілококу. Препарат не потребує активізації. Приклад 1. Спосіб одержання бактеріального препарату "ЛСт" для посолу м'ясної сировини. Готували поживне середовище: в 70 л водопровідної води розчиняли 700 г пептону, 500 г лимоннокислого натрію, 300 г оцтовокислого натрію, 30 г MgSO4, 12 г MnSO4,7 г Fe2(SO4)3, 200 г 3 лактози, 350 г дріжджового екстракту, 1400 см екстракту кукурудзяного, розведеного водою у співвідношенні 1:1, 350 г хлористого натрію. Встановлювали рН 7,4±0,1 шляхом додавання 40 %-ного розчину гідроксиду натрію, стерилізували за 121±1 °C протягом 30±0,1 хв і охолоджували до температури 55±1 °C. Окремо готували і вносили до основи стерильні розчини: 700 г та 700 г глюкози, розчиненої 3 3 в 2 дм дистильованої води, у двох ємкостях; 15 г аскорбінової кислоти, розчиненої в 200 см дистильованої води. Після внесення всіх компонентів та стерилізації середовища активна кислотність повинна 3 бути 6,8±0,1 од. рН. В підготовлене середовище вносили 2 дм м'ясо-пептонного бульйону з 3 інокулятом S. carnosus та по 1 дм завчасно приготовленого інокуляту L. rhamnosus та L. 3 8 3 paracasei та 2 дм L. plantarum з концентрацією клітин кожного не менше 10 КУО/см разом зі 3 стерильним розчином глюкози 350 г в 2 дм дистильованої води. Нагромадження бактеріальної маси вели при сумісному культивуванні за 32±2 °C протягом 14-15 годин. Через 7-8 годин 3 культивування ще додавали стерильний розчин глюкози - 350 г в 2 дм дистильованої води, і продовжували культивування 6-7 год. з періодичною нейтралізацією середовища 25 %-ним водним розчином аміаку до активної кислотності рН 6,4-6,6 і частковою нейтралізацією. Потім культуральну рідину охолоджували і центрифугували на суперцентрифузі при 15000 об/хв. Одержану біомасу змішували у співвідношенні 1:2 із стерильним захисним середовищем, 1 л якого готували з окремих стерильних розчинів із розрахунку: 150 г цукрози, розчиненої в 300 мл дистильованої води і стерилізованої за 105±1 °C протягом 15±0,1 хвилин; 50 г лимоннокислого натрію - у 200 мл дистильованої води та 50 г сухого знежиреного молока - у 3 500 см водопровідної води, стерилізованих за 121±1 °C протягом 30±0,1 хвилин. Суспензію клітин розливали у стерильні кювети шаром не більше 6 мм, заморожували мінус 40±1 °C протягом 16±1 годин і висушували сублімаційній сушарці КС-30 за температури від - 25 °C до +30 °C та масовою часткою вологи в сухому препараті не більше 5 %; тривалість сушіння - 18±1 годин. Висушений бактеріальний препарат в асептичних умовах подрібнювали у дрібнодисперсний порошок в кульовому млині протягом 20±0,1 хв. Вивантажували препарат в боксі в поліетиленові пакети та запаювали. 10 Одержаний бактеріальний препарат містить 2,0-3,010 КУО молочнокислих бактерій, та 9 3 1,010 КУО стафілококу, з 1 дм середовища 7,5 г сухого препарату. Приклад 2. Спосіб одержання бактеріального препарату "ЛСт" для посолу м'ясної сировини. Технологічні операції приготування поживного середовища для нарощування бактеріальної маси, підготовки інокуляту, відокремлення біомаси від культуральної рідини, змішування її з захисним середовищем, висушування та подрібнення препарату ведуть аналогічно за прикладом 1, а процес культивування молочнокислих бактерій та стафілококу проходив по стадійно: у ферментер спочатку вносили інокулят S. carnosus у кількості 2 об. % і нарощували протягом 3 годин при постійній аерації, потім додавали 4 об. % суміші молочнокислих бактерій 3 видів інокуляту L. rhamnosus та L. paracasei та 2 дм L. plantarum що дає співвідношення між ними 1:0,5:0,5:1, і продовжували процес нагромадження біомаси за температури 32±2 °C протягом 12-13 год. Його вели з періодичною аерацією та контролем активної кислотності до рН 6,4-6,6. 9 9 Одержаний бактеріальний препарат містить 7,810 КУО молочнокислих бактерій, та 2,110 3 КУО стафілококу, з 1 дм середовища 5,7 г сухого препарату. Приклад 3. Спосіб використання бактеріального препарату "ЛСт" для посолу м'ясної сировини Одна порція препарату "ЛСт", одержаного за прикладами 1, складає 50 г на 100 кг сировини. Сухий бактеріальний препарат розчиняють у стерильній або кип'яченій воді, охолодженій до температури (30-35)°С у співвідношенні 1:5. Препарат "ЛСт" вносять разом з посолочними інгредієнтами. Показники якості м'ясної сировини через 72 годин посолу, наведено у табл. 1 Характеристика м'ясної сировини до та після посолу. Бактеріальний препарат "ЛСт", одержаний способом за прикладом 1 має високий індекс розчинності і значний ступінь виживання молочнокислих бактерій та стафілококу, що дозволяє застосовувати його без попередньої активізації прямим внесенням до розсолу при виробництві 3 UA 114255 C2 5 м'ясних продуктів. Бактеріальні препарати, одержані за прикладами 2 та 3, не задовольняють вимогам, які висуваються до культур прямого внесення внаслідок низької чисельності молочнокислих бактерій. Такий спосіб дозволяє отримати значну концентрацію як молочнокислих бактерій, так і стафілококів у поживному середовищі наприкінці культивування та, відповідно, високу їх чисельність і активність у готовому бактеріальному препараті "ЛСт" Це дає змогу використовувати бактеріальний препарат " ЛСт" для посолу м'ясної сировини, що забезпечує санітарно-епідеміологічну безпеку готового продукту. Таблиця 1 Характеристика м'ясної сировини до та після посолу Назва показника БГКП, в г МКБ, lg КУО/г Стафілокок, КУО/г Вміст нітрозопігментів, % Вміст нітриту натрію, мг/100 г Кінцевий рівень рH aw Волого зв'язувальна здатність, % 2 Пластичність, см /г Вміст летких жирних кислот, мг/100г з препаратом "ЛСт" без препарату Тривалість посолу, год. 0 72 0 72 1 0,1 1 0,01 6,7 7,98 4,43 5,83 5,47 6,31 3,2 4,43 84,6 64,5 77,4 47,3 9,45 6,81 9,38 8,24 5,72 5,51 5,72 5,62 0,988 0,965 0,990 0,969 64,8 84,3 64,7 79,6 7,76 17,23 7,78 15,11 2,08 11,39 1,32 9,14 10 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 15 20 25 Спосіб одержання бактеріального препарату для посолу м'ясної сировини, який включає приготування поживного середовища, сумісне культивування молочнокислих бактерій і стафілококу, їх змішування та сумісне культивування, відокремлювання біомаси, змішування з захисним середовищем, заморожування та сушіння суспензії клітин, подрібнення препарату, який відрізняється тим, що інокулят молочнокислих бактерій видів Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei ssp. paracasei та Lactobacillus plantarum культивують на середовищі МРС при температурі 32±2 ºC в статичних умовах протягом 18-20 год., окремо культивують стафілокок виду Staphylococcus carnosus в аеробних умовах протягом 46-48 год., далі проводять нагромадження біомаси заквашувальної композиції, яка містить молочнокислі бактерії Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus та Lactobacillus paracasei ssp. paracasei, та штам стафілококу виду Staphylococcus carnosus при співвідношенні культур 1:0,5:0,5:1 відповідно, при сумісному культивуванні у поживному середовищі на основі води з пептоном протягом 14-15 годин при періодичній аерації при температурі 32±2 ºC при постійному рН 6,46,6. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4