Спосіб отримання пробіотичного фруктового напою

Реферат: UA 110508 C2 (12) UA 110508 C2 Винахід стосується способу отримання пробіотичного фруктового напою, що включає адаптацію до кислот як мінімум одного штаму пробіотичних бактерій в ході їх розмноження, що включає розмноження як мінімум одного штаму пробіотичних бактерій без стабілізації рН, виділення, концентрування і заморожування або ліофільне сушіння цього як мінімум одного штаму адаптованих до кислот пробіотичних бактерій; засівання фруктового напою цим як мінімум одним штамом адаптованих до кислот пробіотичних бактерій, отриманим на стадії (а); і додатково упаковку пробіотичного фруктового напою. UA 110508 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід стосується способу отримання фруктових напоїв, що включають значні кількості живих пробіотиків. Крім того, даний винахід стосується фруктових напоїв, що містять пробіотики, які можна отримувати вказаним способом, і застосування адаптованих до кислот пробіотичних бактерій для виготовлення пробіотичних фруктових напоїв. ПЕРЕДУМОВИ ВИНАХОДУ Відомо, що деякі бактерії володіють пробіотичними властивостями, тобто вони впливають позитивним чином на стан здоров'я організму хазяїна при споживанні відповідних кількостей життєздатних бактерій. Зокрема, штами бактерій, що належать до родів Lactobacillus і Bifidobacterium стали предметом численних досліджень, які продемонстрували профілактичну клінічну дію в різних галузях і на певні фізіологічні функції. Ці пробіотики, як правило, є безпечними і в можуть значною мірою сприяти належному функціонуванню кишкової флори. Крім очевидних свідоцтв позитивного впливу бактерій, відповідних визначенню пробіотиків, на здоров'ї споживачів, ці бактерії повинні володіти здатністю виживати і утворювати колонії в кишечнику, а також переносити процеси виробництва і зберігання харчових продуктів в жорстких умовах. Клінічні дані показують, що для забезпечення пробіотичної ефективності, 9 денна доза пробіотичних бактерій повинна складати не менше 10 CFU (колонієутворювальних одиниць). Ринок пробіотичних продуктів продовжує розширятися. Зокрема, пробіотики стали вводити в молочні продукти, де молочнокислі бактерії відносно добре адаптовані до середовища. У цей час встановлено, що апельсинові соки, а також інші типи фруктових соків і напоїв, що містять фруктове пюре і фруктові соки, є важливими носіями пробіотичних культур, що об'єднують корисні властивості фрукти і пробіотиків. Крім того, фруктові напої, які не містять молочних компонентів, дають відмінну можливість введення гіпоалергенних пробіотиків, наприклад, L.Casei 431® (Chr. Hansen, Hoercholm, Denmark). Однак досить кисле середовище фруктових соків приводить до значного скорочення спочатку великої кількості бактерійних клітин, якщо стандартну кількість пробіотика додають, наприклад, до апельсинового соку. Для успішного застосування пробіотичних культур у фруктових напоях, за час зберігання в них повинна гарантовано зберігатися необхідна концентрація пробіотичних клітин. Таким чином, вирішальне значення має підвищення виживаності пробіотичних культур в апельсиновому соку і інших фруктових напоях. У техніці відомі способи виробництва фруктових напоїв, що містять ефективні кількості живих лактобактерій Lactobacilli, як, наприклад, в європейському патенті EP 0113055, який стосується способу, що включає приведення фруктового соку в контакт з твердим агентом для видалення бактеріостатичних компонентів, з подальшою проліферацією лактобактерій у фруктовому соку при pH 4,0 або нижче. Однак в таких фруктових напоях може спостерігатися збільшення числа і/або активності бактерій, що спричиняє утворення газу і появу присмаків, роблячи їх непридатними для споживання. Заявка на патент США US 2010/0086646 стосується свіжого рослинного соку і/або харчового продукту на молочній основі, який включає живі пробіотики і слабку харчову протоновану монокислоту з pH 3-4, причому остання заважає пробіотикам виробляти небажаний смак і/або газ в харчовому продукті. Заявка на патент PCT WO 2010/132017 направлена на пробіотичний напій з фруктовим соком, що містить як мінімум один штам пробіотичних бактерій і як мінімум один компонент, що знижує утворення газу, вибраний з ацероли, граната, журавлини, чорноплідної горобини, чорної смородини, крушини або бузини. Додання монокислот може впливати на органолептичні властивості харчового продукту і, крім того, негативно впливати на рівень виживаності пробіотичних бактерій. Додання засобів, що зменшують утворення кислот, також, мабуть, впливає негативним чином на рівень виживаності пробіотичних бактерій. Додання агентів для видалення бактеріостатичних сполук і/або для зменшення утворення небажаного смаку і/або газу в харчовому продукті може виявитися таким, що дорого коштує. Таким чином, в даній галузі техніки зберігається потреба в розробці альтернативних способів отримання пробіотичних фруктових напоїв з високою пробіотичної цінністю, де пробіотичний фруктовий напій демонструє хороший смак без присмаків і газоутворення, і де цей пробіотичний фруктовий напій має тривалий термін зберігання. Зокрема, існує потреба в способах, які не включають додання твердих агентів, монокислот або інших сполук, які можуть впливати на органолептичні якості фруктового напою. 1 UA 110508 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У даному винаході запропонований альтернативний спосіб отримання фруктових напоїв, що містять пробіотичні бактерії, які були адаптовані до дії кислот перед введенням у фруктовий напій. СУТЬ ВИНАХОДУ Мета даного винаходу полягала в розробці пробіотичного фруктового напою, що містить стійкі пробіотичні бактерії, які можуть виживати в кислому середовищі фруктового напою. Інша мета даного винаходу полягала в розробці пробіотичного фруктового напою з хорошим смаком. Ще одна мета даного винаходу полягала в розробці такого пробіотичного фруктового напою, який має тривалий термін зберігання. Для отримання високих значень CFU/мл для пробіотичних бактерій у фруктових напоях без додання надмірних кількостей пробіотичних бактерій, автори даного винаходу розробили шлях поліпшення стійкості пробіотичних бактерій до кислот, тим самим додавши їм стійкість до низьких значень pH. Даний винахід оснований на тому, що пробіотичні бактерії можна адаптувати до кислого середовища, шляхом розмноження протягом певного періоду часу без стабілізації pH без значного впливу на вихід, отриманий при ферментації. Адаптовані до кислот пробіотичні бактерії виключно корисні як пробіотичні композиції для додання до фруктових напоїв з низьким значенням pH (менше 4,2). Вони об'єднують всі корисні якості пробіотичних бактерій з високою поживною цінністю фруктів. Спосіб за даним винаходом не включає додання до фруктового напою хімічних сполук, які могли б вплинути на органолептичні якості пробіотичного фруктового напою. Відповідно, в першому аспекті даний винахід стосується способу отримання пробіотичного фруктового напою, де вказаний спосіб включає: (a) адаптацію до кислот як мінімум одного штаму пробіотичних бактерій під час їх розмноження; (b) засівання фруктового напою як мінімум одним штамом адаптованих до кислот пробіотичних бактерій, отриманих на стадії (a); і (с) необов'язково, упаковку пробіотичного фруктового напою. Згідно з одним з варіантів здійснення даного винаходу, адаптацію пробіотичних бактерій до кислот на стадії (a) здійснюють шляхом: (i) розмноження як мінімум одного штаму пробіотичних бактерій без стабілізації pH при температурі в діапазоні від 25 °C до 43 °C і переважно від 25 °C до 40 °C у відповідному середовищі, що має початкове значення pH від приблизно 6,0 до приблизно 7,0, де вказане середовище має склад, що дозволяє цьому середовищу досягати значення pH від приблизно 5,0 до приблизно 4,0; (ii) збору цього як мінімум одного штаму адаптованих до кислот пробіотичних бактерій; (iii) необов'язкового концентрування цього, як мінімум, одного штаму адаптованих до кислот пробіотичних бактерій; і (iv) необов'язкового заморожування або ліофільного сушіння цього, як мінімум, одного штаму адаптованих до кислот пробіотичних бактерій. У переважному варіанті здійснення, вказане середовище на стадії (i) має склад, що дозволяє йому досягати pH від приблизно 5,0 до приблизно 4,0 через, як мінімум, 8 годин розмноження бактерій. У ще одному переважному варіанті здійснення, адаптований до кислот штам пробіотичних бактерій концентрують на стадії (iii), тобто після збору адаптованих до кислот бактерій. Другий аспект даного винаходу стосується пробіотичного фруктового напою, який можна отримати способом за першим аспектом даного винаходу. Винахід стосується також пробіотичного фруктового напою, який включає штам Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CRL431 (L.casei 431®). Третій аспект даного винаходу стосується способу отримання культури штаму адаптованих до кислот пробіотичних бактерій, де вказаний спосіб включає стадії: (a) розмноження штаму пробіотичних бактерій без стабілізації pH при температурі в діапазоні від 25 °C до 43 °C і переважно від 25 °C до 40 °C у відповідному середовищі, що має початкове значення pH від приблизно 6,0 до приблизно 7,0, де вказане середовище має склад, що дозволяє цьому середовищу досягати значення pH від приблизно 5,0 до приблизно 4,0; (b) збору цього штаму адаптованих до кислот пробіотичних бактерій; (с) необов'язкового концентрування цього штаму адаптованих до кислот пробіотичних бактерій; і (d) необов'язкового заморожування або ліофільного сушіння цього штаму адаптованих до кислот пробіотичних бактерій. 2 UA 110508 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У переважному варіанті здійснення, вказане середовище на стадії (a) має склад, що дозволяє вказаному середовищу досягати pH від приблизно 5,0 до приблизно 4,0 через, як мінімум, 8 годин розмноження бактерій. В особливо переважному варіанті здійснення, штам адаптованих до кислот пробіотичних бактерій концентрують на стадії (с), тобто після збору адаптованих до кислот пробіотичних бактерій. Четвертий аспект винаходу стосується культури штаму адаптованих до кислот пробіотичних бактерій, яку можна отримати способом за третім аспектом даного винаходу. П'ятий аспект винаходу стосується застосування культури штаму адаптованих до кислот пробіотичних бактерій за четвертим аспектом винаходу для виготовлення пробіотичного фруктового напою. КОРОТКИЙ ОПИС ІЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРІАЛУ На Фіг. 1 показане підвищення кислотності середовища MRS (Difco) під дією L.casei 431®. Адаптовані до кислот бактерійні клітини збирали при pH 5,0, pH 4,5 і pH 4,0 з допомогою центрифугування. На фіг. 2 показана кількість клітин L.casei 431® при великомасштабному виробництві. На фіг. 3 показана кількість клітин L.casei 431® при доданні до полуничного/бананового соку для неадаптованих (ромби), альтернативно адаптованих при отриманні або до pH 4,0 7 (трикутники), або до pH 5,0 (квадрати) клітин, які потім додавали в сік в низьких (5×10 CFU/мл, 8 символи із залиттям) або високих (1×10 CFU/мл, символи без залиття) концентраціях. На фіг. 4 показана кількість клітин L.casei 431® при доданні до тропічного соку для неадаптованих (ромби), альтернативно адаптованих при їх отриманні або до pH 4,0 7 (трикутники), або до pH 5,0 (квадрати) клітин, які потім додавали в сік в низьких (5×10 CFU/мл, 8 символи із залиттям) або високих (1×10 CFU/мл, символи без залиття) концентраціях. На фіг. 5 показана кількість клітин L.casei 431® при доданні до соку з червоних плодів для неадаптованих (ромби), альтернативно адаптованих при їх отриманні або до pH 4,0 7 (трикутники), або до pH 5,0 (квадрати) клітин, які потім додавали в сік в низьких (5×10 CFU/мл, 8 символи із залиттям) або високих (1×10 CFU/мл, символи без залиття) концентраціях. На фіг. 6 показана кількість клітин L.casei 431® при доданні до 100 % апельсинового соку для неадаптованих (контроль), адаптованих при їх отриманні до pH 4,0, 4,5 або 5,0 клітин, які 8 потім додавали в сік в концентраціях 1,5×10 CFU/мл. На фіг. 7 показана кількість клітин L.casei 431® для неадаптованих (контроль), адаптованих при їх отриманні до pH 4,0, 4,5 або 5,0 клітин, які потім зберігали у вигляді заморожених гранул при -50 °C і регулярно тестували на життєздатність при відтаванні культури шляхом посіву залиттям. На фіг. 8 показана кількість клітин L.casei 431® для неадаптованих (контроль) або адаптованих до pH 4,0 при їх отриманні клітин, що зберігаються у вигляді заморожених гранул при -50 °C протягом 6 місяців, які потім додавали до апельсинового соку, що зберігається при 8 °C протягом періоду часу, показаного на осі х. На фіг. 9 показана кількість клітин L.casei 431® при доданні до апельсинового соку для неадаптованих клітин (квадрати) і альтернативно адаптованих при їх отриманні до pH 4,0 клітин (трикутники), які потім зберігали при 8 °C. ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Визначення У контексті даного опису термін "фруктовий сік" стосується рідини, що природним чином міститься в фрукті і отриманої механічним вичавленням або подрібненням свіжих плодів без допомоги нагрівання і розчинників. "Фруктовий сік" може складатися з соку плодів одного типу або суміші соків плодів більше, ніж одного типу. Термін "напій з фруктового соку" в контексті даного опису стосується напою, в якому вміст фруктового соку складає від 0 до 29 %. Термін "нектар" в контексті даного опису стосується напою, в якому вміст фруктового соку складає від 30 до 99 %. У контексті даного опису, термін "пюре" стосується фруктів, які піддані переробці подрібненням, пресуванням і/або пропущенням через сітку до консистенції густої рідини або м'якої пасти без застосування нагрівання або розчинників. "Пюре" на 100 % складається з фруктів, в протилежність продукту, виготовленому тільки з фруктового соку. У контексті даного опису, термін "фруктовий напій" стосується напою, що включає фруктовий сік, фруктовий концентрат і/або фруктове пюре. Термін "фруктовий напій" охоплює "фруктовий сік", "напій з фруктового соку" і "нектар", які визначені вище. "Фруктовий напій" може або містити м'якуш, або м'якуш може бути видалений за допомогою такої операції, як 3 UA 110508 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 центрифугування. Фруктові напої можуть додатково містити, наприклад, овес, сою, мигдаль, сироватку і/або неферментоване молоко, наприклад, в формі молочного порошку. В особливо переважному варіанті здійснення, фруктові напої за даним винаходом не включають молочних компонентів, наприклад, молока. У контексті даного опису термін "адаптовані до кислот" (бактерії) стосується живих бактерій, яким додана стійкість до низьких значень pH шляхом послідовної дії поступово зменшуваних рівнів pH під час культивування. Відповідно, отримання адаптованих до кислот штамів пробіотичних бактерій, як правило, включає культивування цих штамів при поступово зменшуваних рівнях pH, наприклад, при досягненні pH від 4,0 до 5,0. Переважно, пробіотичні бактерії, які піддаються адаптації до кислот, під час свого розмноження самі виробляють кислоту, яка нагромаджується в середовищі. Більш переважно, пробіотичні бактерії, що продукують кислоту, належать до групи молочнокислих бактерій. Як альтернатива, якщо пробіотичні бактерії, які піддаються адаптації до кислот, не виробляють кислоту самостійно, зниження pH можна також здійснювати додаванням сторонньої кислоти. Спосіб адаптації до кислот переважно здійснюють розмноженням пробіотичних бактерій в середовищі без стабілізації pH. Вираз "без стабілізації pH" означає, що не були здійснені заходи для протидії поступовому зниженню pH середовища. Наприклад, в одному з варіантів здійснення, середовище, в яке висівають пробіотичні бактерії, як правило, не містить буферних агентів, які могли б підтримувати стійкий рівень pH при утворенні або доданні кислоти. Як альтернатива, якщо вихідне середовище містить певну концентрацію буферних агентів, культивування можна продовжувати до виснаження місткості буферного агента, причому під час культивування не додають додаткових порцій буферного агента. Зокрема, під час культивування не додають основ для компенсації зменшення pH. Під "присмаком" мається на увазі аномальний смак харчового продукту. Присмак неприємний для споживача і, отже, небажаний. У продукті можна виявити так звані "позитивні" відтінки смаку, наприклад, присмаки фруктового типу. Оскільки ці смаки не є неприємними для споживача, в даному винаході вони не входять в термін "присмак". У контексті даного винаходу, термін "упаковка" пробіотичного фруктового напою стосується кінцевої упаковки пробіотичного фруктового напою з метою отримання продукту, який може вживатися, наприклад, людиною або групою людей. Таким чином, придатна упаковка може являти собою пляшку або картонну тару і т.п., і відповідна кількість може складати, наприклад, від 10 мл до 5000 мл, але в даному винаході переважно, щоб кількість продукту в упаковці складала від 50 мл до 1000 мл, наприклад, від 200 мл до 1000 мл. Термін "пробіотичні бактерії" стосується життєздатних бактерій, які вводять споживачеві в адекватних кількостях з метою досягнення позитивного впливу на здоров'я споживача. Пробіотики можна вводити у вигляді дискретних дозованих форм, наприклад, капсул, суспензій і т.п. Як альтернатива, пробіотичні бактерії вводять в формі харчової або дієтичної добавки. Пробіотичні бактерії після прийому в їжу здатні виживати в умовах шлунково-кишкового тракту і заселяти кишечник споживача. У техніці як пробіотичні бактерії використовувалися різні типи бактерій, включаючи бактерії роду Lactobacillus, наприклад, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri і Lactobacillus johnsonii, роду Bifidobacterium, наприклад, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium longum і т.п. Крім того описані пробіотичні штами бактерій з інших родів, наприклад, Escherichia і Bacillus. У контексті даного винаходу, термін "мутант" потрібно розуміти, як штам, отриманий, або штам, який може бути отриманий з штаму за даним винаходом (або материнського штаму) з допомогою генної інженерії, дії випромінювання і/або хімічної обробки. Мутант може також бути мутантом, що мимовільно виник. Переважно, щоб мутант був функціонально еквівалентним мутантом, наприклад, мутантом, який має практично такі ж або поліпшені властивості (наприклад, відносно смаку, подальшого утворення кислоти, швидкості утворення кислоти і/або здатності пристосуватися до кислот), як материнський штам. Такий мутант є частиною даного винаходу. Зокрема, термін "мутант" стосується штаму, отриманому обробкою штаму за даним винаходом будь-яким способом мутагенезу, що традиційно застосовується, включаючи обробку хімічним мутагеном, наприклад, етан метан сульфонатом (EMS) або N-метил-N'-нітро-Nнітрогуанідином (NTG), УФ-випромінюванням, або мутантів, що спонтанно з'явилися. Мутант може бути підданий декільком обробкам, що викликають мутації (одну обробку потрібно розглядати, як одну стадію мутагенезу, за якою йде стадія селекції/відбору), але в цьому випадку переважно, щоб проводилося не більше 20 або не більше 10, або не більше 5 обробок (або стадій скринінга/селекції). У мутанта, який є переважним за даним винаходом, менше 5 %, 4 UA 110508 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 або менше 1 %, або навіть менше 0,1 % нуклеотидів в бактерійному геномі заміщені іншими нуклеотидами або виключено в порівнянні з материнським штамом. У контексті даного опису, термін "варіант" потрібно розуміти, як штам, який є функціональним еквівалентом штаму за даним винаходом, наприклад, має практично такі ж або поліпшені властивості, наприклад, відносно смаку, подальшого утворення кислоти, швидкості утворення кислоти і/або здатності пристосуватися до кислот. Такі варіанти, які можна ідентифікувати за допомогою відповідних методик скринінга, є частиною даного винаходу. Використання артиклів "а", "and" і "the" і аналогічних покажчиків в контексті опису даного винаходу (особливо в контексті наведеної далі формули винаходу) потрібно розуміти, як вказівка, як на однину, так і на множину, якщо інше прямо не вказане в заявці або явно не спростовується контекстом. Терміни "що включає", "той, що має" і "що містить" потрібно розуміти, як не обмежуючі терміни (тобто, що означають "той, що включає, але не обмежений"), якщо не вказане інше. Згадка діапазонів значень в даний заявці призначена тільки як спосіб скороченої індивідуальної згадки кожного окремого значення, що потрапляє в цей діапазон, якщо інше не вказане в заявці, і кожне окреме значення включене в опис, як якби воно було індивідуально наведене в тексті. Всі методики, описані в даний заявці можуть бути реалізовані в будь-якому відповідному порядку, якщо інше не вказане в тексті або явно не спростовується контекстом. Використання в даний заявці всіх без виключення прикладів, або фраз, які вказують на те, що наведена позиція є прикладом, (наприклад, "такий, як") призначено тільки для більш повного роз'яснення винаходу і не накладає обмеження на об'єм винаходу, якщо інше не вказане в формулі винаходу. Жодне з формулювань в описі не треба тлумачити, як таке, що вказує на який-небудь незаявлений елемент, який є істотним для практичної реалізації даного винаходу. Практична реалізація і різні аспекти даного винаходу У напоях за даним винаходом можуть застосовуватися штами пробіотичних бактерій, наприклад, бактерій родів Lactobacillus і Bifidobacterium. Однак вони чутливі до кислотного середовища і кількість життєздатних клітин швидко скорочується, коли їх вміщують в середовище з pH 4,2 або нижче. Автори даного винаходу несподівано виявили, що адаптація штамів пробіотичних бактерій до кислот значно підвищує їх виживаність у фруктових напоях, які, як правило, мають низьке значення pH в діапазоні 3-4 через наявність фруктових кислот. Виживаність адаптованих до кислот пробіотичних бактерій у фруктових напоях в незначній мірі підпадає під вплив низьких значень pH протягом періоду до 10 тижнів зберігання при низькій температурі, і висока життєздатність в кислому середовищі зберігається у бактерій при зберіганні в замороженому стані. Крім того, при доданні адаптованих до кислот пробіотичних бактерій до фруктових напоїв, наприклад, напоїв з червоних плодів, тропічних фруктів і полуниці/банана, не було виявлено присмаків. Таким чином, в першому аспекті даний винахід стосується способу отримання пробіотичного фруктового напою шляхом введення у фруктовий напій як мінімум одного штаму адаптованих до кислот пробіотичних бактерій. Прикладами фруктових напоїв, придатних для застосування в даному винаході, є такі напої, які мають низькі значення pH, зокрема, що включають соки цитрусових плодів, наприклад, апельсиновий сік, грейпфрутовий сік, сік лайма і мандариновий сік, а також їх суміші. Інші приклади фруктових напоїв включають фруктові напої, що містять яблучний сік. Фруктові напої, придатні для застосування в даному винаході, можуть бути, наприклад, фруктовими соками, фруктовими соками з концентрату, напоями з фруктових соків і фруктовими нектарами, що необов'язково містять фруктове пюре і/або воду. Загальний вміст фруктового соку і/або фруктового пюре у фруктовому напої, як правило, складає від приблизно 20 % до приблизно 99,99 % по масі, переважно від приблизно 30 % до 95 % по масі, більш переважно від приблизно 40 % до 90 % по масі, ще більш переважно від приблизно 50 % до 80 % по масі і найбільш переважно від 60 % до 70 % по масі. В одному з варіантів здійснення, фруктовий напій за даним винаходом практично не містить молочних компонентів, але може включати овочевий сік, овочевий концентрат і/або овочеве пюре. В одному з варіантів здійснення, значення pH цих фруктових напоїв знаходяться в діапазоні від 3,2 до 4,2, переважно від 3,5 до 3,9. В одному з переважних варіантів здійснення, фруктовий напій повністю або частково виготовлений з плодів, вибраних з групи, що складається з полуниці, банана, винограду, 5 UA 110508 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 апельсина, яблука, манго, персика, чорниці, ананаса, лайма, малини і чорної смородини, а також їх сумішей. Згідно з переважним варіантом здійснення даного винаходу, фруктовий напій включає полуничне пюре, бананове пюре, виноградний сік, апельсиновий сік, пюре манго, пюре персика і пюре чорниці. Згідно з іншим переважним варіантом здійснення даного винаходу, фруктовий напій включає ананасовий сік, апельсиновий сік, бананове пюре, пюре манго і сік лайма. Згідно з ще одним переважним варіантом здійснення даного винаходу, фруктовий напій включає пюре малини, сік чорної смородини, чорничне пюре, виноградний сік, полуничне пюре і бананове пюре. Згадана як мінімум одна пробіотична бактерія адаптована до кислот шляхом розмноження у відповідному середовищі без стабілізації pH. В одному з варіантів здійснення, розмноження цієї як мінімум однієї пробіотичної бактерії здійснюють без стабілізації pH при температурі в діапазоні від 25 °C до 43 °C, переважно, в діапазоні від 25 °C до 40 °C в середовищі, що має початкове значення pH від приблизно 6,0 до приблизно 7,0, де вказане середовище має склад, що дозволяє йому досягати значення pH від приблизно 5,0 до приблизно 4,0 переважно, після принаймні 8 годин розмноження бактерій, з отриманням, як мінімум, одного штаму адаптованих до кислот пробіотичних бактерій; потім отриманий, як мінімум, один штам адаптованих до кислот пробіотичних бактерій збирають; потім цей як мінімум один штам адаптованих до кислот пробіотичних бактерій переважно концентрують; і отриманий як мінімум один штам адаптованих до кислот пробіотичних бактерій необов'язково заморожують або піддають ліофільному сушінню. Середовище, що застосовується для адаптації пробіотичних бактерій до кислот, переважно має склад, який дозволяє вказаному середовищу досягати значення pH від приблизно 5,0 до приблизно 4,0 під час розмноження пробіотичних бактерій. Це означає, що pH середовища знижується внаслідок вироблення кислоти пробіотичними бактеріями або, як альтернатива, внаслідок безперервного або періодичного додавання кислоти до культури. Відповідно, це середовище не включає яких-небудь істотних компонентів, які могли б розкладатися або іншим шляхом ставати неефективними або навіть токсичними при pH від приблизно 5,0 до приблизно 4,0. Істотні компоненти середовища являють собою сполуки, які необхідні для розмноження пробіотичних бактерій, наприклад, нутрієнти, джерела вуглецю і азоту, вітаміни і т.п. Середовище, що застосовується для розмноження бактерій, в переважному варіанті здійснення включає не менше 0,4 % екстракту дріжджів і не менше 2 % цукру. Придатні середовища, які можна застосовувати для розмноження пробіотичних бактерій, зокрема молочнокислих бактерій, добре відомі в техніці. Наприклад, якщо пробіотичні бактерії, які мається намір застосовувати при реалізації винаходу, являють собою молочнокислі бактерії, можна використати будь-яке наявне в продажу культуральне середовище для молочнокислих бактерій, наприклад, середовище Lactobacilli MRS (de Man, Rogosa і Sharpe). Типове середовище MRS, яке можна застосовувати для розмноження пробіотичних бактерій, містить 1,0 % пептону, 0,8 % м'ясного екстракту, 0,4 % екстракту дріжджів, 2,0 % глюкози, 0,5 % тригідрату ацетату натрію, 0,1 % полісорбату 80 (відомого також, як Tween 80), 0,2 % дикалійгідрофосфату, 0,2 % триамонійцитрату, 0,02 % гептагідрату сульфату магнію і 0,005 % тетрагідрату сульфату марганцю, pH 6,0-7,0 при 25 °C. При застосуванні цього середовища для адаптації пробіотичних бактерій до кислот, особливо переважно видалити з складу дикалійгідрофосфат, з тим, щоб середовище втратило здатність зберігати стабільне значення pH при виробленні кислоти бактеріями або при доданні сторонньої кислоти. У ще більш переважному варіанті здійснення, із згаданого вище середовища MRS видаляють не тільки дикалійгідрофосфат, але і тригідрат ацетату натрію. Однак, як неодноразово вказано в тексті заявки, можна також залишити буферні компоненти в середовищі, що застосовується для адаптації пробіотичних бактерій до кислот. У цьому випадку, зниження pH почнеться після виснаження буферної місткості середовища. Культивування пробіотичних бактерій не повинне супроводжуватися доданням будь-яких сторонніх основ. Фахівець в даній галузі, як правило, повинен знати придатне середовище для розмноження пробіотичних бактерій. Згадані середовища, що включають або не включать буферні компоненти, придатні для розмноження закваскових культур, наприклад, закваскових культур, що мають об'єм приблизно 100 мл, приблизно 500 мл, приблизно 1000 мл, приблизно 2000 мл, приблизно 4000 мл або більше, а також для розмноження бактерійних культур у великих об'ємах, наприклад, культур в об'ємі більше 50 л, більше 100 л, більше 200 л або більше 400 л. Розведення бактерійних культур в таких великих масштабах, як правило, повинно 6 UA 110508 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 здійснюватися в ферментері. Застосування придатного середовища показане нижче в прикладі 1. Початкове значення pH середи являє собою pH середовища до додання пробіотичних бактерій. У переважному варіанті здійснення, початкове значення pH середовища знаходиться в межах від приблизно 6,0 до 7,0, переважно від приблизно 6,2 до приблизно 6,6. В одному з варіантів здійснення даного винаходу, pH середовища досягає значення від приблизно 5,0 до приблизно 4,0, переважно, як мінімум, через 6 годин, як мінімум 8 годин, як мінімум 10 годин розмноження пробіотичних бактерій і, більш переважно, як мінімум, через 12 часів розмноження пробіотичних бактерій. В особливо переважному варіанті здійснення, pH середовища досягає значення від приблизно 5,0 до приблизно 4,0, як мінімум, через 8 годин. Пробіотичні бактерії можуть спричиняти зниження pH при розмноженні завдяки виробленню молочної кислоти при ферментації. У переважному варіанті здійснення, середовище, що застосовується в способі за даним винаходом, допускає можливість цього зниження pH, оскільки воно не містить або практично не містить яких-небудь буферних агентів, які могли б підтримувати значення pH на початковому рівні, незважаючи на утворення молочної кислоти при розмноженні. Розмноження пробіотичних бактерій переважно здійснюють без стабілізації pH при температурі в діапазоні від 25 °C до 43 °C, переважно в діапазоні від 25 °C до 40 °C, більш переважно, в діапазоні від 30 до 40 °C і найбільш переважно приблизно при 37 °C. У переважному варіанті здійснення даного винаходу, згаданий як мінімум один штам пробіотичних бактерій стосується родів Lactobacillus або Bifidobacterium. У більш переважному варіанті здійснення даного винаходу, згаданий як мінімум один штам пробіотичних бактерій стосується виду Lactobacillus paracasei. Якщо застосовуються бактерії Lactobacillus paracasei, температура розмноження переважно становить 37 або 38 °C. Штам Lactobacillus paracasei subsp.paracasei CRL431 (L.casei 431®) був депонований згідно з Будапештським Договором про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури в Американському Центрі Колекції Типових Тканин, 10801 University Blvd, Manassas, VA 20110, USA 24 січня 1994 р. під інвентарним номером ATCC 55544. Ці добре відомі пробіотичні бактерії можна придбати у Chr.Hansen А/S, 10-12 Boege Alle, DK-2970 Hoersholm, Denmark, під назвою Probio-Tec® F-DVS L.Casei-431®, номер позиції 501749, і під назвою Probio-Tec® C-Power-30, номер позиції 687018. У ще більш переважному варіанті здійснення даного винаходу, згаданий як мінімум один штам пробіотичних бактерій вибраний з групи, що складається з штаму Lactobacillus paracasei subsp.paracasei CRL431 (L.casei 431®), який був депонований в Американському Центрі Колекції Типових Тканин під інвентарним номером ATCC 55544, його мутанта і його варіанту. Способи збору і концентрування адаптованих до кислот пробіотичних бактерій добре відомі в техніці. Наприклад, виділення бактерій можна здійснювати центрифугуванням бактерійних культур для видалення супернатанту культурального середовища. Центрифугування необхідно проводити в досить м'яких умовах, щоб уникнути руйнування бактерій. Методики виділення клітин центрифугуванням є загальновідомими і включають, наприклад, центрифугування при 2000-6000×g протягом 2-20 хвилин. Бактерії можна також збирати іншими способами, які були описані в контексті ферментації бактерій, такими як, фільтрування, наприклад, фільтруванням в перехресному потоку. Аналогічно, в техніці відомі методикиконцентрування. Наприклад, концентрування бактерій може бути здійснене центрифугуванням і подальшим ресуспендуванням в меншому об'ємі, ліофільним сушінням або мембранним фільтруванням, наприклад, фільтруванням через колонки або фільтри. Фруктові напої звичайно засівають, як мінімум, один штамом адаптованих до кислот 4 10 пробіотичних бактерій в кількості (початкова кількість, CFU/мл) від приблизно 1×10 до 1×10 5 9 CFU/мл, більш переважно, в кількості від приблизно 1×10 до 1×10 CFU/мл і ще більш 6 8 переважно в кількості від приблизно 1×10 до 1×10 CFU/мл. Несподівано виявилося, що виживаність пробіотичних бактерій стає особливо високою після описаної вище адаптації до кислого середовища і залишається високою після зберігання протягом декількох місяців при температурі 4-10 °C. Виживаність згаданого як мінімум одного штаму адаптованих до кислот пробіотичних бактерій у фруктовому напої в одному з варіантів здійснення складає, як мінімум, 50 % від початкового вмісту CFU/мл після зберігання протягом, як мінімум, 30 днів при температурі 8 °C, наприклад, після зберігання протягом, як мінімум, 42 днів при температурі 8 °C, наприклад, після зберігання протягом, як мінімум, 70 днів при температурі 8 °C. У переважному варіанті здійснення, виживаність як мінімум одного штаму адаптованих до кислот пробіотичних бактерій складає, як мінімум, 60 % від початкового вмісту CFU/мл, 7 UA 110508 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 переважно, як мінімум, 70 % від початкового вмісту CFU/мл, і більш переважно, як мінімум, 80 % від початкового вмісту CFU/мл, у вказаних вище умовах зберігання. Вимірювання кількості життєздатних клітин здійснюють шляхом визначення кількості колонієутворювальних одиниць (CFU) в послідовних розведеннях, визначаючи число колоній на чашках з агаровим середовищем за відомими в техніці стандартними методиками. Придатне середовище і умови інкубування описані в наведених нижче прикладах. Після збору і/або концентрування, адаптовані до кислот бактерії необов'язково заморожують або піддають ліофільному сушінню. Наприклад, пробіотичні бактерії можна заморозити при температурі приблизно -20 °C, переважно приблизно -80 °C або нижче. Процедуру заморожування переважно проводять якнайшвидше, переважно в режимі шокової заморозки, щоб уникнути пошкодження клітин. Шокову заморозку можна провести, наприклад, шляхом занурення посудини, що містить бактерії, в рідкий азот. Таким чином, в особливо переважному варіанті здійснення адаптовані до кислот пробіотичні бактерії піддають шоковій заморозці приблизно при -196 °C. Методики ліофільного сушіння також добре відомі в техніці. При ліофільному сушінні матеріал заморожують і потім знижують тиск навколишнього середовища, щоб дати можливість крижаній воді в матеріалі сублімувати безпосередньо з твердої фази в газову фазу. Після заморозки або шокової заморозки адаптованих до кислот бактерій, ці бактерії можна зберігати при температурі приблизно -20 °C, приблизно -55 °C, приблизно -80 °C або в рідкому азоті при -196 °C. Особливо переважно зберігати адаптовані до кислот бактерії при температурі приблизно -55 °C. Згідно з одним з варіантів здійснення даного винаходу, пробіотичний фруктовий напій зручно упаковувати в герметично закриті упаковки, які містять від 10 до 5000 мл продукту, наприклад, від 50 до 1000 мл або від 200 до 1000 мл. У другому аспекті даний винахід стосується пробіотичного фруктового напою, який можна отримувати способом за першим аспектом даного винаходу, де цей пробіотичний фруктовий напій включає як мінімум один штам адаптованих до кислот пробіотичних бактерій. В одному з варіантів здійснення, цей як мінімум один штам пробіотичних бактерій присутній 4 10 у фруктовому напої в кількості від приблизно 1×10 до 1×10 CFU/мл, більш переважно, в 5 9 кількості від приблизно 1×10 до 1×10 CFU/мл і ще більш переважно в кількості від приблизно 6 8 1×10 до 1×10 CFU/мл після, як мінімум, 30 днів зберігання при температурі 8 °C, наприклад, після, як мінімум, 42 днів зберігання при температурі 8 °C. Вимірювання кількості життєздатних клітин здійснюють шляхом визначення кількості колонієутворювальних одиниць (CFU) в послідовних розведеннях, визначаючи число колоній на чашках з агаровим середовищем за відомими в техніці стандартними методиками. Придатне середовища і умови інкубування описані в наведених нижче прикладах. У третьому аспекті, даний винахід направлений на спосіб отримання культури штаму адаптованих до кислот пробіотичних бактерій шляхом їх розмноження без стабілізації pH. У переважному варіанті здійснення, пробіотичні бактерії піддають розмноженню без стабілізації pH при температурі в діапазоні від 25 °C до 43 °C, переважно в діапазоні від 25 °C до 40 °C в середовищі, що має початкове значення pH від приблизно 6,0 до приблизно 7,0, де вказане середовище має склад, що дозволяє цьому середовищу досягати значення pH від приблизно 5,0 до приблизно 4,0 після, як мінімум, 8 годин розмноження, що дозволяє отримати адаптовані до кислот пробіотичні бактерії; потім адаптовані до кислот пробіотичні бактерії збирають; потім адаптовані до кислот пробіотичні бактерії концентрують; і потім адаптовані до кислот пробіотичні бактерії необов'язково заморожують або піддають ліофільному сушінню. В одному з переважних варіантів здійснення, згадане середовище включає не менше 0,4 % екстракту дріжджів і не менше 2 % цукру. Початкове значення pH середовища є значенням pH середовища до додання пробіотичних бактерій. У переважному варіанті здійснення, початкове значення pH середовища знаходиться в межах від приблизно 6,2 до приблизно 6,6. У переважному варіанті здійснення винаходу, середовище досягає значення pH в діапазоні від 5,0 до 4,0, як мінімум, через 10 годин розмноження пробіотичних бактерій, переважно, як мінімум, через 12 годин розмноження пробіотичних бактерій. У переважному варіанті здійснення, пробіотичні бактерії належать до родів Lactobacillus або Bifidobacterium. У більш переважному варіанті здійснення даного винаходу, згаданий як мінімум один штам пробіотичних бактерій стосується виду Lactobacillus paracasei. У ще більш переважному варіанті здійснення даного винаходу, згаданий як мінімум один штам пробіотичних бактерій вибраний з групи, що складається з штаму Lactobacillus paracasei 8 UA 110508 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 subsp.paracasei CRL431 (L.casei 431®), який був депонований в Американському Центрі Колекції Типових Тканин під інвентарним номером ATCC 55544, його мутанта і його варіанту. Четвертий аспект даного винаходу стосується культури штаму адаптованих до кислот пробіотичних бактерій за третім аспектом даного винаходу. П'ятий аспект винаходу направлений на застосування культури за четвертим аспектом винаходу для отримання пробіотичного фруктового напою. В одному з переважних варіантів здійснення, пробіотичний фруктовий напій має pH не більше, ніж 4,2. Далі по тексту даний винахід проілюстрований наступними не обмежуючими прикладами. ПРИКЛАДИ Приклад 1: Отримання адаптованих до кислот бактерій L.casei 431® Середовище MRS виробництва Difco (ref. 288110) засівали 1 % (об'єм/об'єм) препаратом L.casei 431®, який зберігали в замороженому стані. Культуру вирощували протягом ночі при 37 °C, поки значення pH не знижувалося на 3,9 і зберігали при 5 °C до застосування. Вирощену протягом ночі культуру застосовували для засівання 4 л. (1 % об'єм/об'єм) середовища MRS (Difco) і інкубували протягом ночі при 37 °C доти, поки значення pH не знижувалося до 3,9 і зберігали при 5 °C до застосування. Описану стадію попереднього засівання здійснювали для отримання достатньої кількості закваски для ферментації. Біореактор, що містив 400 л. відповідного середовища, при 10 °C засівали всім об'ємом заздалегідь отриманої закваски. Ферментацію ініціювали підвищенням температури до 35 °C і продовжували ферментацію, спостерігаючи за зниженням pH, як індикатором метаболізму вуглеводню з утворенням молочної кислоти. За час цього зниження pH, клітини поступово пристосовувалися до низьких значень pH. Адаптовані до кислот клітини збирали при pH 5,0, 4,5 і 4,0 з допомогою центрифугування. Час ферментації становив 10-17 годин в залежності від моменту виділення клітин (Фіг. 1). Концентровану клітинну масу негайно заморожували в рідкому азоті (-196 °C) і зберігали при -55 °C до застосування. Приклад 2: Оптимізація критеріїв збору адаптованих до кислот L.casei 431® Для отримання максимальної кількості життєздатних клітин, виявляли критерій оптимального моменту збору по наступній методиці. Біореактор засівали заздалегідь отриманою закваскою і ініціювали ферментацію, як описано в прикладі 1. Зразки ферментату відбирали кожні 30 хвилин, починаючи з моменту часу 11 годин після засівання (що відповідало pH 4,5), поки значення pH не опускалося нижче 4,0, і оцінювали виживаність бактерій шляхом визначення кількості колонієутворювальних одиниць (CFU) (Фіг. 2). Кількість CFU визначали, виливаючи на тарілки з агаром відповідні десятиразові розбавлення в MRS з подальшим анаеробним інкубуванням протягом 3 днів при 37 °C. Кількість клітин збільшувалася до 12 годин після засівання (що відповідало pH 4,24) і залишалася на постійному рівні під час подальшої ферментації. Це показує, що клітини стали стійкими і залишилися життєздатними навіть при зменшенні pH нижче 4,0. Зниження pH до значень