Стійкий до ампіциліну текстуруючий штам молочнокислих бактерій

Реферат: Винахід належить до штаму молочнокислих бактерій Lactobacillus delbrueckii, що є стійким до антибіотика ампіциліну та характеризується підвищеними текстуруючими властивостями, а також способу його одержання та композиції що його містить. UA 114511 C2 (12) UA 114511 C2 UA 114511 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки, до якої належить винахід Даний винахід стосується мутантів молочнокислих бактерій, таких як Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus і Streptococcus thermophilus, які є стійкими до антибіотика ампіциліну і які, як було виявлено, приводять до збільшеної текстури при вирощуванні в молоці із збереженням інших ростових властивостей батьківського штаму. Даний винахід, крім того, стосується культур, таких як стартові культури, які містять такі мутанти, і молочних продуктів, ферментованих з культурами. Рівень техніки, що передує винаходу У харчовій промисловості застосовуються численні бактерії, зокрема молочнокислі бактерії, для того, щоб поліпшити смак і текстуру харчових продуктів, а також для того, щоб збільшити термін зберігання цих харчових продуктів. У випадку молочної промисловості молочнокислі бактерії широко застосовуються, для того, щоб здійснювати підкислення молока (ферментацією), а також для того, щоб текстурувати продукт, в який вони включені. Серед молочнокислих бактерій, що застосовуються в харчовій промисловості, можуть бути згадані роди Streptococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus і Bifidobacterium. Молочнокислі бактерії видів Streptococcus thermophilus широко застосовуються окремо або в комбінації з іншими бактеріями, такими як Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus для виробництва харчових продуктів, зокрема ферментованих продуктів. Вони застосовуються, зокрема, в складі ферментів, які застосовуються для виробництва ферментованих видів молока, наприклад, йогуртів. Деякі з них грають переважну роль в розвитку текстури ферментованого продукту. Ця характеристика тісно пов'язана з продукуванням полісахаридів. Сучасною тенденцією в галузі йогуртів є м'який смак й інтенсивна текстура. Сьогодні це досягається застосуванням культур, які продукують м'який смак, і додаванням загущувачів або білка для одержання необхідної густини. Виробники йогуртів хотіли би мати можливість готувати йогурт з цими властивостями без додавання загущувальних агентів. Це допоможе знизити вартість і приведе до чистої етикетки. Дуже привабливим шляхом для досягнення цього може бути наявність стартової культури, яка продукує високий рівень текстури. Для того, щоб задовольнити вимогу промисловості, стало необхідним надання нових текстуруючих штамів молочнокислих бактерій, зокрема, Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus і Streptococcus thermophilus, для текстурування харчових продуктів. Існує особлива потреба в нових текстуруючих штамах Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus, які можуть бути застосовані разом з новими текстуруючими штамами Streptococcus thermophilus. Автори даного винаходу раніше розробили новий селекційний спосіб для ідентифікації поліпшених молочнокислих бактерій, таких як бактерії Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus і Streptococcus thermophilus, які приводять до високої текстури, при застосуванні ферментування молочного субстрату для ферментованих молочних продуктів. Спосіб, який описаний в міжнародній заявці на патент (PCT) № WO 2012/052557, стосується того, що автори даного винаходу несподівано ідентифікували релевантний зв'язок між стійкістю до D-циклосерину і функціонально еквівалентним антибіотикам і поліпшеними текстуруючими властивостями молочнокислих бактерій. D-циклосерин (D-4-аміноізоксазолідон) є антибіотиком, яким інгібує аланінрацемазу, Dаланіл-D-аланінлігазу, D-аланіл-аланін синтазу і D-аланін пермеазу, що викликають клітинний лізис. D-аланінрацемаза є необхідною для виробництва D-аланіну, складової частини пептидогліканового шару клітинної стінки. Ампіцилін є антибіотиком класу бета-лактамних антибіотиків і ефективний проти багатьох грампозитивних бактерій, включаючи більшість молочнокислих бактерій. Ампіцилін є конкурентним інгібітором ферментів DD-транспептидазного типу (EC 3.4.16.4). Інгібування DDтранспептидази ампіциліном запобігає формуванню пептидного зв'язку, необхідного для формування бактеріальної клітинної стінки, і, зрештою, веде до лізису клітини. Стійкі до ампіциліну мутанти були описані для ряду різних бактерій, але, наскільки відомо авторам даного винаходу, в попередньому рівні техніки не описаний або передбачений якийнебудь або релевантний зв'язок між стійкістю до ампіциліну і поліпшеними текстуруючими властивостями, як в даному документі. Суть винаходу Автори даного винаходу несподівано виявили, що група мутантів молочнокислих бактерій, стійка до ампіциліну, генерує високе дотичне напруження і/або гелеподібну загущуваність, коли бактерії застосовують для ферментування молока. Автори даного винаходу розробили спосіб одержання таких текстуруючих штамів молочнокислих бактерій, які є стійкими до антибіотика ампіциліну і/або іншого антибіотика, який інгібує фермент DD-транспептидазу. 1 UA 114511 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Описаний в даному документі спосіб одержання штаму молочнокислих бактерій містить наступні два етапи: (i) перший для скринування і відбору штамів молочнокислих бактерій, які є стійкими до ампіциліну, можна визначити це як стійкість до ампіциліну, яка значно вища, ніж звичайно представлена у природних/дикого типу молочнокислих бактерій; і (ii) з сукупності стійких до ампіциліну штамів й ідентифікованих в етапі (i) скринування і відбору штамів молочнокислих бактерій, які мають поліпшені текстуруючі властивості. Як показано в прикладі 2 в даному документі, автори даного винаходу виявили, що з сукупності стійких до ампіциліну штамів молочнокислих бактерій було можливо відносно швидко скринувати/відбирати штам молочнокислих бактерій, який має поліпшені текстуруючі властивості. По суті, причина цього полягала в тому, що автори даного винаходу ідентифікували, що дуже високий процент стійкого до ампіциліну штаму молочнокислих бактерій (відібраних на етапі (i)) також має поліпшені текстуруючі властивості. Відповідно, перший скринінг і відбір на стійкість до ампіциліну може розглядатися як вигляд попереднього етапу для того, щоб бути здатним швидко і ефективно скринувати і відбирати штам молочнокислих бактерій, який має поліпшені текстуруючі властивості, Для фахівця в даній галузі очевидно, що значна перевага описаного в даному документі скринінгу і селекційного способу полягає в тому, що можна швидко і ефективно скринувати і відбирати штам молочнокислих бактерій, який має поліпшені текстуруючі властивості. Наприклад, якщо вже є штам молочнокислих бактерій з комерційно релевантними властивостями відносно, наприклад, низького подальшого підкислення при застосуванні в приготуванні ферментованих молочних продуктів, потім може бути можливо застосовувати цей штам як стартову клітину для мутагенезу і потім відносно швидко відбирати і одержувати новий штам молочнокислих бактерій, який має поліпшені текстуруючі властивості, при цьому все ще зберігаючи його хороші властивості відносно, наприклад, низького подальшого підкислення. Як показано в прикладі 2 в даному документі приблизно 25 % перших відібраних стійких до ампіциліну штамів також приводили до значно вищої текстури, як визначено за допомогою часу витікання 28 мл підкисленого молока з полістиролової 25-мл піпетки щонайменше 50 секунд. Передбачається, що без застосування нового скринінгу і селекційного способу, як описано в даному документі, не була б можлива (або зайняла б велику кількість часу) ідентифікація штаму молочнокислих бактерій, яка приводить до такого тривалого часу витікання. Без обмеження якою-небудь теорією теоретичним поясненням несподівано ідентифікованого в даному документі зв'язку між стійкістю до ампіциліну і поліпшеними текстуруючими властивостями може бути те, що стійкі до ампіциліну молочнокислі клітини продукують більше так званих позаклітинних полісахаридів (ПКПС). Також теоретично можливо, що такі ПКПС можуть надати тип захисту навколо клітини, тобто, так що такі ПКПС захищають клітини проти проникнення ампіциліну в клітини, і тим самим надають збільшену стійкість до ампіциліну. Без обмеження якою-небудь теорією також можливо, що збільшене виробництво ПКПС приводить до збільшеної текстури в молоці, ферментованому зі стійкими до ампіциліну молочнокислими бактеріями. Як обговорювалося вище, ідентифіковані в даному документі штами молочнокислих бактерій є уперше відібраними на стійкість до ампіциліну, тобто, стійкими до концентрацій ампіциліну, які значно вищі, ніж концентрації ампіциліну, які переносяться природними/дикого типу молочнокислими бактеріями. Відповідно до вищенаведених несподіваних виявлень даний винахід стосується текстуруючих штамів молочнокислих бактерій, таких як штами Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus і Streptococcus thermophilus, які стійкі до ампіциліну і/або стійкі до іншого антибіотика, який інгібує фермент DD-транспептидазу, і способу одержання таких штамів. Крім того, даний винахід стосується культур, таких як стартові культури, які містять мутанти і молочніпродукти, такі як ферментовані молочні продукти, ферментовані з культурами. Докладний опис Визначення У значенні, що застосовується в даному документі, термін "молочнокислі бактерії" означає грампозитивну, мікроаерофільну або анаеробну бактерію, яка ферментує цукри з виробництвом кислот, включаючи молочну кислоту як переважну продуковану кислоту, оцтову кислоту і пропіонову кислоту. Найбільш придатні промислові молочнокислі бактерії виявлені в ряді "Lactobacillales", який включає Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. і Propionibacterium spp. Додатково, бактерії, які продукують молочну кислоту, що належать до групи суворо 2 UA 114511 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 анаеробних бактерій, біфідобактерії, тобто, Bifidobacterium spp., звичайно включені в групу молочнокислих бактерій. Це часто застосовується як харчові культури окремо або в комбінації з іншими молочнокислими бактеріями. Молочнокислі бактерії, включаючи бактерії видів Lactobacillus sp. і Streptococcus thermophilus, звичайно постачаються в молочну промисловість у вигляді або заморожених, або сублімованих культур для розмноження виробничої закваски або у вигляді так званих "Direct Vat Set" (DVS) культур, призначених для прямого інокулювання в ферментаційну посудину або бак для виробництва молочного продукту, такого як ферментований молочний продукт. Такі культури загалом називаються "стартові культури" або "закваски". Термін "молоко" потрібно розуміти як секрецію молока, що одержується за допомогою доїння будь-якого ссавця, такого як корови, вівці, кози, буйволи або верблюди. У переважному варіанті здійснення молоко є коров'ячим молоком. Термін молоко також включає розчини білок/жир, виготовлені з рослинних матеріалів, наприклад, соєве молоко. Термін "молочний субстрат" може бути будь-яким сирим і/або переробленим молочним матеріалом, який може бути схильний до ферментації згідно зі способом за винаходом. Таким чином, придатні молочні субстрати включають, але не обмежені ними, розчини/суспензії будьяких молочних або подібних молочним продуктів, що містять білок, такі як цільне або молоко зниженої жирності, знежирене молоко, пахта, відновлене з порошку молоко, конденсоване молоко, висушене молоко, сироватка, сироватковий пермеат, лактоза, маточна рідина з кристалізації лактози, концентрат сироваткового білка або вершки. Очевидно, молочний субстрат може походити з будь-якого ссавця, наприклад, бути по суті чистим молоком ссавця або відновленим молочним порошком. Переважно, щонайменше частина білка в молочному субстраті є білками, які зустрічаються в природі в молоці, такими як казеїн або сироватковий білок. Однак частина білка може бути білками, які не є такими, що зустрічаються в природі в молоці. Перед ферментацією молочний субстрат може бути гомогенізований і пастеризований згідно зі способами, відомими в даній галузі. "Гомогензовані" в значенні, що застосовується в даному документі, означає інтенсивне змішування для одержання розчинної суспензії або емульсії. Якщо гомогенізацію виконують перед ферментацією, вона може бути виконана для того, щоб розділити молочний жир на дрібніші розміри, так щоб він більше не відділявся від молока. Це може бути виконано пропущенням молока під високим тиском через маленькі отвори. "Пастеризація" в значенні, що застосовується в даному документі, означає обробку молочного субстрату для зниження або усунення наявності живих організмів, таких як мікроорганізми. Переважно, пастеризація здійснюється збереженням заданої температури протягом заданого проміжку часу. Задані температури звичайно досягаються за допомогою нагрівання. Температура і тривалість можуть бути вибрані для того, щоб убити або інактивувати деякі бактерії, такі як шкідливі бактерії. Швидке охолоджування може бути наступним етапом. "Ферментація" в способах даного винаходу означає перетворення вуглеводів у спирти або кислоти за допомогою впливу мікроорганізму. Переважно, ферментація в способах винаходу містить перетворення лактози в молочну кислоту. Ферментаційні процеси, які повинні бути застосовані у виробництві ферментованих молочних продуктів, добре відомі, і фахівець в даній галузі буде знати, як вибрати придатні умови процесу, такі як температура, кисень, кількість і характеристики мікроорганізму(ів) і час процесу. Очевидно, умови ферментації є вибраними так, щоб сприяти виконанню даного винаходу, тобто, для одержання молочного продукту в твердій або рідкій формі (ферментований молочний продукт). У даному контексті йогуртова стартова культура єбактеріальною культурою, яка містить щонайменше один штам Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus і щонайменше один штам Streptococcus thermophilus. Відповідно до цього "йогурт" стосується ферментованого молочного продукту, що одержується за допомогою інокулювання і ферментування молока з композицією, що містить штам Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus і штам Streptococcus thermophilus. Під "текстурою" або "відчуттям у роті" мається на увазі фізична і хімічна взаємодія продукту у роті. Способи для визначення текстури молока містять вимірювання дотичного напруження (в'язкість), гелеподібну загущуваність і тягучість ферментованого молока, є легко доступними і відомими в даній галузі і проілюстровані в даному документі. У контексті даного документа терміни "дотичне напруження", "гелеподібна загущуваність" і "тягучість" означають в'язкість. 3 UA 114511 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В'язкість (одиницею вимірювання є Па·з) визначається як дотичне напруження (Па)/швидкість зсуву (1/з). Величина дотичного напруження вважається в даному документі стандартною при швидкості зсуву=300 1/з. Сенсорні експерименти продемонстрували (дані не наведені), що найкраща кореляція між реологічними вимірюваннями і сенсорною в'язкістю/густиною у роті виявлені при застосуванні в'язкості, що вимірюється при швидкості зсуву 300 1/з. Термін "гелеподібна загущуваність" або "гелеподібна твердість" є мірою того, як довго структура ферментованого молочного продукту зберігається при піддаванні тиску, і вимірюється в 1 Гц (Па). Термін "тягучість" в значенні, що застосовується в даному документі, стосується формування струн і ниток і зв'язувальної здатності в ферментованому молочному продукті. Тягучість визначена і виміряна, як описано в Int. Dairy J. 16(2); 111-118 (Folkenberg et at. 2006). Термін "стійкий до ампіциліну" в даному документі означає, що конкретний мутований бактеріальний штам не знищений, або знищується значно повільніше порівняно з відповідним немутованим штамом, з якого мутований штам одержаний в присутності вказаного антибіотика в культуральному середовищі. Залежно від концентрації антибіотичної сполуки в культуральному середовищі стійкість може також бути виражена за зміненими ростовими властивостями мутованих і немутованих штамів. Наприклад, низька концентрація антибіотика в культуральному середовищі буде запобігати або значно знижувати ріст немутованих штамів, тоді як ріст мутованих штамів не схильний до впливу. Немутовані штами, які можуть бути застосовані як чутливі референсні штами в оцінці стійкості, переважно містять штам CHCC13995. Штам молочнокислих бактерій, який є стійким до антибіотика ампіциліну, в даному документі визначається як штам молочнокислих бактерій, для якого кількість антибіотика ампіциліну, яка знижує виміряний з OD600 ріст після 20 годин росту при 37 °C на 20 % в середовищі, придатному для росту штаму молочнокислих бактерій (наприклад, MRS середовище для штамів Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus і M17, що містить 2 % (мас./об.) лактози, для Streptococcus thermophilus) порівняно з виміряним з OD 600 ростом в середовищі без антибіотика ампіциліну, становить вище, ніж 400 нг/мл. Мутантний штам молочнокислих бактерій, який є стійким до ампіциліну, в даному документі додатково визначений тим, що величина мінімальної інгібуючої концентрації (МІК), яка вважається в Е-тесті щонайменше на 1 інкремент вище для мутантного штаму молочнокислих бактерій, ніж для материнського штаму, з якого одержаний мутантний штам. У контексті даного документа термін "мутант" потрібно розуміти як штам, одержаний з, або штам, який може бути одержаний зі штаму за винаходом (або материнського штаму) за допомогою, наприклад, генетичної інженерії, радіації і/або хімічної обробки. Мутант може також бути мутантом, який виникає спонтанно. Переважно, щоб мутант був функціонально еквівалентним мутантом, наприклад, мутант, який має по суті такі ж або поліпшені властивості (наприклад, відносно в'язкості, гелеподібної загущуваності і тягучості), як материнський штам. Такий мутант є частиною даного винаходу. Головним чином, термін "мутант" стосується штаму, що одержується за допомогою піддавання штаму за винаходом будь-якій мутагенезуючій обробці, що стандартно застосовується, включаючи обробку з хімічним мутагеном, таким як етанметансульфонат (EMS) або N-метил-N'-нітро-N-нітрогуанідин (NTG), УФ-випромінювання, або мутанта, який виникає спонтанно. Можливо, щоб мутант був схильний до декількох мутагенезуючих обробок (під одиничною обробкою потрібно розуміти один мутагенез з подальшим етапом скринінгу/відбору), але в цей час переважно, щоб здійснювалося не більше 20, або не більше 10, або не більше 5, обробок (або етапів скринінгу/відбору). У переважному в цей час мутантові менше 1 %, менше 0,1, менше 0,01, менше 0,001 % або навіть менше ніж 0,0001 % нуклеотидів в бактеріальному геномі були заміщені іншим нуклеотидом або делетовані порівняно з материнським штамом. У контексті даного документа під терміном "варіант" потрібно розуміти штам, який є функціонально еквівалентним штаму винаходу, наприклад, що має по суті такі ж або поліпшені властивості, наприклад, відносно в'язкості, гелеподібної загущеності і тягучості. Такі варіанти, які можуть бути ідентифіковані із застосуванням придатних технологій скринінгу, є частиною даного винаходу. Застосування термінів в однині і подібних позначень в контексті опису винаходу (головним чином в контексті подальшої формули винаходу) потрібно тлумачити, як позначення як однини, так і множини, якщо в даному документі особливо не вказане інше або якщо це очевидно суперечить контексту. Терміни що "містить", "що має", "що включає" і "що містить" потрібно тлумачити, як необмежувальні терміни (тобто, які позначають "що включає, але не обмежений 4 UA 114511 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ними"), якщо не вказане інше. Перелік діапазонів величин в даному документі мається на увазі тільки як скорочений спосіб посилання індивідуально на кожну окрему величину, що потрапляє в діапазон, якщо в даному документі особливо не вказане інше, і кожна окрема величина включена в опис, як якби вона була індивідуально наведена в даному документі. Всі способи, описані в даному документі, можуть бути виконані в будь-якому придатному порядку, якщо в даному документі особливо не вказане інше або якщо це іншим чином очевидно суперечить контексту. Застосування будь-яких і всіх прикладів або ілюстративних формулювань (наприклад, "такий як"), представлених в даному документі, передбачене тільки для кращого роз'яснення винаходу і не має на увазі обмеження об'єму винаходу, якщо особливо не вказане інше. Ніякі формулювання в описі не повинні бути витлумачені, як такі, що означають якийнебудь елемент, не вказаний в формулі винаходу елемент як необхідний для втілення винаходу на практиці. Втілення і аспекти винаходу Як обговорюється в даному документі, було виявлено, що високий процент молочнокислих бактерій, які є стійкими до антибіотика ампіциліну, приводить до збільшеної текстури при вирощуванні в молоці порівняно з комерційно релевантним текстуруючим штамом. Фахівець в даній галузі визнає, що інші антибіотики з тим же механізмом дії або тими ж мішенями, як ампіцилін, можуть бути застосовані окремо або в комбінації з ампіциліном для виділення мутантів описаного в даному документі типу. Даний винахід, отже, також охоплює застосування таких інших функціонально еквівалентних антибіотиків, таких як інші інгібітори DDтранспептидази. Такі антибіотики включають, але не обмежені ними, амоксицилін, пеніцилін G, прокаїн-пеніцилін, бензатин-пеніцилін і пеніцилін V. У першому аспекті даний винахід стосується штаму молочнокислих бактерій, що характеризується тим, що: (i) штам молочнокислих бактерій стійкий до антибіотика ампіциліну і/або іншого антибіотика, який інгібує фермент DD-транспептидазу, що визначається тим, що кількість антибіотика, яка знижує виміряний з OD600 ріст, після 20 годин росту при 37 °C, на 20 % в середовищі, придатному для росту штаму молочнокислих бактерій, порівняно з виміряним з OD 600 ростом в середовищі без антибіотика, становить вище, ніж 400 нг/мл; і (ii) час витікання з полістиролової 25-мл піпетки 28 мл повножирного коров'ячого молока, що 4 містить 2 % (мас./об.) сухого знежиреного молока, інокульованого з щонайменше 10 КУО/мл штаму молочнокислих бактерій і яке підкислялося при 37 °C протягом 20 годин, становить щонайменше 50 секунд. Переважно, антибіотиком на етапі (i) є ампіцилін. Як аналіз для визначення кількості антибіотика, який знижує виміряний з OD 600 ріст на 20 % на етапі (i), так і аналіз для визначення часу витікання 28 мл підкисленого молока з полістиролової 25-мл піпетки на етапі (ii) оснований на відомих комерційно доступних стандартних елементах. Фахівець в даній галузі буде знати про стандартне середовище, придатне для росту штаму молочнокислих бактерій, включаючи MRS середовище, придатне для росту штамів Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus і M17 середовище + 2 % (мас./об.) лактози, придатне для росту штамів Streptococcus thermophilus, як проілюстровано в даному документі. Відповідно, на основі докладного опису аналізів в даному документі (див., наприклад, приклад 2) фахівець в даній галузі в рутинному порядку здатний повторити ці аналізи для об'єктивного визначення того, якщо конкретний цільовий штам молочнокислих бактерій відповідає стійкості до ампіциліну і/або іншому антибіотика, який інгібує DD-транспептидазу (на етапі (i)), і поліпшує текстуруючі властивості (на етапі (ii)). У переважному варіанті здійснення штам молочнокислих бактерій відібраний з групи, яка складається з Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus і Streptococcus thermophilus. У більш переважному варіанті здійснення штам молочнокислих бактерій є штамом Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. У переважних варіантах здійснення кількість антибіотика, яка знижує виміряний з OD 600 ріст на 20 % на етапі (i), становить значення вище, ніж 500 нг/мл, таку як вище, ніж 600 нг/мл, таку як вище, ніж 700 нг/мл. В інших переважних варіантах здійснення час витікання на етапі (ii) становить щонайменше 60 секунд, такий як щонайменше 70 секунд, такий як щонайменше 80 секунд, такий як щонайменше 90 секунд, такий як щонайменше 100 секунд, такий як щонайменше 110 секунд. У другому аспекті даний винахід стосується штаму молочнокислих бактерій, що характеризується тим, що: 5 UA 114511 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (i) штам молочнокислих бактерій стійкий до антибіотика ампіциліну і/або іншого антибіотика, який інгібує фермент DD-транспептидазу, що визначається тим, що мінімальна інгібуюча концентрація (МІК) для мутантного штаму молочнокислих бактерій становить щонайменше на 1 інкремент вище в Е-тесті, ніж МІК для материнського штаму, з якого одержаний штам молочнокислих бактерій; і (ii) час витікання з полістиролової 25-мл піпетки 28 мл повножирного коров'ячого молока, що 4 містить 2 % (мас./об.) сухого знежиреного молока, інокульованого з щонайменше 10 КУО/мл мутантного штаму молочнокислих бактерій і яке підкислялося при 37 °C протягом 20 годин, є щонайменше подвоєним часом витікання з полістиролової 25-мл піпетки 28 мл повножирного коров'ячого молока, що містить 2 % (мас./об.) сухого знежиреного молока, інокульованого з 4 щонайменше 10 КУО/мл материнського штаму і яке підкислялося при 37 °C протягом 20 годин. Переважно, антибіотик на етапі (i) є ампіциліном. Як Е-тест на етапі (i), так і аналіз для визначення часу витікання 28 мл підкисленого молока з полістиролової 25-мл піпетки на етапі (ii) оснований на відомих комерційно доступних стандартних елементах. Відповідно, на основі докладного опису аналізів у даному документі (див., наприклад, приклад 1 і приклад 2) фахівець в даній галузі здатний в рутинному порядку повторити ці аналізи для об'єктивного визначення того, якщо особливий штам цільових молочнокислих бактерій відповідає стійкості до ампіциліну і/або іншому антибіотика, який інгібує DDтранспептидазу (на етапі (i)), і має поліпшені текстуруючі властивості (на етапі (ii)). У переважному варіанті здійснення штам молочнокислих бактерій відібраний з групи, яка складається з Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus і Streptococcus thermophilus. У більш переважному варіанті здійснення штам молочнокислих бактерій є штамом Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. У переважних варіантах здійснення МІК для мутантного штаму молочнокислих бактерій на етапі (i) становить значення щонайменше на 2 інкремента, таке як щонайменше на 3 інкремента, як щонайменше на 4 інкремента, як щонайменше на 5 інкрементів, більш високе в Е-тесті, ніж МІК для материнського штаму. В інших переважних варіантах здійснення час витікання на етапі (ii) становить щонайменше 50 секунд, такий як щонайменше 60 секунд, такий як щонайменше 70 секунд, такий як щонайменше 80 секунд, такий як щонайменше 90 секунд, такий як щонайменше 100 секунд, такий як щонайменше 110 секунд. Третій аспект даного винаходу направлений на штам молочнокислих бактерій, відібраний з групи, яка складається зі штаму Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC15466, який депонований в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen під номером доступу DSM 25852, і мутанти і варіанти, одержані з нього. Для фахівця в даній галузі очевидно, що за допомогою застосування депонованого штаму як стартового матеріалу, фахівець в даній галузі може в рутинному порядку за допомогою загальноприйнятого мутагенезу або технологій повторного виділення одержувати додаткові мутанти або їх похідні, які зберігають описані в даному документі релевантні особливості і переваги. Відповідно термін "мутанти, одержані з нього" стосується мутантних штамів, що одержуються за допомогою застосування депонованого штаму як стартового матеріалу, і де мутанти зберігають необхідну властивість депонованого штаму, де вказана необхідна властивість полягає в тому, що час витікання 28 мл повножирного коров'ячого молока, що 4 містить 2 % (мас./об.) сухого знежиреного молока, інокульованого з щонайменше 10 КУО/мл штаму молочнокислих бактерій і яке підкислялося при 37 °C протягом 20 годин, з полістиролової 25-мл піпетки становить щонайменше 50 секунд. Четвертий аспект даного винаходу стосується композиції, яка містить від 104 до 1014 КУО/г штаму молочнокислих бактерій за будь-яким з пп. 1-6. У переважному варіанті здійснення композиція містить щонайменше один штам Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Переважно, композиція містить щонайменше один штам Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus і щонайменше один штам Streptococcus thermophilus. В іншому переважному варіанті здійснення композиція застосовна як стартова культура. У ще одному переважному варіанті здійснення композиція має заморожену, сублімовану або рідку форму. Штам молочнокислих бактерій (який стійкий до ампіциліну і/або іншого антибіотика, який інгібує DD-транспептидазу і який має поліпшені текстуруючі особливості) відповідно до даного винаходу може переважно бути застосований для приготування ферментованого молочного продукту. Доза і введення можуть бути здійснені відповідно до відомого рівня техніки. 6 UA 114511 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Додатково, релевантні етапи для виготовлення ферментованого молочного продукту в даному документі можуть бути виконані відповідно до відомого рівня техніки. Такі інші релевантні етапи для приготування ферментованих молочних продуктів є добре відомими рутинними етапами для фахівця. Відповідно, п'ятий аспект даного винаходу стосується способу приготування ферментованого молочного продукту, що містить ферментований молочний субстрат зі штамом молочнокислих бактерій відповідно до першого, другого або третього аспекту винаходу або композиції відповідно до четвертого аспекту даного винаходу. Шостий аспект стосується ферментованого молочного продукту, що одержується за допомогою способу відповідно до четвертого аспекту винаходу. Сьомий аспект стосується ферментованого молочного продукту, що містить штам молочнокислих бактерій відповідно до першого, другого або третього аспекту винаходу або композицію відповідно до четвертого аспекту винаходу. Восьмий аспект даного винаходу направлений на застосування штаму молочнокислих бактерій відповідно до першого, другого або третього аспекту винаходу або композиції відповідно до четвертого аспекту винаходу для приготування молочного продукту. У переважному варіанті здійснення молочний продукт є ферментованим молочним продуктом. Переважно, ферментований молочний продукт є йогуртом. Дев'ятий аспект даного винаходу стосується способу одержання штаму молочнокислих бактерій, при цьому вказаний спосіб містить: a) відбір і виділення з сукупності штамів молочнокислих бактерій сукупності штамів молочнокислих бактерій, які є стійкими до антибіотика ампіциліну і/або до іншого антибіотика, який інгібує фермент DD-транспептидазу, що визначається тим, що кількість антибіотика, яка знижує виміряний з OD600 ріст після 20 годин росту при 37 °C на 20 % в середовищі, придатному для росту штаму молочнокислих бактерій, порівняно із ростом в середовищі без антибіотика, становить вище, ніж 400 нг/мл; і b) відбір і виділення з сукупності штамів молочнокислих бактерій, які є стійкими до ампіциліну і/або до іншого антибіотика, який інгібує фермент DD-транспептидазу на етапі a), штаму молочнокислих бактерій, де час витікання 28 мл повножирного коров'ячого молока, що 4 містить 2 % (мас./об.) сухого знежиреного молока, інокульованого з щонайменше 10 КУО/мл штаму молочнокислих бактерій і яке підкислялося при 37 °C протягом 20 годин, з полістиролової 25-мл піпетки становить щонайменше 50 секунд. Переважно, спосіб містить: a) відбір і виділення з сукупності штамів молочнокислих бактерій сукупності штамів молочнокислих бактерій, які є стійкими до антибіотика ампіциліну, що визначається тим, що кількість ампіциліну, яка знижує виміряний з OD600 ріст після 20 годин росту при 37 °C на 20 % в середовищі, придатному для росту штаму молочнокислих бактерій, порівняно із ростом в середовищі без ампіциліну, становить вище, ніж 400 нг/мл; і b) відбір і виділення з сукупності штамів молочнокислих бактерій, які є стійкими до антибіотика ампіциліну на етапі a), штаму молочнокислих бактерій, де час витікання 28 мл повножирного коров'ячого молока, що містить 2 % (мас./об.) сухого знежиреного молока, 4 інокульованого з щонайменше 10 КУО/мл штаму молочнокислих бактерій і яке підкислялося при 37 °C протягом 20 годин, з полістиролової 25-мл піпетки становить щонайменше 50 секунд. У переважному варіанті здійснення штам молочнокислих бактерій відібраний з групи, яка складається з Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus і Streptococcus thermophilus. У більш переважному варіанті здійснення штам молочнокислих бактерій є штамом Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. У переважних варіантах здійснення кількість антибіотика, яка знижує виміряний з OD600 ріст на 20 % за пунктом (i), становить вище, ніж 500 нг/мл, таку як вище, ніж 600 нг/мл, таку як вище, ніж 700 нг/мл. В інших переважних варіантах здійснення час витікання на етапі (ii) становить щонайменше 60 секунд, такий як щонайменше 70 секунд, такий як щонайменше 80 секунд, такий як щонайменше 90 секунд, такий як щонайменше 100 секунд, такий як щонайменше 110 секунд. Десятий аспект направлений на спосіб одержання штаму молочнокислих бактерій, при цьому вказаний спосіб містить: a) надання материнського штаму молочнокислих бактерій; b) відбір і виділення сукупності мутантних штамів молочнокислих бактерій, які є стійкими до антибіотика ампіциліну і/або іншого антибіотика, який інгібує фермент DD-транспептидазу, що визначається тим, що мінімальна інгібуюча концентрація (МІК) для мутантних штамів 7 UA 114511 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 молочнокислих бактерій становить щонайменше на 1 інкремент вище в Е-тесті, ніж МІК для материнського штаму, з якого одержані мутантні штами молочнокислих бактерій; і c) відбір і виділення з сукупності мутантних штамів молочнокислих бактерій, які є стійкими до ампіциліну і/або до іншого антибіотика, який інгібує фермент DD-транспептидазу на етапі b), мутантного штаму молочнокислих бактерій, де час витікання з полістиролової 25-мл піпетки 28 мл повножирного коров'ячого молока, що містить 2 % (мас./об.) сухого знежиреного молока, 4 інокульованого з щонайменше 10 КУО/мл мутантного штаму молочнокислих бактерій і яке підкислялося при 37 °C протягом 20 годин, становить щонайменше подвоєний час витікання з полістиролової 25-мл піпетки 28 мл повножирного коров'ячого молока, що містить 2 % (мас./об.) 4 сухого знежиреного молока, інокульованого з щонайменше 10 КУО/мл материнського штаму і яке підкислялося при 37 °C протягом 20 годин. Переважно, спосіб містить: a) надання материнського штаму молочнокислих бактерій; b) відбір і виділення сукупності мутантних штамів молочнокислих бактерій, які є стійкими до антибіотика ампіциліну, що визначається тим, що мінімальна інгібуюча концентрація (МІК) для мутантних штамів молочнокислих бактерій становить щонайменше на 1 інкремент вище в Етесті, ніж МІК для материнського штаму, з якого одержані мутантні штами молочнокислих бактерій; і c) відбір і виділення з сукупності мутантних штамів молочнокислих бактерій, які є стійкими до ампіциліну на етапі b), мутантного штаму молочнокислих бактерій, де час витікання з полістиролової 25-мл піпетки 28 мл повножирного коров'ячого молока, що містить 2 % (мас./об.) 4 сухого знежиреного молока, інокульованого з щонайменше 10 КУО/мл мутантного штаму молочнокислих бактерій і яке підкислялося при 37 °C протягом 20 годин, становить щонайменше подвоєний час витікання з полістиролової 25-мл піпетки 28 мл повножирного коров'ячого молока, що містить 2 % (мас./об.) сухого знежиреного молока, інокульованого з 4 щонайменше 10 КУО/мл материнського штаму і яке підкислялося при 37 °C протягом 20 годин. У переважному варіанті здійснення материнський штам молочнокислих бактерій відібраний з групи, яка складається з Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus і Streptococcus thermophilus. У більш переважному варіанті здійснення штам молочнокислих бактерій є штамом Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. У ще більш переважному варіанті здійснення даного винаходу материнський штам є штамом Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC13995, який був депонований в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen з номером доступу DSM 24021. У переважних варіантах здійснення МІК для мутантного штаму молочнокислих бактерій на етапі (i) становить значення щонайменше на 2 інкремента, таке як щонайменше на 3 інкремента, як щонайменше на 4 інкремента, як щонайменше на 5 інкрементів, більш високе в Е-тесті, ніж МІК для материнського штаму. В інших переважних варіантах здійснення час витікання на етапі (ii) з полістиролової 25-мл піпетки 28 мл повножирного коров'ячого молока, що містить 2 % (мас./об.) сухого знежиреного 4 молока, інокульованого з щонайменше 10 КУО/мл мутантного штаму молочнокислих бактерій і яке підкислялося при 37 °C протягом 20 годин, становить щонайменше 50 секунд, такий як щонайменше 60 секунд, такий як щонайменше 70 секунд, такий як щонайменше 80 секунд, такий як щонайменше 90 секунд, такий як щонайменше 100 секунд, такий як щонайменше 110 секунд. В одинадцятому аспекті даний винахід стосується штаму молочнокислих бактерій, що одержується за допомогою способу відповідно до восьмого або дев'ятого аспекту винаходу. Даний винахід додатково проілюстрований наступними необмежувальними прикладами. ПРИКЛАДИ Матеріали: Середовища: Придатні середовища для Streptococcus thermophilus містять відоме агарове середовище М17, що має наступну композицію: агар 12,75 г/л аскорбінова кислота 0,5 г/л пептон казеїну (трипсиновий) 2,5 г/л двонатрієвий β-гліцерофосфат пентагідрат 19 г/л гідрат сульфату магнію 0,25 г/л м'ясний екстракт 5 г/л м'ясний пептон (пептичний) 2,5 г/л соєвий пептон (папаїновий) 5 г/л дріжджовий екстракт 2,5 г/л 8 UA 114511 C2 5 10 15 20 25 30 35 і бульйонне середовище M17 з такою композицією: аскорбінова кислота 0,5 г/л лактоза 5 г/л сульфат магнію 0,25 г/л м'ясний екстракт 5 г/л м'ясний пептон (пептичний) 2,5 г/л гліцерофосфат натрію 19 г/л соєвий пептон (папаїновий) 5 г/л триптон 2,5 г/л дріжджовий екстракт 2,5 г/л кінцевий pH 7,0±0,2 (25 °C)) Ці середовища звичайно застосовують після додавання 20 г/л лактози (2 % мас./об.). Для Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus придатні середовища містять відоме середовище MRS. Агарове середовище MRS має наступну композицію: Бактопротеозопептон No. 3 10 г/л Бактом'ясний екстракт 10 г/л Бактодріжджовий екстракт 5 г/л Декстроза 20 г/л Комплекс сорбітанмоноолеат 1 г/л Цитрат амонію 2 г/л Ацетат натрію 5 г/л Сульфат магнію 0,1 г/л Сульфат марганцю 0,05 г/л Гідроортофосфат калію 2 г/л Бактоагар 15 г/л і бульйонне MRS середовище має таку композицію: Бактопротеозопептон No.3 10 г/л Бактом'ясний екстракт 10 г/л Бактодріжджовий екстракт 5 г/л Декстроза 20 г/л Комплекс сорбітанмоноолеат 1 г/л Цитрат амонію 2 г/л Ацетат натрію 5 г/л Сульфат магнію 0,1 г/л Сульфат марганцю 0,05 г/л Гідроортофосфат калію 2 г/л Кінцевий pH 6,5±0,2 (25 °C)) Як відомо фахівцеві, середовище М17 є середовищем, яке вважається придатним для росту Streptococcus thermophilus, і MRS середовище є середовищем, яке вважається придатним для росту Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. У даному контексті і як це буде зрозуміло фахівцем, конкретний концентрат середовищ M17 і MRS може бути одержаний у різних постачальників і незалежно від конкретного постачальника буде (в межах стандартної невизначеності вимірювань) одержаний такий же релевантний даному документу результат стійкості до ампіциліну релевантного даному документу цільового штаму. ПРИКЛАД 1: Селекційний аналіз стійкості до ампіциліну Спосіб проілюстрований із застосуванням штаму Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Для того, щоб здійснити селекційний аналіз стійкості до ампіциліну з Streptococcus thermophilus, замість середовища MRS повинне бути застосоване середовище М17 з лактозою, доданою до 2 % мас./об. Цільовий штам Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus інокулювали в 10 мл бульйонного середовища MRS і вирощували протягом щонайменше 20 годин при 37 °C при анаеробних умовах. Ватну паличку занурювали в культуру і застосовували, щоб зробити посів штрихом на всю поверхню чашки MRS-агаром (90 мм в діаметрі). Стрижень з ампіциліновим Е-тестом (0,016-256 мкг/мл) для тестування антимікробної чутливості (Biomerieux, cat. #501558) вміщували зверху агару, і чашку інкубували протягом не більше 24 годин при 37 °C при анаеробних умовах. Мінімальна інгібуюча концентрація (МІК) ампіциліну є найменшою концентрацією, яка буде інкубувати помітний ріст посіяного на чашку штаму, і зчитується в точці, де еліптична зона інгібування перетинає смужку з Е-тестом. 9 UA 114511 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Клітина Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, яка мала збільшену стійкість до ампіциліну, як указано в даному документі, в даному документі визначається як клітина Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, де зчитувана величина МІК становить щонайменше на 1 інкремент вище, як зафіксовано Е-смужкою, ніж у материнського штаму. Клітини, які можуть відповідати цим критеріям збільшеної стійкості до ампіциліну, в даному документі визначені як клітини, які є стійкими до ампіциліну в аналізі стійкості до ампіциліну цього прикладу 1. Висновок: На основі селекційного аналізу стійкості до ампіциліну цього прикладу 1 для конкретного цільового штаму (наприклад, штам з релевантного комерційного продукту) фахівець в даній галузі може в рутинному порядку тестувати те, якщо цей особливий цільовий штам має релевантну стійкість до ампіциліну за даним документом. ПРИКЛАД 2: Застосування ампіциліну для виділення мутантів Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus з поліпшеними реологічними властивостями Штами: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC13995 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC15466 (стійкий до ампіциліну мутант CHCC13995) Виділення мутанта: Для того, щоб виділити стійкі до ампіциліну мутанти штаму Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC13995, клітини, одержані з вирощування одиничної колонії, інокулювали анаеробно в 10 мл бульйону MRS, що містить одну з наступних кількостей ампіциліну, 0 нг/мл, 100 нг/мл, 200 нг/мл, 300 нг/мл, 400 нг/мл, 500 нг/мл, 600 нг/мл або 700 нг/мл, і вирощували протягом щонайменше 20 годин при 37 °C. Після 20 годин росту вимірювали OD600 для всіх зразків. Як правило, концентрація ампіциліну, яка знижує виміряний з OD 600 анаеробний ріст Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus на щонайменше 20 % порівняно із ростом в середовищі MRS без ампіциліну (тобто, з 0 нг/мл ампіциліну), становить вище, ніж 300 нг/мл. Культури, де концентрація ампіциліну становила 500 нг/мл, розбавляли і висіювали на чашки з MRS-агаром без ампіциліну і потім інкубували анаеробно протягом щонайменше 20 годин при 37 °C. Потім вибирали колонії і скринували на анаеробний ріст при 37 °C в мікротитрувальних чашках в присутності 500 нг/мл ампіциліну. Як правило, 25 % одержаних в результаті колоній ідентифікували як швидко зростаючі в присутності ампіциліну. Вони були вибрані для подальшого дослідження. Відібрані стійкі до ампіциліну мутанти додатково очищували і тестували на їх здатність рости в молоці. Під час цієї роботи спостерігали, що деякі з мутантів продукували значно більше текстури, ніж батьківський штам при цих умовах. Скринінг в'язкості: Реологічний скринінговий аналіз виконували із застосуванням простого піпеточного тестування в'язкості. У цьому тесті стійкі до ампіциліну мутанти попередньо тестували на їх в'язкість (перед справжнім реологічним тестуванням) вимірюванням часу витікання з полістиролової 25-мл піпетки (CELLSTAR®), завантаженої з 28 мл підкисленого молока: Для кожного зразка повножирне коров'яче молоко, до якого було додано 2 % (мас./об.) сухого знежиреного молока, інокулювали стійким до ампіциліну мутантом в кількості щонайменше 104 клітин на мл молока, і залишали підкислюватися протягом 20 годин при 37 °C. Перед тестом піпетуванням підкислене молоко обережно гомогенізували розмішуванням перед завантаженням в полістиролову 25-мл піпетку до верху (28 мл) і для кожного зразка час витікання з піпетки вимірювали 3 рази. У таблиці 1 наведений результат тестування в'язкості з піпеткою для молока, ферментованого при 37 °C протягом 20 годин 21 стійким до ампіциліну мутантом. Результати демонструють, що більшість з цих мутантів приводили до більш високої в'язкості, ніж материнський штам. 6 з 21 стійкого до ампіциліну мутанта приводили в результаті до часу витікання, який в два рази більше, ніж у материнського штаму, і приблизно 25 % стійких до ампіциліну мутантів приводило в результаті до часу витікання щонайменше 50 секунд. Мутант 18 (amp mut 18) має особливо високий час витікання. Цей похідний мутант позначали CHCC15466 і застосовували для реологічного тесту, описаного в прикладі 3. 55 10 UA 114511 C2 5 10 15 20 25 ВИСНОВОК Стійкі до ампіциліну мутанти Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, описані в даному документі, можуть бути включені в культуру, таку як стартова культура, яка продукує необхідний високий рівень текстури. ПРИКЛАД 3: Застосування стійких до ампіциліну мутантів Streptococcus thermophilus і Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus для приготування ферментованого молочного продукту. Реологія: Реологічні аналізи здійснювали на реометрі StressTech ReoLogica Instruments AB, Sweden, після вирощування в повножирному коров'ячому молоці з додаванням 2 % (мас./об.) сухого знежиреного молока. Приклади, описані вище, ілюструють поліпшену текстуру ферментованих видів молока, ферментованих із відібраними стійкими до ампіциліну мутантами у вигляді одиничної культури. У цьому прикладі автори будуть аналізувати текстуру ферментованих видів молока у вигляді йогуртів, тобто, зі штамами Streptococcus thermophilus і Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus, що застосовуються в комбінації. Для того, щоб підтвердити поліпшений текстуруючий ефект деяких з мутантів, йогурти готували з комбінаціями штаму CHCC4895 Streptococcus thermophilus дикого типу, змішаного зі штамом CHCC13995 Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus дикого типу і стійким до ампіциліну штамом CHCC15466, відповідно. Йогуртові культури змішували в співвідношенні 9:1 Streptococcus thermophilus:Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus й інокулювали в повножирне коров'яче молоко з додаванням 2 % сухого знежиреного молока і ферментувати при 40 °C до кінцевого pH 4,50. Наступні суміші аналізували після 5 днів зберігання при 4 °C із застосуванням реометра Stresstech. Тягучість вимірювали, як описано в Folkenberg et al. (2006. Int. Dairy J. 16(2); 111-118). Результати представлені в таблиці 2. 11 UA 114511 C2 5 10 15 20 Результати очевидно демонструють, що поліпшена текстуруюча властивість стійкого до ампіциліну мутанта CHCC15466, що спостерігається з одиничними культурами, зберігалася також в присутності штаму Streptococcus thermophilus. Хоча дотичне напруження тільки злегка змінювалося, гелеподібна загущуваність і тягучість були поліпшеними значно, коли мутант застосовувався замість штаму Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus дикого типу для йогуртової ферментації. ВИСНОВОК Стійкий до ампіциліну мутант Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, описаний в даному документі, може бути включений в культуру, таку як стартова культура, яка продукує необхідний високий рівень текстури в ферментованому молочному продукті, такому як йогурт. Депонування і експертний дозвіл Штам Streptococcus thermophilus CHCC4895 депонували в Deutsche Sammlung von Mikrooganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Inhoffenstr. 7B, D-38124 Брауншвейг, Німеччина 29 березня 2007 під номером доступу DSM 19242. Штам Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC13995 депонували в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Брауншвейг, Німеччина 22 вересня 2010 під номером доступу DSM 24021. Штам Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CHCC15466 депонували в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Брауншвейг, Німеччина 3 квітня 2012 під номером доступу DSM 25852 Депонування здійснювали згідно з умовами Будапештського договору про міжнародне визнання депонування мікроорганізмів для цілей патентної процедури. Вимога заявника полягає в тому, що зразок депонованих мікроорганізмів може бути доступний тільки експерту, схваленому заявником. 25 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 30 35 40 45 50 55 60 1. Штам молочнокислих бактерій для ферментації молока, де штам молочнокислих бактерій являє собою Lactobacillus delbrueckii, який характеризується тим, що: (і) штам молочнокислих бактерій стійкий до антибіотика ампіциліну, що визначається тим, що кількість ампіциліну, яка знижує виміряний з OD600 ріст після 20 годин росту при 37 °C на 20 % в середовищі, придатному для росту штаму молочнокислих бактерій, порівняно з виміряним з OD600 ростом в середовищі без ампіциліну, становить вище ніж 400 нг/мл; і (іі) час витікання 28 мл повножирного коров'ячого молока, що містить 2 % (мас./об.) сухого 4 знежиреного молока, яке інокульоване зі щонайменше 10 КУО/мл штаму молочнокислих бактерій і підкислювалося при 37 °C протягом 20 годин, з полістиролової 25-мл піпетки становить щонайменше 50 секунд. 2. Штам молочнокислих бактерій за п. 1, де кількість ампіциліну, яка знижує виміряний з OD600 ріст на 20 % на етапі (і), вища ніж 500 нг/мл. 3. Штам молочнокислих бактерій відповідно до будь-якого з попередніх пп., де час витікання на етапі (іі) становить щонайменше 100 секунд. 4. Штам молочнокислих бактерій, відібраний з групи, яка складається зі штаму СНСС15466 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, який депонували в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen під номером доступу DSM 25852, і мутантів, що одержуються за допомогою застосування депонованого штаму як стартового матеріалу, і де мутанти зберігають необхідну властивість депонованого штаму, де вказана необхідна властивість полягає в тому, що час витікання 28 мл повножирного коров'ячого молока, що містить 2 % 4 (мас./об.) сухого знежиреного молока, яке інокульоване зі щонайменше 10 КУО/мл мутантів і підкислювалося при 37 °C протягом 20 годин, з полістиролової 25-мл піпетки становить щонайменше 50 секунд. 4 14 5. Композиція, яка містить від 10 до 10 КУО/г штаму молочнокислих бактерій за будь-яким з пп. 1-4. 6. Композиція за п. 5, яка містить щонайменше один штам Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. 7. Композиція за будь-яким з пп. 5 і 6, яка містить щонайменше один штам Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus і щонайменше один штам Streptococcus thermophilus. 8. Композиція за будь-яким з пп. 5-7, яка має заморожену, сублімовану або рідку форму. 9. Спосіб приготування ферментованого молочного продукту, що містить стадію, на якій ферментують молочний субстрат зі штамом молочнокислих бактерій за будь-яким з пп. 1-4 або композицією за будь-яким з пп. 5-8. 12 UA 114511 C2 5 10 15 10. Ферментований молочний продукт, який одержується за допомогою способу за п. 9. 11. Ферментований молочний продукт, який містить штам молочнокислих бактерій за будь-яким з пп. 1-4 або композицію за будь-яким з пп. 5-8. 12. Застосування штаму молочнокислих бактерій за будь-яким з пп. 1-4 або композиції за будьяким з пп. 5-8 для приготування молочного продукту. 13. Застосування за п. 12, де молочний продукт є ферментованим молочним продуктом. 14. Спосіб одержання штаму молочнокислих бактерій для ферментації молока, де штам молочнокислих бактерій являє собою Lactobacillus delbrueckii, при цьому вказаний спосіб містить стадії на яких: a) відбирають і виділяють з сукупності штамів молочнокислих бактерій сукупності штамів молочнокислих бактерій, які є стійкими до антибіотика ампіциліну, що визначається тим, що кількість ампіциліну, яка знижує виміряний з OD600 ріст після 20 годин росту при 37 °C на 20 % в середовищі, придатному для росту штаму молочнокислих бактерій, порівняно із ростом в середовищі без ампіциліну, становить вище ніж 400 нг/мл; і b) відбирають і виділяють з сукупності штамів молочнокислих бактерій, які є стійкими до антибіотика ампіциліну на етапі а), штаму молочнокислих бактерій, де час витікання 28 мл повножирного коров'ячого молока, що містить 2 % (мас./об.) сухого знежиреного молока, яке 4 інокульоване зі щонайменше 10 КУО/мл штаму молочнокислих бактерій і підкислялося при 37 °C протягом 20 годин, з полістиролової 25-мл піпетки становить щонайменше 50 секунд. 20 Комп’ютерна верстка В. Мацело Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 13