Продукти, що містять декарбоксильовані фенолокислоти, одержані з хлорогенових кислот кави, та їх застосування

Реферат: Винахід стосується застосування сполуки, вибраної серед 4-вінілкатехолу, 4-вінілгваяколу, 4вінілвератролу та їх сумішей, що проявляють антиоксидантні та/або протизапальні властивості, як інгредієнтів харчових продуктів та напоїв для лікування певних станів здоров'я. UA 103765 C2 UA 103765 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь винаходу Даний винахід стосується застосування декарбоксильованої фенолокислоти, одержаної з хлорогенової кислоти кави, а також продуктів, які містять декарбоксильовану фенолокислоту, одержану з хлорогенової кислоти кави, зокрема, кавового екстракту та способів одержання таких продуктів. Рівень техніки Кава та активні речовини кави, такі як кофеїн та дитерпени (наприклад, кафестол, кафеол), є стимуляторами детоксифікуючих ферментів (наприклад, глутатіон-S-трансфераза, ГСТ) (Cavin C. et al, 1998. The coffee-specific diterpenes cafestol and kahweol protect against aflatoxin B1induced genotoxicity trough a dual mechanism. Carcinogenesis 19, 1369-1375; Cavin, C. et al, 2003. Coffee diterpenes prevent benzo[a]pyrene genotoxicity in rat and human culture systems. Biochemical Biophysical Research Communication 306, 488-495; Huber, W. et al. 2002a. Enhancement of the chemoprotective enzymes glucuronosyl transferase and glutathione transferase in specific organs of the rat by the coffee components kahweol and cafestol. Archive of Toxicology 76, 209-217). Підвищена за допомогою кави активність ГСТ спостерігається у людей після споживання 800 мл кави протягом 5 днів (Steinkellner, H. et al. 2005. Coffee consumption induces GSTP in plasma and protects lymphocytes against (+/-)-anti-benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide induced DNAdamage: results of controlled human intervention trials. Mut. Res. 591 264-275). Відомо, що такого роду антиоксидантна активність захищає від "окислювального стресу" шляхом зменшення кількості шкідливих вільних радикалів, які можуть викликати ракові, серцево-судинні захворювання, дегенеративні порушення розумової діяльності та старіння. Хвороба Альцгеймера є прогресивною нейродегенеративною хворобою, найбільш розповсюдженою формою якої є деменція, характерними симптомами є погіршення пам'яті, занепокоєння, зміни настрою, спад когнітивної діяльності. Її відрізняє наявність в головному мозку позаклітинних амілоїдних бляшок та внутрішньонейронних нейрофібрильних зв'язок, основною складовою яких є фібрильні агрегати пептиду із залишком 39-42, які називають амілоїдним бета-протеїном (Аβ). Вважають, що утворення Аβ волокон відіграє провідну роль в етіології хвороби Альцгеймера. При деяких патогенних мутаціях хвороби Альцгеймера продемонстровано підвищені рівні Аβ, особливо при різновиді Аβ42. Таким чином, вважають, що причиною прогресу хвороби та нейродегенерації при хворобі Альцгеймера є саме утворення амілоїдних волокон. За допомогою досліджень in vitro було продемонстровано, що Аβ фібрильні утворення виникають в результаті комплексного багаторівневого механізму, який передбачає утворення дискретних розчинних олігометричних проміжних продуктів, відомих під терміном ADDLS або протофібрили (PFs), які зникають при утворенні волокон. Це дозволяє припустити, що PF можуть мати патогенну активність при хворобі Альцгеймера. Агрегація білків викликає ряд інших хвороб у людей і тварин, наприклад, дегенерацію макули, губковидну енцефалопатію Бовіньє (BSE), хворобу Кройцфельда-Якоба та діабет. Для підвищення корисних ефектів харчових продуктів та напоїв необхідно одержати продукти з підвищеним рівнем антиоксидантної активності та іншими видами корисної біологічної активності, а також для виявлення природних джерел антиоксидантів та інших сполук з корисною біологічною активністю, які можуть бути використані для покращення властивостей харчових продуктів та напоїв, а також, наприклад, косметики та медикаментів. Суть винаходу Винахідники з'ясували, що декарбоксильовані фенолокислоти, одержані з хлорогенової кислоти кави, мають антиоксидантні та протизапальні властивості, а також ефективно інгібують або стримують агрегацію амілоїдних бета-пептидів; їх можна отримати з кавового екстракту, виготовляючи кавовий екстракт з підвищеними антиоксидантними та протизапальними властивостями. Відповідно, винахід пов'язаний зі способом одержання кавового екстракту з вмістом декарбоксильованої фенолокислоти, одержаної з хлорогенової кислоти кави, який передбачає: а) екстракцію кавових зерен водою та/або парою для одержання кавового екстракту; б) обробку кавового екстракту для гідролізу хлорогенової кислоти, яка міститься в екстракті, до утворення фенолокислоти, та подальше декарбоксилювання одержаної фенолокислоти. Крім того, винахід стосується кавового екстракту, який містить декарбоксильовану фенолокислоту, одержану з хлорогенової кислоти кави, способу приготування харчового продукту або напою, харчового продукту або напою, який містить декарбоксильовану фенолокислоту, одержану з хлорогенової кислоти кави, та застосування декарбоксильованої фенолокислоти, одержаної з хлорогенової кислоти кави. Короткий опис креслень Фігура 1 показує результати дослідження властивості 4-вінілкатехолу знижувати та/або блокувати утворення амілоїдних волокон з мономеричних амілоїдних бета-пептидів. Білі 1 UA 103765 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стовпчики є контрольним зразком, світлосірі стовпчики є співвідношенням Аβ42 та 4вінілкатехолу 1:0,5 (молярне співвідношення), темносірі стовпчики є співвідношенням Аβ42 та 4вінілкатехолу 1:2 (молярне співвідношення). Фігура 2 показує результати дослідження властивості 4-вінілкатехолу знижувати та/або блокувати утворення амілоїдних фібрил з протофібрил амілоїдних бета-пептидів. Білі стовпчики є контрольним зразком, світлосірі стовпчики є співвідношення Аβ42 та 4-вінілкатехолу 1:0,5 (молярне співвідношення), темносірі стовпчики є співвідношенням Аβ42 та 4-вінілкатехолу 1:2 (молярне співвідношення). Детальний опис винаходу Хлорогенові кислоти є сім'єю складних ефірів, що є проміжним продуктом між транскоричною кислотою та хінною кислотою. Хлорогенові кислоти є природними компонентами кави, представленими, в основному, складними моно- та диефірами хінної кислоти, а також фенольними групами (кофеїновими, феруловими, кумаровими, метоксикоричними), в різних позиціях. Хлорогенові кислоти можна піддавати гідролізу для одержання фенольних сполук, таких як кофеїнова кислота та ферулова кислота. Такі фенольні сполуки можна далі піддавати перетворенню шляхом декарбоксилювання. Даний винахід стосується декарбоксильованої фенолокислоти, одержаної з хлорогенової кислоти кави. Під терміном "хлорогенова кислота кави" розуміють одну або більше хлорогенових кислот, які є природними компонентами кави, та які містять фенольну групу, фактично наявну у каві, або одержану з іншого джерела. У переважному варіанті втілення хлорогенову кислоту кави фактично одержують з кави. До хлорогенових кислот, які є природними компонентами кави, належать кафеолові хінні кислоти (СQA) (такі як 3-, 4- або 5-ти кафеолова хінна кислота) та їх диефіри, ферулові хінні кислоти (FQA) (такі як 3-, 4- або 5-ти ферулова хінна кислота) та їх диефіри, диметоксикоричні хінні кислоти (DMCQA) (такі як 3-, 4- або 5-ти диметоксикорична хінна кислота) та їх диефіри. Хлорогенові кислоти кави можна піддавати гідролізу для утворення фенолокислот, наприклад, при гідролізі кафеолової хінної кислоти утворюється кофеїнова кислота (CA), при гідролізі ферулової хінної кислоти утворюється ферулова кислота (FA), а при гідролізі диметоксикоричної хінної кислоти утворюється диметоксикорична кислота (DMCA). Фенолокислоти, утворені в результаті гідролізу хлорогенових кислот додатково можна піддавати декарбоксилюванню для одержання декарбоксильованої фенолокислоти, одержаної з хлорогенової кислоти кави. Наприклад, при декарбоксилюванні кофеїнової кислоти утворюється 4-вінілкатехол, при декарбоксилюванні ферулової кислоти утворюється 4вінілгваякол, а при декарбоксилюванні диметоксикоричної кислоти утворюється 4вінілвератрол. Відповідно, в одному з варіантів втілення винаходу декарбоксильована фенолокислота, одержана з хлорогенової кислоти кави, є 4-вінілкатехолом або його метоксильною похідною. Метоксильними похідними 4-вінілкатехолу є, наприклад, 4-вінілгваякол та 4-вінілвератрол. У переважному варіанті втілення винаходу декарбоксильовану фенолокислоту, одержану з хлорогенової кислоти кави, обирають серед 4-вінілкатехолу, 4-вінілгваяколу або 4вінілвератролу та їх сумішей. Винахід стосується кавового екстракту, який містить декарбоксильовану фенолокислоту, одержану з хлорогенової кислоти кави; кавовий екстракт може містити одну або більше декарбоксильовану фенолокислоту, одержану з хлорогенової кислоти кави. Кавовим екстрактом згідно винаходу може бути екстракт з обсмажених кавових зерен, необсмажених кавових зерен або їх суміші. В одному з варіантів втілення винаходу кавовий екстракт містить принаймні 0,1 мг 4вінілкатехолу, 4-вінілгваяколу та 4-вінілвератролу на грам сухої речовини, наприклад, принаймні 1, 2, 5 або 20 мг на грам сухої речовини. В іншому варіанті втілення винаходу кавовий екстракт містить принаймні 0,1 мг 4-вінілкатехолу на грам сухої речовини, наприклад, принаймні 1, 2, 5 або 20 мг на грам сухої речовини. Відповідно до способу згідно винаходу, хлорогенові кислоти можна перетворити у декарбоксильовану фенолокислоту, одержану з хлорогенової кислоти кави, шляхом гідролізу хлорогенової кислоти до утворення фенолокислоти та подальшим декарбоксилюванням одержаної фенолокислоти, як це було вищеописано. Реакції гідролізу та декарбоксилювання можуть здійснюватися окремо або ж частково співпадати у часі. Перетворення хлорогенових кислот можна здійснювати будь-яким прийнятним способом. В одному з варіантів втілення винаходу перетворення здійснюють із застосуванням одного або кількох мікроорганізмів, придатних для перетворення хлорогенової кислоти у каві. Мікроорганізмами, придатними для перетворення хлорогенових кислот, можуть бути, 2 UA 103765 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наприклад, визначені згідно прикладів у даній заявці. Відповідними мікроорганізмами можуть бути дріжджі, наприклад, пекарські дріжджі; гриби, наприклад, Aspergillus; бактерії, наприклад, молочнокислі бактерії, Lactobacillus й, зокрема, L. Johnsonni (CNCM I-1225). В одному з варіантів втілення винаходу мікроорганізмом, придатним для перетворення хлорогенових кислот, є молочнокисла бактерія. В іншому варіанті втілення винаходу застосовують два або більше мікроорганізми для перетворення хлорогенової кислоти, наприклад, один або більше мікроорганізми, придатні для перетворення хлорогенових кислот у фенолокислоту, та один або більше мікроорганізми, придатних для декарбоксилювання фенолокислоти. Перетворення хлорогенових кислот може здійснюватися при інкубації кавового екстракту з мікроорганізмами, придатними для перетворення хлорогенових кислот, в умовах, сприятливих для росту конкретного мікроорганізму, протягом часу, необхідного для досягнення потрібного перетворення хлорогенових кислот. Конкретні умови можуть бути легко визначені фахівцем з рівня техніки, наприклад, з посиланням на наведені в описі приклади. В іншому варіанті втілення винаходу перетворення хлорогенових кислот можна здійснювати одним або більше відповідними мікроорганізмами при застосуванні нереплікативних мікроорганізмів (наприклад, підданих лізису мікробіальних клітин). За допомогою інкубації кавового екстракту підданими лізису клітинами, за сприятливих умов, ферменти, що присутні у клітинному лізаті, можуть перетворювати хлорогенові кислоти. Прийнятними клітинами можуть бути, наприклад, клітини згаданих вище мікроорганізмів. З рівня техніки також відомі відповідні способи створення клітинного лізату. Кількість мікроорганізмів та умови перетворення мають бути оптимальними для досягнення бажаного перетворення хлорогенових кислот, та визначаються фахівцем з рівня техніки за допомогою звичайних способів, наприклад, застосовуючи способи, наведені у прикладах. В іншому варіанті втілення перетворення хлорогенових кислот здійснюють шляхом застосування одного або більше ферментів, придатних для перетворення хлорогенових кислот. В одному з варіантів втілення застосовують принаймні два ферменти, один з яких придатний для гідролізу хлорогенових кислот з утворенням фенолокислоти, а інший – для декарбоксилювання одержаної фенолокислоти. Відповідними ферментами для гідролізу хлорогенових кислот є, наприклад, естераза, а саме хлорогенат естерази, одержаної з Aspergillus japonicus (Kikkoman, Японія). Відповідними ферментами для декарбоксилювання фенолокислот є, наприклад, декарбоксилаза (EC 4.1.1.X) або, наприклад, піруват декарбоксилази (EC 4.1.1.1.). Ферментативне перетворення можна здійснювати традиційними для ферментних реакцій способами, наприклад, шляхом розчинення або суспендування ферментів у кавовому екстракті за умов, сприятливих для досягнення потрібної активності ферменту. Після того, як перетворення здійснилося, ферменти можна інактивувати, наприклад, за допомогою нагрівання. Ферменти можуть бути іммобілізовані, наприклад, на мембрані або на інертному носію, при цьому кавовий екстракт, який піддають обробці, циркулює над мембраною або через носій до тих пір, поки не буде досягнуто бажаного ступеня перетворення. У випадку застосування двох або більше ферментів вони можуть застосовуватися як одночасно, так і почергово, наприклад, коли оптимальні умови застосування ферментів відрізняються одні від інших. Кількість ферментів та умови, що застосовуються, мають бути оптимальними для досягнення бажаного гідролізу хлорогенових кислот та декарбоксилювання фенолокислот, та визначаються фахівцем з рівня техніки за допомогою звичайних способів. Кавові зерна, які екстрагують для одержання кавового екстракту, можуть бути і цільними, і меленими. В одному з варіантів втілення винаходу кавові зерна не обсмажують. У ще одному варіанті втілення необсмажені кавові зерна обробляють разом з обсмаженими кавовими зернами, наприклад, коли необсмажені та обсмажені кавові зерна екстрагують одночасно в єдиній витяжній системі для одержання комбінованого екстракту. Найбільш леткі ароматичні компоненти можуть виділятися ще до початку екстракції, наприклад, якщо екстракт застосовують для приготування розчинної кави без домішок. Способи вивільнення летких ароматичних компонентів добре відомі з рівня техніки, наприклад, з ЕР 1078576. Кавові зерна можуть бути екстраговані будь-яким прийнятним способом, який дозволяє одержати екстракт із вмістом хлорогенових кислот. Екстракція кавових зерен водою та/або парою добре відома з рівня техніки, наприклад, з ЕР 0916267. Екстракт можна піддавати процесу концентрації та можна висушувати до того, як його застосують для перетворення хлорогенових кислот, наприклад, сушінням шляхом розпилювання або сублімацією. Якщо екстракт був висушений, у разі необхідності, його можна повторно розчинити для підсилення процесу перетворення хлорогенових кислот. Кавовий екстракт можна піддавати будь-якому прийнятному процесу екстракції для вилучення небажаних компонентів до, під час та після 3 UA 103765 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 перетворення хлорогенових кислот, наприклад, для підвищення рівня концентрації декарбоксильованої фенолокислоти в готовому обробленому екстракті. Обробку екстракту для перетворення хлорогенових кислот можна застосовувати як після, так і під час його екстракції. Кавовий екстракт можна відокремити від кавових зерен до, під час та після його екстракції для перетворення хлорогенових кислот. В одному з варіантів втілення екстракт, після його екстракції для перетворення хлорогенових кислот, зберігають окремо від кавових зерен, наприклад, якщо після завершення процесу перетворення хлорогенових кислот екстракт не контактує з кавовими зернами. Відокремлення екстракту від екстрагованих кавових зерен можна здійснювати будь-яким прийнятним способом, наприклад, фільтруванням або центрифугуванням. З точки зору бажаного екстракту, ступінь відокремлення залежить від його практичної економічної доцільності та необхідності. Таким чином, ступінь відокремлення не може бути стовідстотковим, наприклад, в екстракті, після його відокремлення, може залишатися незначна частина нерозчинених кавових зерен. Також винахід стосується способу приготування харчового продукту або напою, який відрізняється тим, що у згаданому продукті та напої кавовий екстракт згідно винаходу застосовують в якості інгредієнту. В одному з варіантів втілення винаходу екстракт застосовують окремо від екстрагованих зерен, тобто, нерозчинений матеріал зерен практично видаляють за допомогою відокремлення, як це було описано вище, та не застосовують у приготуванні продукту або напою. Харчовим продуктом або напоєм може бути будь-який відомий продукт або напій. У переважному варіанті втілення продуктом або напоєм є кавовий напій: розчинна кава без домішок, безалкогольний напій, харчова добавка, молочний продукт, зерновий продукт, фруктовий або овочевий сік, або кондитерський виріб, такий як шоколадний продукт, наприклад, шоколадний напій. Розчинний кавовий продукт можна приготувати шляхом концентрації та висушування екстракту відповідно до винаходу. Перед тим, як його висушити, екстракт можна змішати з кавовим екстрактом, який не застосовувався для перетворення хлорогенових кислот, наприклад, екстракт обсмажених кавових зерен, необсмажених кавових зерен або їх суміші. З рівня техніки добре відомі способи одержання розчинного кавового продукту з кавового екстракту. Коли екстракт застосовують для приготування кавового продукту, зерна, що підлягають екстракції, можуть попередньо обробляти для вивільнення летких ароматів, наприклад, як це описано у EP-A-1078576. В подальшому, після гідролізу хлорогенових кислот, леткі аромати можуть додавати знову, наприклад, після висушування, для приготування ароматизованого розчинного кавового продукту. Розчинний кавовий продукт, виготовлений з екстракту згідно винаходу, можна розповсюджувати як такий, або можна, наприклад, змішувати із вершками та/або підсолоджувачем і розповсюджувати для приготування кавового напою, який в своєму складі містить вершки та/або підсолоджувач, наприклад, капучіно або кава-латте. В одному з варіантів втілення винахід стосується продукту або напою, який містить принаймні 0,1 мг 4-вінілкатехолу та/або його метоксильної похідної на грам сухої речовини, наприклад, принаймні 1, 2, 5 або 20 мг на грам сухої речовини. Коли кавовий екстракт згідно винаходу застосовують в якості інгредієнта харчового продукту або напою, його можна додавати на будь-якому етапі процесу приготування згаданого продукту або напою, для одержання бажаного ефекту. Екстракт можна додавати у будь-якій необхідній кількості для досягнення бажаного ефекту, наприклад, антиоксидантного або протизапального. У ще одному варіанті втілення винахід стосується харчового продукту або напою, який містить декарбоксильовану фенолокислоту, одержану з хлорогенової кислоти кави. Харчовим продуктом або напоєм може бути будь-який продукт або напій, відомий з рівня техніки. У переважному варіанті втілення харчовий продукт або напій є кавовим напоєм, розчинною кавою без домішок, безалкогольним напоєм, харчовою добавкою, молочним продуктом, зерновим продуктом, фруктовим або овочевим соком, або кондитерським виробом, таким, як шоколадний продукт, наприклад, шоколадний напій. Харчовий продукт або напій можна, наприклад, приготувати описаними способами. Застосування декарбоксильованої фенолокислоти, одержаної з хлорогенової кислоти кави Винахід також стосується застосування декарбоксильованої фенолокислоти, одержаної з хлорогенової кислоти кави. Декарбоксильовані фенолокислоти, які застосовують згідно винаходу, можна одержати будь-яким прийнятним способом, наприклад, декарбоксилюванням кофеїнової кислоти, у будь-якій прийнятній формі, наприклад, у формі очищеної сполуки (сполук). В одному з варіантів втілення винаходу декарбоксильована фенолокислота, яку застосовують згідно винаходу, має форму кавового екстракту, що містить декарбоксильовану фенолокислоту, як це було описано вище. В іншому варіанті втілення винаходу декарбоксильована фенолокислота частково або цілком виділена з кавового екстракту згідно 4 UA 103765 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 винаходу. Декарбоксильовану фенолокислоту, яку застосовують згідно винаходу, можна вводити людині або тварині будь-яким прийнятним способом, наприклад, орально, внутрішньовенно або черезшкірно. Якщо призначають введення орально, вона може мати форму харчового продукту або напою згідно винаходу. В одному з варіантів втілення винаходу харчовий продукт або напій згідно винаходу продають з маркуванням, що вказує на застосування згідно винаходу. В одному з варіантів втілення винахід стосується застосування декарбоксильованої фенолокислоти, одержаної з хлорогенової кислоти кави, для приготування харчового продукту або напою. Харчовим продуктом або напоєм може бути будь-який харчовий продукт або напій, відомий з рівня техніки. У переважному варіанті втілення харчовим продуктом або напоєм є кавовий напій, розчинна кава без домішок, безалкогольний напій, харчова добавка, молочний продукт, зерновий продукт, фруктовий або овочевий сік, або кондитерський виріб, наприклад, шоколадний продукт, наприклад, шоколадний напій. Коли декарбоксильовану фенолокислоту застосовують для приготування харчового продукту або напою, її можна додавати на будьякому етапі процесу приготування згаданого продукту або напою. В одному з варіантів втілення даний винахід стосується застосування декарбоксильованої фенолокислоти, одержаної з хлорогенової кислоти кави, в якості антиоксиданту, наприклад, інгредієнта продукту, наприклад, харчового продукту або напою, який відрізняється тим, що має бажані властивості антиоксидантів, наприклад, для запобігання окислення складових продукту під час його зберігання. Антиоксиданти широко застосовуються у ряді продуктів, тому декарбоксильовану фенолокислоту, одержану з хлорогенової кислоти кави, можна застосовувати способом, аналогічним застосуванню традиційних антиоксидантів. Фахівець з рівня техніки за допомогою звичайного експериментування може легко визначити необхідну кількість для досягнення бажаного антиоксидантного ефекту. В іншому варіанті втілення винахід стосується застосування декарбоксильованої фенолокислоти, одержаної з хлорогенової кислоти кави, для людини або тварини in vivo, для підвищення антиоксидантних та/або протизапальних властивостей, наприклад, шляхом стимулювання детоксифікуючих ферментів, таких як глютатіон-S-трансфераза (ГСТ) та підвищення Nrf2 під впливом генної експресії. Було встановлено, що підвищена за допомогою генів Nrf2 активність підсилює детоксифікацію та стимулює ендогенний захист від окислювального стресу. Таких переваг можна досягти, наприклад, коли декарбоксильовану фенолокислоту призначають людям або тваринам орально або черезшкірно. У ще одному варіанті втілення винахід стосується застосування декарбоксильованої фенолокислоти, одержаної з хлорогенової кислоти кави, для зменшення запалення у людини або тварини, наприклад, шляхом зменшення рівня простагландіну Е2, наприклад, коли декарбоксильовану фенолокислоту, одержану з хлорогенової кислоти кави, призначають орально людині або тварині. Багато проблем зі здоров'ям та порушень виникає саме через окислювальний стрес та запалення. Декарбоксильовану фенолокислоту, одержану з хлорогенової кислоти кави, можна застосовувати для лікування або профілактики таких проблем та порушень. Важливими проблемами та порушеннями є запалення шкіри, наприклад, фотопошкодження, спричинене ультрафіолетовим випромінюванням, атопічний дерматит, екзема, лущення, свербіж, алергічні симптоми; порушення роботи головного мозку; запальні процеси; ожиріння та рак, наприклад, рак шкіри, легень. В одному з варіантів втілення винаходу декарбоксильовану фенолокислоту, одержану з хлорогенової кислоти кави, застосовують в якості протидіабетичного засобу, наприклад, шляхом зниження рівня глюкози в крові та/або підвищення рівня лептину, інсуліну та/або спептиду в крові; в якості засобу для відновлення кісток, наприклад, шляхом підвищення концентрації мінералів та/або рівня естрогену в сироватці, прогестерону та/або активність лужних фосфатів; або в якості антиметастатичного засобу, наприклад, з антиангіогенним впливом; та/або як засіб для захисту головного мозку. Таких результатів досягають за умови призначення орально людині або тварині. У ще одному варіанті втілення винаходу декарбоксильовану фенолокислоту, одержану з хлорогенової кислоти кави, застосовують для приготування препарату для лікування або профілактики запалень шкіри, діабету, порушень роботи головного мозку, запальних процесів, ожиріння, раку, нейродегенеративних порушень, спаду когнітивної діяльності, легкого когнітивного погіршення, деменції, розладу настрою, депресії, порушень сну, хвороби пов'язаної з накопиченням білку, хвороби Альцгеймера (включаючи загальні симптоми хвороби, деменцію, легкі когнітивні порушення та спад когнітивної діяльності у вигляді порушень сну, перепадів настрою, депресії, стресу), дегенерації макули, діабету. Препарат може мати будь-яку 5 UA 103765 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 прийнятну форму, наприклад, для орального застосування або черезшкірно, наприклад, у вигляді продукту або напою, харчової добавки, пігулки, примочки або косметичного продукту. У переважному варіанті втілення препарат має форму медикаменту. В подальшому винахід стосується непрофілактичного застосування харчового продукту, напою, харчової добавки або корму для тварин згідно даного винаходу, для лікування та/або попередження запалень шкіри, наприклад, фотопошкоджень, спричинених ультрафіолетовим випромінюванням, атопічних дерматитів, екземи, лущення, свербежу, алергічних симптомів; запальних процесів; ожиріння; раку, наприклад, раку шкіри та легень; спаду когнітивної діяльності, розладу настрою та/або проблем зі сном; для захисту головного мозку та/або для покращення когнітивної діяльності, імунної реакції та/або захисної функції кишкового тракту людини або тварини. Під когнітивною діяльністю розуміють здатність до навчання та швидкість у навчанні, здатність та швидкість у вирішенні інтелектуальних задач, здатність запам'ятовувати та згадувати, час реакції та ін. Спад когнітивної діяльності може проявлятися у низькому рівні запам'ятовування, забудькуватості, проблемах з пошуком слова або імені, зниженні властивостей пам'яті, здатності концентруватися, здатності до планування та організації, здатності до виконання комплексних завдань та/або когнітивної діяльності, та може бути наслідком старіння, стресу, хвороби та інших причин. Під когнітивною діяльністю розуміють такі розумові процеси: розуміння, висновки, прийняття рішення, планування, навчання, запам'ятовування, асоціативний зв'язок, розробка ідеї, мова, увага, сприйняття, реакція, вирішення задач та мисленнєвий образ. У ще одному варіанті втілення винахід стосується способу покращення когнітивної діяльності; лікування або профілактики запалень шкіри, наприклад, фотопошкоджень, спричинених ультрафіолетовим випромінюванням, атопічних дерматитів, екземи, лущення, свербежу, алергічних симптомів; запальних процесів; ожиріння; раку, наприклад, раку шкіри та легень; нейродегенеративних порушень, спаду когнітивної діяльності, легкого когнітивного погіршення, деменції, розладу настрою, депресії, порушення сну, хвороби пов'язаної з накопиченням білку, хвороби Альцгеймера; дегенерації макули, діабету; спосіб, який включає призначення харчового продукту, напою для людини або корму для тварини, що містить діючу кількість декарбоксильованої фенолокислоти, одержаної з кавової хлорогенової кислоти. Харчовий продукт, напій або корм для тварин можна призначати одночасно з медикаментом для підвищення ефективності та/або зменшення дози медикаменту. У ще одному варіанті втілення винахід стосується способу лікування або профілактики запалень шкіри, наприклад, спричинених фотопошкодженнями через ультрафіолетове випромінювання, атопічних дерматитів, екземи, лущення, свербежу, алергічних симптомів; запальних процесів; ожиріння; раку, наприклад, раку шкіри та легень; нейродегенеративних порушень, спаду когнітивної діяльності, легкого когнітивного погіршення, деменції; хвороби пов'язаної з накопиченням білку, хвороби Альцгеймера; дегенерації макули, діабету, включаючи призначення дієвої кількості медикаменту, який містить декарбоксильовану фенолокислоту, одержану з кавової хлорогенової кислоти, людині або тварині, яка цього потребує. Харчовий продукт, напій або корм для тварини можна призначати одночасно з медикаментом для підвищення ефективності та/або зменшення дози медикаменту. Приклади Приклад 1 Обробка необсмаженого кавового екстракту за допомогою висушеного шляхом розпилювання препарату Lactobacillus johnsonii (CNCM I-1225) 30 мг сухого необсмаженого кавового екстракту розчинили у 1 мл фосфатного буферу або у 1 мл води. До цього розчину додали 10 мг висушеного шляхом розпилювання препарату 9 Lactobacillus johnsonii (CNCM I-1225) (3.3 КУО/г). Потім суміш витримали при 37 °C, а зразки виділяли при різні тривалості реакції. Після центрифугування (3000 г, 5 хв.) та фільтрування (розмір пор фільтрів шприця - 0.45 мкм, Millipore SLHA 025 BS) зразки протестували за допомогою рідинної хроматографії високого тиску. Аналіз рідинної хроматографії високого тиску Зразки кавового екстракту розвели 1 мас./об. % та протестували за допомогою оберненофазної хроматографії на колонці СС 250/4 Нуклеозил 100-5-С18 (Macherey-Nagel). В якості елюентної системи слугувала вода Мілліпор, 0,1 % трифтороцтова кислота та CH3CN при швидкості потоку 1 мл./хв. Спосіб дозволяє одночасно виконувати виміри кафеолових хінних кислот (CQA's), ферулових хінних кислот (FQA's), дикафеолових хінних кислот (di-CQA's), кафеїнової кислоти (CA), ферулової кислоти (FA) та 4-вінілкатехолу (спектральна поглинальна властивість 325 нм), застосовуючи зовнішні стандартні градуювальні криві. Результати виражені відносно часу 0 (t0). 6 UA 103765 C2 5 10 15 20 Дослідження чутливого до антиоксиданту елементу (ARE) гену люциферази pGL-8xARE з вісьмома зразками ARE, що міститься у глютатіоні-S-трансферазі щурів, разом з плазмідою pcDNA3.1, яка містить селекційний маркер неоміцину, трансфиціювали у людські MCF7 клітини (Wang et al., Cancer Res. 66, 10983-10994, 2006). ARE (чутливий до антиоксидантів елемент) є зв'язуючою ділянкою факторів транскрипції Nrf2, які регулюють діяльність генів у процесі детоксифікації та ендогенного захисту у боротьбі з окислювальним стресом. Плазміда pGL-8xARE містить ген люциферази нижче від восьми зв'язуючих ділянок, що дозволяє відслідковувати активність Nrf2. 32 клітини ARE висадили у 96-лункову мікротитрову пластинку, у модифіковане за способом Дульбеко середовище Ігла. Після 24годинної обробки 4-вінілкатехолом, зафіксували активність люциферази світлячка. Дослідження процесу утворення простагландіну Е2 Людські НТ-29 клітини товстого кишківника обробили 4-вінілкатехолом протягом 15 годин, із подальшою інкубацією протягом 6 годин разом з протизапальним агентом TNF-α (10 нг/мл). Аналіз утворення в клітинах PDE2 провели із застосуванням конкуруючого ферментативного імуноаналізу (ФІА) (Cavin et al., BBRC 327, 742-49, 2005). Результати Під час тестування за допомогою рідинної хроматографії високого тиску ферментованих кавових екстрактів, одержаних шляхом ферментації та інкубації двох різних екстрактів необсмажених кавових зерен Robusta, було виявлено досі невідомий максимум. Ідентифікацію речовини провели за допомогою комбінації LC-MS-ToF та NMR в якості 4-вінілкатехолу. Необсмажений кавовий екстракт обробили, як це описано вище, та протестували за допомогою рідинної хроматографії високого тиску. Результати наведено у таблиці 1. Таблиця 1 Склад необсмаженого кавового екстракту, обробленого Lactobacillius johnsonii, у певні проміжки часу. Величини подані у % до величин необробленого екстракту, за виключенням 4вінілкатехолу, який подається як ділянка сигналу рідинної хроматографії високого тиску. У необробленому екстракті не було виявлено 4-вінілкатехолу. Час (години) Кафеолова хінна кислота (CQA) Ферулова хінна кислота (FQA) Дикафеолова хінна кислота (diCQA) Кофеїнова кислота (CA) Ферулова кислота (FA) 4-вінілкатехол (ділянка максимуму рідинної хроматографії високого тиску, атомних одиниць) 25 16 38 45 27 7409 847 24 32 42 20 549 422 643 2119 Підвищення Nrf2 активності за допомогою 4-вінілкатехолу наведено у таблиці 2. Таблиця 2 Підвищення Nrf2 активності за допомогою 4-вінілкатехолу (активність люциферази світлячка, атомних одиниць) Активність люциферази світлячка (а.о) 16 41 22 4-вінілкатехол (мкг/мл) 200 400 600 Утворення простагландіну E2 в HT-29 клітинах наведено у таблиці 3. 7 UA 103765 C2 Таблиця 3 Утворення простагландіну E2 в HT-29 клітинах відносно необробленого контрольного зразку 4-вінілкатехол (мкг/мл) 0 3.13 6.25 9.38 15.63 31.25 62.5 5 10 Утворення простагландіну E2 (% контрольного зразку) 100 58 46 21 12 5 2 Приклад 2 Необсмажений кавовий екстракт розвели до 1 мас/об % та протестували за допомогою обернено-фазної хроматографії на колонці CC 250/4 Нуклеозил 100-5-C18 (Macherey-Nagel). В якості елюентної системи виступала вода Мілліпор, 0,1 % трифтороцтова кислота та CH3CN при швидкості потоку 1 мл/хв. 4-вінілкатехол зафіксували при рівні поглинання 265 нм. Для 4вінілкатехолу градуйовану криву в межах норми отримали за допомогою зовнішньої калібровки 4-вінігваяколом, що зумовлено нестійкістю 4-вінілкатехолу у формі ізолята. Результати наведено у таблиці 4. Таблиця 4 Склад необсмаженого кавового екстракту, обробленого Lactobacillius johnsonii, у певні проміжки часу. Величини подані у мг на грам сухого кавового екстракту. У необробленому екстракті не було виявлено 4-вінілкатехол. Час (години) 4-вінілкатехол 15 20 25 30 16 11 24 35 Приклад 3 Мономірний Аβ Мономірні Аβ42 пептиди очистили за допомогою ексклюзійної хроматографії розмірів та 0 проінкубували при 37 С та концентрації 10 мкм з 4-вінілкатехолом при співвідношенні Аβ42 до тестованої речовини 1:0.5 та 1:2 (молярне співвідношення). Рівень агрегації оцінили по завершенню 24 та 48 годин за допомогою флуоресценції тиофлавіну Т (ThT). Контрольні дослідження провели аналогічним чином, відмінність полягає лише в тому, що була відсутня речовина, що підлягає тестуванню. ThT є гідрофобним барвником, який проявляє підсилену флуоресценцію під час поєднання з амілоїдними волокнами. ThT вибірково приєднується до амілоїдних волокон, але не до мономірних форм Аβ. У цьому дослідженні зниження або відсутність ThT-флуоресценції свідчить про те, що молекули, які підлягають тестуванню, знижують та/або блокують утворення амілоїдних волокон. Результати даного дослідження зображено на фігурі 1. Протофібрила Аβ 0 Протофібрильну суміш Аβ42, очищену за допомогою хроматографії, проінкубували при 37 С та концентрації 10 мкм з 4-вінілкатехолом при співвідношенні Аβ42 до тестованої речовини 1:0.5 та 1:2 (молярне співвідношення). Рівень агрегації оцінили по завершенню 24 та 48 годин за допомогою ThT флуоресценції. Контрольні дослідження провели аналогічним чином, відмінність полягає лише у тому, що була відсутня речовина, що підлягає тестуванню. Зниження або відсутність збільшення у флуоресцентному ThT протофібрилів свідчить про те, що молекули, які підлягали тестуванню, знижують та/або блокують процес утворення амілоїдних волокон. Результати даного дослідження зображено на фігурі 2. 35 8 UA 103765 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 35 1. Спосіб одержання кавового екстракту з вмістом сполуки, вибраної серед 4-вінілкатехолу, 4вінілгваяколу, 4-вінілвератролу та їх сумішей, який передбачає: а) екстракцію кавових зерен водою та/або парою для одержання кавового екстракту; б) обробку кавового екстракту для гідролізу хлорогенової кислоти, яка наявна в екстракті, до одержання фенолокислоти, та для подальшого декарбоксилювання одержаної фенолокислоти. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що гідроліз хлорогенових кислот та декарбоксилювання фенолокислоти на стадії "б" здійснюється із застосуванням мікроорганізму. 3. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що мікроорганізмом є молочнокисла бактерія. 4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що кавові зерна, які підлягають екстракції, є необсмаженими. 5. Кавовий екстракт, який містить принаймні 0,1 мг 4-вінілкатехолу, 4-вінілгваяколу і 4вінілвератролу на грам сухої речовини. 6. Кавовий екстракт за п. 5, який є екстрактом необсмажених кавових зерен. 7. Спосіб приготування харчового продукту або напою, який відрізняється тим, що кавовий екстракт за будь-яким з пп. 5, 6 застосовують як інгредієнт зазначеного харчового продукту або напою. 8. Спосіб за п. 7, який відрізняється тим, що продуктом або напоєм є кавовий напій, розчинна кава без домішок, безалкогольний напій, харчова добавка, молочний продукт, зерновий продукт, фруктовий або овочевий сік або кондитерський виріб. 9. Застосування сполуки, вибраної серед 4-вінілкатехолу, 4-вінілгваяколу, 4-вінілвератролу та їх сумішей, як засобу для виготовлення медикаменту. 10. Застосування сполуки, вибраної серед 4-вінілкатехолу, 4-вінілгваяколу, 4-вінілвератролу та їх сумішей, як засобу для приготування препарату для лікування або профілактики запалення шкіри, діабету, розладів в роботі головного мозку, запальних процесів, ожиріння, раку, нейродегенеративних розладів, спаду когнітивної діяльності, легких когнітивних порушень, деменції, розладів настрою, депресії, порушень сну, хвороб, пов'язаних з накопиченням білку, хвороби Альцгеймера, дегенерації макули або діабету. 11. Застосування за п. 10, яке відрізняється тим, що згаданим препаратом є харчовий продукт або напій. 12. Застосування сполуки, вибраної серед 4-вінілкатехолу, 4-вінілгваяколу, 4-вінілвератролу та їх сумішей, як засобу для покращення відновлення кісток. 13. Застосування сполуки, вибраної серед 4-вінілкатехолу, 4-вінілгваяколу, 4-вінілвератролу та їх сумішей, як засобу для підвищення антиоксидантних властивостей in vivo у людей або тварин та/або захисту головного мозку. 9 UA 103765 C2 Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 10