Спосіб приготування дріжджових хлібобулочних виробів за допомогою глютен-детоксифікованого борошна

Реферат: Винахід належить до застосування виділених молочнокислих бактерій Lactobacillus sanfranciscensis DSM22063 та Lactobacillus plantarum DSM 22064 і ферментів цвілевих грибів для повного розкладання глютену в отриманому із зернових культур борошні, яке після детоксикації може використовуватися для виробництва харчових продуктів, що не містять глютену. UA 103788 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Даний винахід стосується застосування мікробіологічної технології для повного розкладання глютену в борошні. Зокрема, спосіб згідно винаходу включає застосування в умовах ферментації в рідкій фазі виділених молочних бактерій і грибкових протеаз, зазвичай використовуваних у виробництві хлібобулочних виробів з дріжджового тіста, для повного розкладання глютену (залишкова концентрація глютену нижче 20 ч./млн.) Зернове борошно, що виходить в результаті ферментації, може застосовуватися як початковий матеріал для виробництва харчових продуктів, що не містять глютену, призначених для харчування пацієнтів, які страждають на глютенову хворобу. Запропонований біотехнологічний спосіб приводить до отримання різних економічних, соціальних, поживних і органолептичних переваг у порівнянні з існуючою технологією виробництва харчових продуктів, що не містять глютену, виготовляються з інгредієнтів, що не містять глютену природним чином або в результаті обробки екстракційними способами. Епідеміологічна поширеність непереносимості глютену, або глютенова хвороба, безперервно росте. Останні обстеження населення повідомляють про схильність до цього стану кожного сотого жителя Європи і Сполучених Штатів (Rewers, 2005. Epidemiology of celiac disease; what are the prevalence, incidence, and progression of celiac disease (Епідеміологія глютенової хвороби; поширеність, частота виникнення та розвиток глютенової хвороби). Gastroenterology 128:47-51). Згідно сучасним уявленням, єдиним ефективним терапевтичним засобом проти цієї харчової непереносимості є повністю безглютенова дієта, яка повинна строго дотримуватися впродовж всього життя (Hamer, 2005. Celiac Disease: Background and biochemical aspects (Глютенова хвороба: передумови і біохімічні аспекти). Biotechnol Advanc 23:401-408). Відоме, наприклад, застосування молочних бактерій для приготування хлібобулочних виробів з борошна, що не містить білків (More та ін. Cereal Chemistry, American Association of Cereal Chemists. Міннеаполіс, США, том 84 №4, 1 січня 2007, стор. 357-364 і Moore та ін., European Food Research and Technology, том 226, 6 червня 2007, стор. 1309-1316). Проте дієта, яка не містить глютену, також має очевидні недоліки. Продукти, що не містять глютену, в порівнянні з продуктами на основі зернових виявляються дуже дорогими, демонструють знижені органолептичні якості і властивості при зберіганні, дієта є важкою для строгого її дотримання і повинна постійно контролюватися дієтологами, що також беруть до уваги дисбаланс поживних речовин (наприклад, волокон, мінеральних речовин і вітамінів), що є наслідком повної відсутності злаків в їжі (Grehn та ін., 2001. Dietary habits of Swedish adult coeliac patients treated by а gluten-free diet for 10 years (Особливості харчуння дорослих, які страждають на глютенову хворобу пацієнтів у Швеції, що отримували терапію безглютеновою дієтою впродовж 10 років). Scand J Nutr 45: 178-182; Mariani та ін., 1998. The gluten-free diet: а nutritional risk factor for adolescents with celiac disease (Безглютенова дієта: харчовий чинник ризику для підлітків з глютеновою хворобою). J Pediart Gastroenterol Nut 27: 519-523; Thompson та ін., 2005. Gluten-free diet survey: are Americans with celiac disease consuming recommended amounts of fibre, iron, calcium and grain foods? (Огляд дієти, що не містить глютену: чи отримують американці з глютеновою хворобою рекомендовані кількості волокон, заліза, кальцію і зернових продуктів?) J. Human. Nutr. Diet. 18:163-169). Більш того, в деяких випадках (наприклад, "стійкого синдрому мальабсорбції") строге дотримання дієти, що не містить глютену, також не дає можливості повного відновлення функціональності кишечника (Sollid і Khosla, 2004. Future therapeutic options for celiac disease (Майбутні можливі методи лікування глютенової хвороби). Gastroenterol. Hepatol. 2:140-147). В рамках альтернативних варіантів терапевтичного лікування із застосуванням безглютенової дієти в різних дослідженнях були використані переваги сучасних уявлень про послідовності токсичних епітопів, і розглядалося застосування мікробіологічних ферментів, зокрема, пролілендопептидази (PEPs) для гідролізу цих поліпептидів. Ферменти мікроорганізмів були запропоновані як дієтичні добавки (Shan та ін., 2004. Comparative biochemical analysis of three bacterial prolyl-endopeptidases: implications for celiac sprue (Порівняльний біохімічний аналіз трьох бактерійних пролілендопептидаз: значення для целіакії). Biochem. J. 383:311-318) і/або для in vitro детоксикації глютену (Chen та ін., 2003. Identification and characterization of Lactobacillus helveticus PePO2, an endopeptidase with postproline specificity (Ідентифікація та визначення характеристик Lactobacillus helveticus PePO2, постпролін-специфічної ендопептидази). Appl. Environ. Microbiol. 69:1276-1282; Stepniak та ін., 2005. Highly efficient gluten degradation with а newly identified prolyl-endoprotease: implications for celiac disease (Високоефективне розкладання глютену за допомогою недавно ідентифікованої пролілендопептидази: значення для глютенової хвороби). Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 291:G621-G629). Публікація WO2008/010252 і Cagno та ін. (Journal of Food Protection, том 71 №7, 2008, стор. 1491-1495), розкривають спосіб приготування хлібопекарних виробів з борошна, що не містить 1 UA 103788 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 білків, орієнтований на поліпшення поживних, органолептичних властивостей і характеристик зберігання цих продуктів, які готуються з інгредієнтів, що не містять глютену. Впродовж декількох останніх десятиліть також значно змінилася біотехнологія хлібобулочних виробів з дріжджового тіста, впливаючи тим самим на особливості харчування цілих груп населення, що раніше сиділи на дієті, що ґрунтується на глютені. В даний час дріжджові хлібобулочні вироби виробляються за допомогою надзвичайно швидких технологічних способів (наприклад, з використанням хімічних розпушувачів або хлібопекарських дріжджів), повністю замінюючих тривалі процеси ферментації за допомогою диких молочнокислих бактерій і дріжджів, що утворюються з сировинних матеріалів і застосовуються як "закваска". При сучасних способах зернові компоненти (наприклад, білки) в ході технологічної обробки харчових продуктів не піддаються дії якої-небудь гідролітичної активності, зберігаючи характеристики початкової сировини (Gobbetti, 1998. Trends Food Sci. Technol. 9:267-274). Різні дослідження, засновані на цих ознаках і використовуючі переваги ферментативних здібностей суміші вибраних молочних бактерій, продемонстрували, що за допомогою звичайної біотехнології, заснованої на використанні вибраних молочнокислих бактерій і тривалих періодах часу ферментації, виявляється можливим помітне зниження початкової концентрації глютену в зернових продуктах (Di Cagno та ін., 2002. Proteolysis by sourdough lactic bacteria: effects on wheat flour protein fractions and gliadin peptides involved in human cereal intolerance (Протеоліз заквашувальними молочними бактеріями: дія на білкові фракції пшеничного борошна і пептиди гліадину, залучені в непереносимість зернових продуктів людським організмом). Appl. Environ. Microbiol. 68:623-633; Di Cagno та ін., 2004. Sourdough bread made from wheat and non toxic flours and started with selected lactobacilli is tolerated in celiac sprue patients (Переносимий страждаючими целіакією пацієнтами хліб з тіста на заквасці, виготовлений з пшеничного нетоксичного борошна і заквашений з виділеними молочними бактеріями). Appl. Environ. Microbiol. 70:1088-1096; Di Cagno та ін., 2005. Pasta made from durum wheat semolina fermented with selected lactobacilli as а tool for а potential decrease of the gluten intolerance (Макаронні вироби, виготовлені з пшеничної крупчатки, ферментовані селекційними молочними бактеріями, як засіб для потенційного ослаблення непереносимості глютену). J. Agr. Food Chem. 53:43934402; De Angelis та ін., 2005. VSL#3 probiotic preparation has the capacity to hydrolyze gliadin polypeptides responsible for celiac sprue (Препарат пробіотика VSL#3, що володіє здатністю гідролізувати поліпептиди гліадину, відповідальні за целіакію). Biochim. Biophys. Acta. 1762:8093). Кодекс Аліментаріус, прийнятий WHO (Усесвітня організація охорони здоров'я) і ФАО (Продовольча і сільськогосподарська організація), розрізняє "продукти, що не містять глютену", які містять інгредієнти з концентрацією глютену нижче 20 ч./млн. та "продукти, зроблені без глютену", мають залишкову концентрацію глютену меншу 200 ч./млн. Проте різні дослідження, що призвели до створення керівних принципів, виданих "Робочою групою по проламінам", пропонують, щоб у будь-якому випадку поріг вмісту глютену підтримувався на рівні нижче 20 ч./млн. (Stern та ін., 2001. Analysis and clinical effects of gluten in celiac disease (Аналіз та клінічні ефекти глютену при глютеновій хворобі). Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 13:741-747). Недавнє дослідження Rizzello та ін. (Rizzello та ін., 2007. Highly efficient gluten degradation by lactobacilli and fungal proteases during food processing: new perspectives for celiac disease (Високоефективне розкладання глютену молочними бактеріями та грибковими протеазами в ході технологічної обробки харчових продуктів: нові перспективи відносно глютенової хвороби). Appl. Environ. Microbiol. 73:4499-4507) розглядало застосування складнішої суміші, що складається з 10 видів виділених молочнокислих бактерій, грибкових протеаз, і тривалого часу ферментації (48 годин при 37 °C) в умовах замісу в напіврідкому стані. Згідно даним електрофоретичного, хроматографічного та імунологічного аналізу, глютен, що містився в пшеничному борошні, розклався до порогової концентрації нижче 20 ч./млн. Відома, крім того, патентна заявка WO2006/097415, в якій, аналогічно вищезазначеному дослідженню, описаний спосіб розкладання глютену за допомогою застосування складної суміші, що складається з щонайменше шести видів молочнокислих бактерій і/або біфідобактерій, при тривалому часі ферментації (24-31 години). Проте описаний в цьому документі спосіб не є придатним для забезпечення повного розкладання глютену, наслідком чого є неможливість його застосування пацієнтами з глютеновою хворобою. Фіг. 1B в патентній заявці WO2006/097415 фактично показує, що після гідролізу за допомогою мікроорганізмів все ж таки зберігаються прозорі плями гліадинів, що не розклалися, і це підтверджується таблицею 2 в тому ж документі, з чого стає очевидно, що, тоді як деякі гліадини частково гідролізуються, інші виявляються нечутливими до процесу гідролізу. 2 UA 103788 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Виходячи з літературних і раніше описаних даних, можна зробити висновок, що основним предметом турботи при виробництві харчових продуктів, що не містять глютену, з детоксифікованого зернового борошна є деякі наступні проблеми: (i) спрощення композиції виділених молочних бактерій, призначених для застосування в процесі розкладання; (ii) значне скорочення часу ферментації, що повинне зробити даний спосіб придатним для застосування в промислових процесах; (iii) демонстрація здатності молочнокислих бактерій і ферментів цвілевих грибів ефективно впливати на борошно з м'якої і твердої пшениці, що належить до різних сортів, а також з ячменю, жита і вівса; (iv) забезпечення біотехнологічного процесу гідролізу глютену, що робить можливим застосування для отримання продуктів детоксифікованогої зернового борошна, що не містять глютену; і (v) демонстрація за допомогою тривалих медичних випробувань in vivo абсолютної переносимості пацієнтами з глютеновою хворобою тривалого прийому продуктів, що не містять глютену, заснованих на детоксифікованому пшеничному борошні. Тому, в світлі вищесказаного, очевидною є необхідність забезпечення матеріалів і способів для приготування хлібобулочних виробів, що не містять глютену, виготовляються з детоксифікованого зернового борошна, які, з одного боку, не демонстрували б недоліків, виявлених з огляду літературних даних відносно економічного, соціального, поживного і органолептичного аспектів, і, з іншого боку, недоліків, властивих продуктам, що не містять глютену, наявним в продажу в даний час. Автори даного винаходу зараз виявили, що за допомогою всього лише двох виділених молочнокислих бактерій в комбінації з грибковими протеазами час ферментації, необхідний для розкладання глютену, може бути помітно зменшений. Більш того, була доведена здібність молочнокислих бактерій і грибкових протеаз до повного розкладання глютену в борошні з різних сортів м'якої і твердої пшениці, ячменю, жита і вівса; був представлений біотехнологічний протокол для виробництва різних дріжджових хлібобулочних виробів з детоксифікованого пшеничного борошна; продемонстрована абсолютна переносимість продукту пацієнтами з глютеновою хворобою, таким чином, абсолютно новаторським способом роблячи можливим застосування пшеничного борошна як інгредієнт для виробництва дріжджових хлібобулочних виробів, що не містять глютену. Молочнокислі бактерії відповідно до даного винаходу належать до роду Lactobacillus і були виділені з "заквасок", використовуваних для виробництва сортів хліба, типових для Південної Італії. Lactobacillus sanfranciscensis DPPMA12 (депонований як DSMZ N. DSM22063 28 листопада 2008) і Lactobacillus plantarum DPPMA125 (депонований як DSMZ N. DSM22064 28 листопада 2008). Був стандартизований і оптимізований біотехнологічний протокол, що включає застосування виділених молочнокислих бактерій і грибкових протеаз в надзвичайно швидкому процесі ферментації (12-20 годин при 30-37 °C) зернового борошна, ресуспендованого у воді до досягнення концентрації в 20-50 мас. %, і подальше застосування їх в різних, згідно необхідним показникам, процентних долях як інгредієнт для швидкого (близько 1-3 години) розпушування за допомогою хлібопекарських дріжджів у виробництві дріжджових хлібобулочних виробів, що не містять глютену (залишковий вміст глютену менше 20 ч./млн.) Нижче представлена схема біотехнологічного протоколу для отримання дріжджових хлібобулочних виробів з детоксифікованого, такого, що не містить глютену, пшеничного борошна. Вирощування, промивка та суспендування у воді культур молочнокислих бактерій Змішування зернового борошна (30 %) з водою (70 %), що містить два види виділених 8 молочнокислих бактерій (щільність клітин 10 КУО/г) та грибкові протеази (по 400 ч./млн.) 50 Ферментація протягом 18 годин при 37 °C Змішування з нативною кукурудзою (10 %), рисовим борошном (10 %), яйцем (5 %), цукром (3 %), маслом (1 %) та хлібопекарськими дріжджами (1,5 %) 55 Ферментація протягом 1,5 годин при 30 °C 3 UA 103788 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Випікання протягом 50 хв. при 250 °C Пацієнтам з глютеновою хворобою щодня протягом 60 днів давали хлібобулочні вироби згідно однієї з можливих рецептур, що містять 10 г еквівалента початкового глютену. Імунохімічні та гістологічні проби показали абсолютну переносимість препарату, отриманого з детоксифікованого борошна, що не містить глютену. Згідно додатковим аналізам, що використовують електрофоретичні, хроматографічні та імунологічні методи, спосіб ферментації відповідно до даного винаходу за допомогою виділених молочнокислих бактерій, що не застосовувалися в попередніх дослідженнях, а також грибкових протеаз робить можливим: (i) повну детоксикацію глютену (вміст залишкового глютену нижчий 20 ч./млн.); (ii) виробництво гідролізованого борошна, що складається з суміші низькомолекулярних пептидів і, особливо, амінокислот (приблизно 15000 міліграм/кг в порівнянні з