Спосіб одержання бактеріального концентрату бмк для виробництва продуктів функціонального харчування

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к бактериальным препаратам повышенной биологической активности, используемым в производстве функциональных продуктов. Благоприятное воздействие на организм человека бифидофлоры и лактофлоры в настоящее время не вызывает сомнений, поэтому эти микроорганизмы широко используются в производстве функциональных продуктов. Бифидобактерий, являясь облигатными представителями нормальной микрофлоры кишечника человека, очень плохо развиваются в молоке и не обеспечивают ферментированному продукту необходимые сенсорные показатели. Для преодоления этих затруднений данные микроорганизмы часто используют совместно с молочнокислыми бактериями в многокомпонентных стартовых культурах. Известен способ получения сухого препарата бифидобактерий и молочнокислых бактерий Бифилакт (ТУ 49 1016 - 85), предназначенного для производства продуктов, обладающих лечебнопрофилактическими свойствами. Этот препарат разработан на основе бифидобактерий видов B.bifidum и B.longum, молочнокислых стрептококков - L.lactis, L.diacetilactis и ацидофильной палочки L.acidophilus. Однако этот препарат содержит невысокое количество микроорганизмов: в 1г сухого препарата содержится (1 - 3) ´ 109КОЕ бифидобактерий и (0,5 - 1) ´ 108 лактобактерий. Активность Бифилакта также невысокая. Известен способ приготовления закваски для получения кисломолочного продукта, предусматривающий использование бифидобактерий вида B.longum совместно с кефирными грибками (А.с. СССР №1697684, кл. A23C9/12//C12P39/00/C12P39/00/C12R1 : 01/, 1991). Наряду с рядом положительных свойств (улучшенная органолептика, стимуляция роста бифидобактерий) в состав микрофлоры кефирных грибков входят микроорганизмы не характерные для естественного микробного ценоза кишечника человека. Наиболее близким к заявляемому является способ получения сухого концентрата бифидобактерий и молочнокислых стрептококков. Способ осуществляют путем совместного культивирования бифидобактерий с молочнокислыми стрептококками, при этом микроорганизмы отбирают по энергии кислотообразования и антагонистическому воздействию на кишечную палочку. В состав бактериального концентрата включены бифидобактерий, имеющие энергию кислотообразования не ниже 75°Т и титр антагонистической активности не менее 1 : 4, и молочнокислые стрептококки, видов L.lactis ssp. diacetilactis, L.lactis, L.cremoris и S.thermophilus, которые характеризуются антагонистической активностью к кишечной палочке, определенной по методу диффузии в агар не менее 5мм. Численность бифидобактерий в бактериальном концентрате, полученном известным способом, не превышает 7 ´ 109КОЕ в 1г, а молочнокислых стрептококков - 1,8 ´ 1010 (А.св. СССР №1622966, кл. A23C9/12, 1992) - прототип. Недостатком известного способа является низкая концентрация бифидофлоры, достаточно длительный процесс накопления биомассы 14 18ч, а также включение в состав бактериального концентрата мезофильных молочнокислых бактерий, которые не характерны для кишечной микрофлоры человека. В основу изобретения поставлена задача создания способа получения бактериального концентрата, в котором путем изменения состава микрофлоры и технологических параметров обеспечивается сокращение продолжительности технологического процесса, повышение биологической активности и концентрации микрофлоры в бактериальном концентрате, обеспечивающих терапевтическое воздействие на организм человека, что необходимо для производства продуктов функционального питания. Решение поставленной задачи включает тщательный подбор штаммов микроорганизмов и разработку эффективной технологии их накопления. Заявляемый способ отличается от известного композиционным составом заквасочной микрофлоры, который конструировался с учетом функционального действия на организм человека. Бактериальный концентрат БМК содержит высокоактивные микроорганизмы, принадлежащие к видам Bifidobacterium longum, Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckli sp. acidophilus. Учитывая то, что бактериальный концентрат разработан для производства функциональных продуктов, выбор штаммов для него осуществляли руководствуясь требованиями, предъявляемыми к пробиотическим микроорганизмам. В частности, особое внимание уделяли соответствию таксономической принадлежности отобранных штаммов таковой нормальной микрофлоре кишечника человека, устойчивости к продуктам обмена пищеварительного тракта, высокой антагонистической активности по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, а также сродству к энтероцитам. Свойства отдельных штаммов, включенных в состав БМК, представлены в табл.1. Штаммы, включенные в состав бактериального концентрата, отличаются устойчивостью к высоким концентрациям хлорида натрия, фенола, желчи и адгезивностью (табл.2). Комплекс этих свойств указывает на достаточно высокую степень колонизации кишечника данными микроорганизмами. Антагонистическая активность штаммов бактерий, Использованных в известном способе, по отношению к бактериям группы кишечной палочки (метод диффузии в агар) колеблется в пределах от 1 до 6мм и существенно ниже таковой для штаммов, входящих в состав БМК (табл.3). Отобранные штаммы также подавляют развитие тест-культур при их совместном культивировании. В этих условиях титр антагонистической активности бифидобактерий по отношению к E.coli составлял 1 : 4, термофильных стрептококков 1 : 2, ацидофильной палочки 1 : 5. Аналогичные результаты получены для S.aurerus и P.vulgaris. Высокий уровень антагонистической активности отдельных штаммов сохраняется в бактериальном концентрате. Наряду с рассмотренными выше тест-культурами бактериальный концентрат БМК и его отдельные штаммы активно подавляют рост опасного патогена кампилобактер, вызывающего серьезные кишечные инфекции (табл.4). Следует отметить, что антагонистическая активность бактериального концентрата выше, чем активность отдельных штаммов. Все это свидетельствует о высокой активности бактериального концентрата БМК и продуктов с его использованием для подавления нежелательной микрофлоры in vivo. Заявляемый способ получения бактериального концентрата БМК предусматривает культивирование бифидобактерий и молочнокислых бактерий в питательной среде, приготовленной на основе гидролизованного молока, обогащенной ростовыми факторами и стимуляторами роста при 37 ± 1°C в течение 12 14 часов при постоянном контроле pH. Отличительной особенностью способа является то, что при накоплении биомассы используют ступенчатое внесение культур. Вначале вносят бифидобактерии и культивируют самостоятельно в течение 6 - 7ч. По истечении этого времени дополнительно вносят культуры термофильных стрептококков и ацидофильных палочек и продолжают процесс накопления биомассы еще в течение 5 - 7ч. Затем осуществляют отделение биомассы от культуральной жидкости, смешивают биомассу с защитной средой, замораживают и высушивают с применением сублимационной сушилки. Использование данного приема культивирования позволяет снизить время накопления биомассы на 1 - 4 часа и получить бактериальный концентрат с содержанием бифидофлоры в 10 - 100 раз больше, чем в известном бакконцентрате (табл.5). С использованием бактериального концентрата БМК разработаны сухие и жидкие продукты для функционального питания. Эффективность их терапевтического воздействия на организм человека подтверждена в клинических испытаниях, которые показали положительное влияние на состав кишечной микрофлоры. Пример 1. Получение бактериального концентрата БМК. В 100л водопроводной воды восстанавливают 3,0кг сухого обезжиренного молока, смесь нагревают до 55°C, устанавливают pH 7,4, вносят 15г протосубтилина с активностью 70ед. и выдерживают смесь в этих условиях 2,5ч. После гидролиза в среду вносят 0,5кг лактозы, 0,5кг трехзамещенного лимоннокислого натрия, 2л кукурузного экстракта, 50г сернокислого железа. В среде устанавливают pH 8,0 с помощью 30% раствора гидроксида натрия и стерилизуют при температуре 121°C в течение 30мин. Активная кислотность после стерилизации должна составлять 7,4ед. pH. Питательную среду охлаждают до 40°C и инокулируют 8л бифидобактерий B.longum 352, с концентрацией клеток не менее 2 - 5 ´ 108КОЕ/мл. Культуру выращивают при 37 ± 1°C в течение 6ч в режиме периодической нейтрализации среды водным раствором аммиака до pH 7,0. Затем вносят по 0,8л молочнокислых бактерий штаммов S.termophilus 27 c и L.delbrueckil ssp. acidophilus 20 y с численностью бактерий в 1мл (30 - 50) ´ 107 и (10 - 15) ´ 107 соответственно, и культивируют еще в течение 7 часов, поддерживая pH культуральной жидкости равным 6,5 - 7,0. В конце роста охлаждают культуральную жидкость до 12°C, нейтрализуют до pH 7,2 - 7,4 и центрифугируют на суперцентрифуге ОТР при 15000об/мин. Полученную биомассу смешивают с защитной средой в соотношении 1 : 1. Состав защитной среды следующий (в г/л): сахароза 100, цитрат натрия - 50, дистиллированная вода - до 1л. Суспензию биомассы в защитной среде разливают тонким слоем высотой не более 10мм, замораживают при -40°C и высушивают в сублимационной установке КС-30. Продолжительность сушки 20ч до массовой доли влаги в сухом концентрате 5%. Высушенную суспензию размельчают и расфасовывают в стерильную тару и плотно закупоривают. В 1г бактериального концентрата содержится 5 ´ 1011КОЕ бифидобактерий и 1,6 ´ 1010 лактобактерий. Пример 2. Получение бактериального концентрата БМК. В питательную среду, подготовленную аналогично примеру 1, инокулируют 5л культуры бифидобактерий B.longum 352, содержащей не менее 2 - 5 ´ 108КОЕ/мл и культивируют при 37 ± 1°C в течение 7ч в режиме периодической нейтрализации среды водным раствором аммиака до pH 7,0. Затем вносят по 0,8л штаммов лактобактерий S.termophilus 27 c и L.delbrueckli ssp. acidophilus 20 y с численностью бактерий в 1мм (30 - 50) ´ 107 и (10 - 15) ´ 107 соответственно, и культивируют еще в течение 5 часов, поддерживая pH культуральной жидкости равным 6,5 - 7,0. В конце роста охлаждают культуральную жидкость до 12°C, нейтрализуют до pH 7,2 - 7,4 и центрифугируют на суперцентрифуге ОТР при 15000об/мин. Полученную биомассу смешивают с защитной средой в соотношении 1 : 1. Состав защитной среды следующий (в г/л): сахароза 100, цитрат натрия - 50, дистиллированная вода - до 1л. Суспензию биомассы в защитной среде разливают тонким слоем высотой не более 10мм, замораживают при -40°C и высушивают в сублимационной установке КС-30. Продолжительность сушки 20ч до массовой доли влаги в сухом концентрате 5%. Высушенную суспензию размельчают и расфасовывают в стерильную тару и плотно закупоривают. В 1г бактериального концентрата содержится 5,5 ´ 1011КОЕ бифидобактерий и 5,5 ´ 1010 лактобактерий. Пример 3. Использование бактериального концентрата БМК для получения сухого функционального продукта. 99кг сухой адаптированной молочной смеси Детолакт (производство МКК детских продуктов г.Балта) разделяют на 4 равных части. Одну часть молочной смеси и 1кг бактериального концентрата БМК, полученного по примеру 1, перемешивают в асептических условиях в течение 2 - 3мин. К полученной смеси добавляют следующую порцию и снова перемешивают 2 - 3мин. Процедуру повторяют еще дважды. Полученную смесь расфасовывают в стерильную тару. 1г продукта содержит 5,0 ´ 109 и 1,6 ´ 108 КОЕ бифидобактерий и молочнокислых бактерий. Пример 4. Использование бактериального концентрата БМК для получения сухого функционального продукта в таблетированной форме. В смесителе смешивают 20,0г сахарозы и 72,0г глюкозы. Полученную смесь увлажняют раствором ячменно-солодового экстракта (4,5г экстракта и 12,0 воды), гранулируют, затем подсушивают в сушильной установке при температуре 65°C до содержания сухих веществ 98,5% снова гранулируют, добавляют 1,0г бактериального концентрата, содержащего 5,2 ´ 1011 живых клеток бактерий, 1,3г аскорбиновой кислоты и 0,9г стеарата кальция. Смесь тщательно перемешивают и таблетируют на таблетировочной машине. Получают продукта виде таблетки, массой 0,8г, с гладкой блестящей поверхностью и приятным кисло-сладким вкусом. В 1 таблетке содержится 4,2 ´ 109КОЕ пробиотических бактерий, в том числе 4 ´ 109 бифидобактерий и 0,2 ´ 109 молочнокислых бактерий. Продукт отличается удобством применения. Пример 5. Получение ферментированного молочного продукта с использованием БМК. 100кг молока пастеризуют при 92°C с выдержкой 10мин, гомогенизируют, охлаждают до 40°C, вносят 10г бактериального концентрата, перемешивают и выдерживают при указанной температуре в течение 8 - 10 часов до образования сгустка. После сквашивания ферментированную смесь охлаждают и направляют на розлив. Консистенция конечного продукта однородная сметанообразная. Вкус приятный кисломолочный, кислотность 85°Т. В 1мл продукта содержится 1,0 ´ 108 и 5,7 ´ 108 бифидобактерий и лактобактерий соответственно. Таким образом, заявляемый способ позволяет снизить продолжительность процесса накопления биомассы, получить бактериальный концентрат с более высоким содержанием клеток бактерий, а включение в его состав штаммов пробиотических микроорганизмов оказывает эффективное терапевтическое воздействие на организм человека.