Бактеріальний концентрат “старт”, що використовується для одержання функціональних продуктів

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве сухих и жидких функциональных продуктов. В настоящее время общепризнано, что бифидо- и лактобактерии, являясь облигатной кишечной микрофлорой, играют исключительно важную роль во всех процессах функционирования организма человека. Это определило их широкое использование в качестве стартовых культур в производстве ферментированных продуктов повышенной биологической активности и пробиотических препаратов. Однако молоко для бифидобактерии не является адекватной средой обитания, поэтому производство молочных продуктов, ферментированных чистыми культурами этих микроорганизмов, сопряжено с рядом трудностей. Более перспективными являются многокомпонентные заквасочные препараты, в которых наряду с бифидобактериями включены микроорганизмы других таксономических групп. Наиболее часто бифидобактерии сочетают с молочнокислыми бактерими, в частности ацедофильными палочками. Известна стартовая культура фирмы Кр. Хансен для производства ферментированного продукта "АВ milk", содержащая В. bifilum и L accidophilus. [famine, Α., Υ. et al. //J. Dairy Res, - 1995. - 62. - 151-187]. Однако продукт, получаемый с ее использованием, характеризуется высокой кислотностью (рН 4,5 и ниже) обусловленной жизнедеятельностью такого сильного кислотообразователя как L. acidophilus, a это неблагоприятно воздействует как на бифидофлору, так и на макроорганизм, а также ухудшает органолептические показатели конечного продукта. Известен также пробиотик, содержащий один из четырех штаммов бифидобактерий В. bifidum 791, В. fibldum ЛБА-3, 6. bifidum 1 и В. longum B379M или их сочетания совместно с лактобактериями L acidophilus NK1, который используется в качестве заквасочной культуры в производстве ферментированного продукта лечебно-профилактического назначения [Патент RU № 2060673, кл. С1 С А 23 С 9/12, А 61 К 35/74, С 12 N 1 /20// (С 12 N 1 /20, С 12 К 1 /23), 1995]. Недостатком данной стартовой культуры является длительность процесса получения конечного продукта на чистых культурах бифидобактерий, а также его высокая кислотность. Наиболее близким к заявляемому является сухой препарат Бифилакт, в частности, один из его вариантов - Бифилакт-Л [Препарат сухой бифидобактерий и молочнокислых бактерий (Бифилакт). Технические условия. ТУ 49 1016-85 - прототип]. Этот бактериальный препарат наряду с бифидо-бактериями видов В. bifidum и В, longum содержит мезофильные молочнокислые стрептококки S. lactis и предназначен для производства молочных продуктов, обладающих лечебно-профилактическими свойствами. Недостатком этого препарата является низкое содержание микрофлоры в 1 г -3*109 бифидобактерий и 1*108 - молочнокислых стрептококков и его низкая активность (время сквашивания 1 л молока 0,5 г препарата - 14 часов). Кроме того, бактерии заквасочной культуры различаются по температурным оптимумам: бифидобаке-рии - термофильные микроорганизмы, а молочнокислые стрептококки - мезофильные, что требует постоянного контроля температурного препарата для поддержания необходимого соотношения бактериальных компонентов при ферментации и обеспечения требуемого спектра органолептических характеристик в конечном продукте. Задача изобретения заключается в создании бактериального концентрата для производства функциональных продуктов, в котором путем изменения состава микроорганизмов и соотношения между ними обеспечивается повышение биологической активности, численности жизнеспособных клеток лакто- и бифидобактерий, улучшение · органолептических показателей конечного продукта. Поставленная задача решается тем, что в бактериальном концентрате, содержащем бифидобактерий и молочнокислые стрептококки, согласно изобретению он содержит из бифидобактерий штамм Bifidobacterlum longum VKPM S—1514," из молочнокислых стрептококков штаммы Streptococcus thermophilus ВКПМ В-4463 и ВКПМ В-3161 или Streptococcus thermophilus ВКПМ В-4464 и ВКПМ В-7331 или Streptococcus thermophilus ВКПМ В-7330 и ВКПМ В-732.9 при соотношении культур (5-8): 1:1, при этом используемые штаммы микроорганизмов по таксономической принадлежности соответствуют видовому составу микрофлоры кишечника человека. Кроме того, бактериальный концентрат содержит 1010-10 11 КОЕ в 1 г физиологически активных клеток полезных микроорганизмов. Особенностью видового состава микроорганизмов бактериального концентрата является то, что в его состав введены микроорганизмы -представители нормальной микрофлоры кишечника человека. Выбор штаммов осуществляли на основе требований, предъявляемым к пробиотикам. Особое внимание уделяли биохимической и антагонистической активности штаммов, способности закрепляться в кишечнике, резистентности к продуктам обмена пищеварительной системы, а также технологичности. Отобранные штаммы термофильных стрептококков и бифидобактерий отличаются высокой устойчивостью к агрессивным компонентам пищеварительного тракта. Они развиваются в молоке, содержащем 40% желчи, 6,6% хлорида натрия и 0,6% фенола. Температурные оптимумы отдельных штаммов лакто- и бифидобактерий достаточно близки -(42+2)°С, что упрощает условия культивирования композиции. Молокосвертывающая активность исследуемых штаммов термофильных стрептококков в оптимальных условиях при внесении 3% инокулята достаточно высока и варьирует в узких пределах - от 3,0 до 5,0 ч (табл.1). Штаммы незначительно отличаются по пределу кислотообразования и накопления биомассы. Четыре штамма (27, 66, Т-95 и 74) образуют вязкие полимеры. Штаммы S. thermophilus 36-8 и 30 образуют колющийся сгусток без отделения сыворотки. Ферментированное этими культурами термофилов молоко имеет приятный чистый и нежный кисломолочный вкус. Бифидобактерии коагулируют обезжиренное молоко при оптимальной температуре роста и посевной дозе 5% за 7-8 ч, образуя однородный сгусток без отделения сыворотки приятного кисломолочного вкуса с легким специфическим привкусом уксусной кислоты. Титруемая кислотность ферментированного в течение 24 ч молока составляет (105±2)°С. Штамм высокоурожаен. Успешное функционирование заквасочных микроорганизмов в пищеварительном тракте в значительной мере определяется их адгезионными свойствами. Исследование адгезии штаммов лакто- и бифидобактерии проводили в модельных опытах с использованием энтероцитов свиньи. Величину сродства микроорганизма к энтероциту выражали индексом адгезиюности (ИА), который выражается числом клеток бактерий, закрепленных на основе энтероците. ИА термофильных стрептококков колеблется от 3,2-11,2 и был выше, чем у бифидобактерии - 2,9Ч Наибольшим сродством к эпителиальным клеткам обладают стрептококки шт. 27с - 11,2. Самый низкий ИА обнаружен для штамма 36-8 - 3,2. Степень сродства бифидобактерии к энтероцитам составляет - (2,9 0,5), что достаточно высоко для бифидобактерии. Все штаммы, входящие в состав бактериального концентрата Старт, обладают способностью снижать уровень холестерина при ферментации молочной основы. Уровень холестерина в молоке снижается при ферментации термофильными стрептококками на 10-15% и зависит от штамма микроорганизма. бифидобактерии снижают содержание холестерина только на 9-10%, однако, в процессе ферментации они обогащают продукт значительным количеством свободных аминокислот, в частности лизином, треонином, серином, гистидином, пролином и глицином. Одним из основных условий, предъявляемых к микроорганизмам, входящим в состав стартовых культур для функциональных продуктов, является их способность подавлять развитие нежелательной микрофлоры кишечника, что способствует нормализации и стабилизации состава микробиоценоза человека. Антагонистическую активность отдельных штаммов лакто- и бифидобактерии исследовали двумя методами - методом лунок и совместного культивирования. В качестве тест-культур при изучении антагонистической активности методом лунок использованы 16 штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов - представителей семейства Enterobacteriaceae, Pseudomonaceae, Micrococcaceae. Термофильные стрептококки характеризуются умеренной антагонистической активностью in vitro. Наиболее активны -штаммы S, thermophilus 74, 30, 36-8 и 27с. Несколько менее активными оказались штаммы Т-95 и 66. Спектры подавляемых тест-культур были сходны. Термофильные стрептококки подавляют развитие таких патогенов как Y. enterocolitica, P. vulgaris и Р. mirabilis, S. aureus, S. flexneri, патогенный биовар Е. coli, E. cloaceae, S. marcescens. Спектр подавляемых в этих условиях бифи-добактериями тест-культур по видовой принадлежности несколько отличается от такового для термофильных стрептококков и был следующим - Е. coti, E. aerogenes, Ε. cloaceae, S. marcenscens, S. flexneti, C. jejuni, C. laridis. Антагонистический эффект более выражен при совместном культивировании штаммов лакто- и бифидобактерии с тест-культурами. Этот метод более приближен к естественным условиям, по сравнению с методом лунок. В присутствии бифидобактерии численность клеток кишечной палочки и стафилококка снижается в 1000000 раз по сравнению с контролем, а развитие протеев не прослеживается и вовсе. Термофильные стрептококки более активны по отношению к стафилококкам и протеям. В их присутствии титр протеев снижался в 100— 10000 раз, а стафилококков - в 100-1000 раз. Кишечные палочки подавляются термофильными стрептококками в 10-100 раз. Следовательно, анализ биологических свойств отдельных штаммов лакто- и бифидобактерии показал их высокую активность. Изобретение предусматривает три композиционных варианта бактериального концентрата Старт, отличающихся между собой штаммовым составом термофильных стрептококков, придающих конечному продукту определенные органолептические свойства: Старт-1 - В. longum 352, S. thermophilus 27с и 36-8; Старт-2-В. longum 352, S. thermophilus 66 и Т-95; Старт-2 - В. longum 352, S. thermophilus 74 и 30. Создание нескольких вариантов бактериального концентрата позволяет получать продукт с различными сенсорными характеристиками и функциональным воздействием на организм человека и снижает вероятность контаминации фагом. Соотношение между бифидобактериями и молочнокислыми стрептококками в бактериальном концентрате Старт составляет (5-8): 1:1. Данное соотношение между бактериальными компонентами обеспечивает необходимый для функциональных продуктов комплекс свойств. Снижение доли бифидобактерий снижает биологическую активность конечного продукта, а увеличение - увеличивает время ферментации молока, ухудшает ею органолептические показатели. Различные композиции микроорганизмов разработанного бактериального концентрата Старт создавались на основе сочетаемости и взаимодополняемости штаммов, а также учета требований к стартовым культурам для продуктов-пробиотиков. Особенностью композиций бактерий является то, что в их состав включены термофильные микроорганизмы, являющиеся представителями нормальной микрофлоры кишечника человека, резистентные к продуктам метаболизма пищеварительного тракта, отличающиеся высокой биологической активностью, способностью к снижению уровня холестерина в молоке и обогащению свободными аминокислотами, что обеспечивает функциональную активность и необходимые сенсорные показатели готового продукта. Содержание полезной микрофлоры в бакконцентрате Старт значительно - в 10-100 раз больше, чем в известном продукте, что определяет его более высокую активность и позволяет использовать в качестве компонента при производстве сухих функциональных продуктов. Все варианты бактериального концентрата Старт обладают способностью к снижению уровня холестерина в молоке, что значительно повышает диетические свойства конечного продукта (табл.2). При ферментации молока заявляемым бактериальным концентратом происходит увеличение общего пула свободных аминокислот в 1,3 раза (на 30%). Благодаря тому, что в состав препарата входят микроорганизмы с низким уровнем кислотообразования, кислотность продукта невысокая и не превышает 95°Т. Консистенция ферментированного заявляемым бакконцентратом молока однородная, плотная, сметанообразная без отделения сыворотки. Вкус чистый кисломолочный с легким привкусом уксусной кислоты. Помимо обеспечения высоких органолептических характеристик ферментированного продукта предлагаемый бактериальный концентрат обеспечивает направленность и интенсивность функционального воздействия на организм человека. Прежде всего это определяется композиционным составом микрофлоры, который создан с учетом взаимодополняемости и синергизма биологических свойств отдельных штаммов, Все это обеспечивает успешную колонизацию кишечника флорой бактериального концентрата и ее успешное функционирование в нем. Нормализация микрофлоры кишечника осуществляется также вследствие высокой антагонистической активности по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре человека. Спектр подавляемых тест-культур в каждом из вариантов препарата Старт значительно расширяется по сравнению с отдельными штаммами (табл.3,4). Наиболее активным является Старт-3. Он подавляет развитие 10 тест-культур патогенов из 16. Ему несколько уступают Старт-1 и Старт-2 - 9 и 4 патогена, соответственно. Высокий антагонистический эффект проявляется для каждого из вариантов бактериального концентрата Старт и при совместном культивировании с тест-культурами патогенов. Указанные выше свойства бактериального концентрата Старт свидетельствуют о том, что он является пробиотическим препаратом и позволяют использовать его как стартовую культуру при производстве ферментированных продуктов повышенной биологической активности, а также в лиофилизированном виде в качестве биологически активной добавки сухих пробиоз-продуктов для функционального питания. Изобретение поясняется следующими примерами. Пример 1. Получение бактериального концентрата Старт-1 для функциональных продуктов. В 100 вводопроводной воды восстанавливают 3,0 кг сухого обезжиренного молока, смесь нагревают до 55°С, устанавливают рН 7,4, вносят 15 г протосубтилина с активностью 70 ед. и выдерживают смесь в течение 2,5 ч. После гидролиза в среду выносят 0,5 кг лактозы, 0,5 кг трехзамещенного лимоннокислого натрия, 2 л кукурузного экстракта, 50 г сернокислого железа. В среде устанавливают рН 8,0 с помощью 30% раствора гидроксида натрия и стерилизуют при температуре 121 °С в течение 30 мин. Активная кислотность после стерилизации должна составлять 7,4 ед. рН. Питательную среду охлаждают до 44°С и инокулируют 6,4 л В. longum 352. Культуру выращивают при 40°С в течение 8 часов в режиме периодической нейтрализации среды водным раствором аммиака до рН 7.0. Затем вносят по 0,8 л S. termophilus 27с и S. thervophilus 36-8 и культивируют еще в течение 5 часов поддерживают рН культуральной жидкости равным 7.0. Соотношение штаммов В. longum 352, S. thermophilus 27с и 37-8 составляет 8:1:1 В конце роста охлаждают культураль-ную жидкость до 12°С, нейтрализуют до р.Н 7,0 и центрифугируют на суперцентрифуге ОТР при 15000 o6/mvih. Полученную биомассу смешивают с защитной средой в соотношении 1:1. Состав защитной среды следующий (в г/л): сахароза 100, цитрат натрия - 50, дистиллированная вода - до 1 л. Суспензию биомассы в защитной среде разливают тонким слоем высотой не более 10 мм, замораживают при -40°С и высушивают в сублимационной установке КС-30. Продолжительность сушки 20 ч до массовой доли влаги в сухом концентрате 5%. Высушенную суспензию размельчают, расфасовывают в стерильную тару и плотно закупоривают. В 1 л бактериального концентрата содержится 5-10 и 2-Ю11 КОЕ бифидо- и лактобактерий. Пример 2. Получение бактериального концентрата Старт-2. 2,1 кг сухого обезжиренного молока вносят в 75 л водопроводной воды, смесь нагревают до 55°С, устанавливают рН 7,4, вносят 12 г протосубтилина с активностью 70 ед. и выдерживают смесь в этих условиях 2,5 ч для гидролиза. После этого в среду вносят 0,375 кг лактозы, 0,375 кг трехзаме-щенного лимоннокислого натрия, 1,4 л кукурузного экстракта, 37,5 г сернокислого железа. В среде устанавливают рН 8,0 с помощью 30% раствора гидроксида натрия и стерилизуют при температуре 125°С в течение 45 мин. Активная кислотность после стерилизации должна составлять 7,4 ед. рН. Питательную среду охлаждают до 44°С и инокулируют 5,0 л суспензии В. longum 352. Культивирование проводят при температуре 40°С и рН 6,8-7,0. Через 10 часов вносят по 1,0 л инокулята S. thermophilus 66 и Т-95 и культивируют при заданном режиме еще 4 часа. Соотношение между штаммами В. longum 352, S. thermophilus 66 и Т95 составляет 5:1.1. В конце роста культуральную жидкость охлаждают до 12°.С, нейтрализуют до рН 7,0 и центрифугируют на суперцентрифуге ОТР при 15000 об/мин. Полученную биомассу смешивают с защитной средой в соотношении 1.1,5. Состав защитной среды следующий (в г/л): сахароза - 100, цитрат натрия - 50, дистиллированная вода - до 1 л. Суспензию биомассы в защитной среде разливают тонким слоем высотой 10 мм, замораживают при -40°С и высушивают в сублимационно установке КС-30. Продолжительность сушки 20 ч до массовой доли влаги в сухом концентрате 5%. Высушенную суспензию размельчают и расфасовывают в стерильную тару и плотно укупоривают. В 1 г бактериального концентрата Старт-2 содержится живых клеток бифидобактерий - 4Ί010, тepмqфильныx стрептококков - 2-1010 КОЕ. Пример 3 Получение бактериального концентрата Старт-3. Осуществляют как пример 2, за исключением того, что питательную среду инокулируют 5 л суспензии В. longum 352, через 7 часов вносят по 0,8 л инокулята S. thermophHus шт. 74 и 30 и культивируют при заданном режиме в течение 5 часов. Соотношение штаммов В, longum 352, S. thermophilus 74 и 30 составляет 6,25:1:1. В 1 г бактериального концентрата Старт-3 содержится 3-1010 живых клеток бифидобактерий и 1*1011 КОЕ термофильных стрептококков. Сравнительная характеристика заявляемого бактериального концентрата Старт и известного бактериального препарата Бифилакт представлена в табл.5. Примеры 4,5 показывают возможные варианты использования бактериального концентрата Старт в производстве функциональных продуктов. Пример 4. Использование бактериального концентрата Старт для получения ферментированного молочного продукта. 1 г бактериального концентрата Старт-2 растворяют в 1 л стерильного обезжиренного молока, содержащего 1% декстринмальтозы, тщательно перемешивают и выдерживают при 37-40°С в течение 3 часов для активизации клеток до достижения активной кислотности 36°Т. Активизированный бактериальный концентрат вносят в подготовленную для заквашивания молочную смесь из расчета 2 г бактериального концентрата на 1 τ молочной смеси. Молочную смесь с активизированным бак-концентратом тщательно перемешивают и ферментируют при 40°С до достижения титруемой кислотности 65°Т. Продолжительность ферментации составляет 8 ч. Готовый продукт перемешивают и направляют на розлив. Полученный продукт содержит не менее 1 млрд. живых клеток бифидобактерий и десятки млрд. клеток лактобактерий. Содержание холестерина в нем снижается по сравнению с исходным на 24%. Пример 5. Использование бактериального концентрата Старт-1 для получения сухого функционального продукта. В смесителе смешивают 72,0 г сахарозы и 20,0 глюкозы. Полученную смесь увлажняют раствором ячменно-солодового экстракта (5,8 г экстракта и 12,0 воды), гранулируют, затем подсушивают в сушильной установке при температуре 65°С до содержания сухих веществ 96,5%, снова гранулируют, добавляют 1,0 г бактериального концентрата •Старт-1, содержащего 5,2· 1011 живых клеток бактерий, и 1,0 г аскорбиновой кислоты. Смесь тщательно перемешивают и расфасовывают. Полученный продукт имеет вид порошка, в 1 г которого содержится 5,2-10 КОЕ пробиотических бактерий. Продукт способствует коррекции микрофлоры пищеварительного тракта и общей резистентности организма человека. Предлагаемый бактериальный концентрат Старт содержит в 1 г 10-10 живых клеток бифидобактерий В. longim 352 и молочнокислых стрептококков S. thermophilus шт. 27 и 36-8, или шт. 66 и Т95, или шт. 30 и 74. Предлагаемые три варианта бактериального концентрата характеризуются высокой биологической активностью. Использование бактериального концентрата способствует накоплению в ферментированном продукте высокой концентрации полезной микрофлоры, снижению в нем уровня холестерина и обогащению свободными аминокислотами, улучшению вкусовых качеств и консистенции. Высокая концентрация физиологически активной микрофлоры в бакконцентрате Старт позволяет его использовать для обогащения сухих пищевых основ с целью повышения функциональной активности продуктов.